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Methodenartikel

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

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DOI:

10.3791/59314

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9. April 2019

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1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Zusammenfassung

Particle tracking auf einer Videosequenz und die hinteren Analyse ihre Flugbahnen ist heutzutage ein häufiger Vorgang in vielen biologischen Studien. Mit der Analyse der Zellmembran Rezeptor-Cluster als Modell, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für dieses Bild Analyseaufgabe Fidschi (ImageJ) und Matlab Routinen zu verwenden: 1) Regionen von Interesse zu definieren und gestalten Masken angepasst auf diese Regionen; (2) die Partikel in Fluoreszenz-Mikroskopie-Videos zu verfolgen; (3) Analyse der Verbreitung und Intensität Eigenschaften der ausgewählten Stücke. Die Quantitative Analyse der die Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größe durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildverarbeitung bietet ein wertvolles Werkzeug, um Partikel Dynamik und die Folgen einer Änderung Objektiv zu bestimmen Umweltbedingungen. In diesem Artikel präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Analyse dieser Funktionen. Die beschriebene Methode hier können nicht nur Einzelmolekül-Tracking-Erkennung, aber auch automatisiert die Schätzung der lateralen Diffusion Parameter an der Zellmembran, klassifiziert den Typ der Flugbahn und ermöglicht die vollständige Analyse so überwinden die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Punktgröße in seiner gesamten Flugbahn an der Zellmembran.

Einleitung

Membranproteine in der Lipid-Bilayer eingebettet sind in kontinuierlicher Bewegung durch thermische Diffusion. Ihre Dynamik sind für Zell-Reaktionen zu regulieren wie intermolekulare Wechselwirkungen Bildung von komplexen, die variieren in der Größe von Monomeren, Oligomeren und beeinflussen die Stabilität erlauben der komplexe Signalisierung. Aufklärung der Mechanismen, die Steuerung von Proteindynamik ist somit eine neue Herausforderung in der Zellbiologie, notwendig, Transduktion Signalwege zu verstehen und unerwartete Zellfunktionen zu identifizieren.

Einige optische Methoden zu studieren diese Interaktionen in lebenden Zellen1. Unter diesen ermöglicht Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, entwickelt in den frühen 1980er Jahren die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen an oder sehr nahe der Zellmembran2. Um dynamische Parameter der Membrane Protein Trajektorien gewonnenen TIRF Daten in lebenden Zellen zu untersuchen, ist ein einzelnes Teilchen tracking-Methode (SPT) erforderlich. Obwohl mehrere Algorithmen dafür zur Verfügung stehen, verwenden wir derzeit von Jaqaman Et Al.3 , die Partikel Bewegung Heterogenität in einem dichten Partikel Feld Adresse durch die Verknüpfung von Teilchen zwischen den aufeinander folgenden Frames, die daraus resultierende Strecke verbinden Segmente in komplette Trajektorien (temporäre Teilchen verschwinden). Die Software erfasst das Teilchen zusammenführen und teilen, die sich aus der Aggregation und Dissoziation Veranstaltungen3. Die Ausgabedaten dieser Software gehört Erkennung der Partikel entlang der gesamten Flugbahn durch die Festlegung ihrer X und Y Positionen in jedem Frame.

Sobald Partikel erkannt werden, wenden wir verschiedene Algorithmen, um die kurze Spanne Diffusion-Koeffizient (D1-4)4,5zu bestimmen. Durch Anwendung der Moment Skalierung Spektrum (MSS)6,7,8 Analyse oder durch den Einbau des 'Alpha'-Wert durch Anpassung der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) auf der Kurve9klassifizieren wir auch die Partikel der Typ der Flugbahn.

Analyse der spot Intensität in Fluoreszenzbilder ist ein gemeinsames Ziel für Wissenschaftler im Bereich10,11. Der am häufigsten verwendete Algorithmus ist die so genannte Zahl und Helligkeit. Diese Methode erlaubt dennoch keine richtige Frame-by-Frame-Intensität-Erkennung in Teilchen in der mobilen Fraktion. Wir haben, so einen neuen Algorithmus, diese Teilchen Intensitäten Frame-by-Frame zu bewerten und zu bestimmen, deren Aggregatzustand erzeugt. Sobald die Koordinaten jedes Partikels mit U-Track2 Software3erkannt werden, definieren wir ihre Intensität in jedem Frame über die gesamte Flugbahn, auch unter Berücksichtigung der Hintergrund der Zelle in jedem Frame. Diese Software bietet verschiedene Möglichkeiten, die vor Ort Intensität und der Hintergrund der Zelle bestimmen und mit bekannten Monomeren und dimeres Proteine als Referenzen, die ungefähre Anzahl der Proteine in der Partikel erkannt (Clustergröße) berechnet.

In diesem Artikel beschreiben wir eine sorgfältige Anleitung um diese drei Schritte ausführen: 1) Erkennung und Verfolgung einzelner Partikel entlang ein Video von Fluoreszenz-Mikroskopie mit U-Track; (2) Analyse der momentanen Diffusionskoeffizienten (D1-4) von diesen Teilchen und die Art der Bewegung (geschlossenen, frei oder gerichtet) Partikel mit lange Flugbahnen von MSS; (3) Messung der vor Ort Intensität entlang der Video korrigiert, indem die geschätzten Hintergrundfluoreszenz für jeden Fleck. Dadurch können Cluster Größe Schätzung und Ermittlung von Immunofluoreszenz-Schritte.

Die Verwendung dieses Protokolls erfordert keine spezielle Fähigkeiten und kann in jedem Labor mit Zellkulturen durchgeführt werden, fließen Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen. Das Protokoll verwendet ImageJ oder Fidschi (eine Verteilung von ImageJ-12), U-Track3und einige Ad-Hoc gemacht-Routinen (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-Track und ad-hoc-Routinen Überfahren von Matlab, die in jedem kompatiblen Computer installieren kann.

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Protokoll

1. Vorbereitung von biologischen Proben

  1. Jurkat Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % FCS, NaPyr und L-Glutamin (komplette RPMI). Electroporate Jurkat-Zellen (20 x 106 Zellen/400 µL von RPMI 1640 mit 10 % FCS) mit einem Monomeren GFP gekennzeichnet Chemokin-Rezeptor Vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) ermöglichen die Erkennung mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
    Hinweis: Es ist möglich, andere Monomeren fluoreszierende Proteine wie mCherry, mScarlet, etc. zu verwenden.
  2. 24 h nach Transfektion analysieren Zellen im Durchflusszytometer Zellviabilität und CXCR4-AcGFP Ausdruck bestimmen.
  3. Wählen Sie Zellen mit dem Ausdruck CXCR4-AcGFP niedrige durch Zellsortierung GFPgeringe positive Zellen (Abbildung 1), wie geringe Expression des Rezeptors transfizierten in TIRFM Experimente erforderlich ist, um Einzelkorn-Tracking für die Verfolgung einzelner zu gewährleisten Trajektorien9.
  4. Die Anzahl der Rezeptoren der Zelloberfläche zu quantifizieren.
    Hinweis: Als ein Beispiel13, ~ 8.500-22.000 AcGFP beschriftet Rezeptoren/Zelle, entsprechen Sie ~ 2-4,5 Partikel/μm2.
  5. Aufschwemmen Sie sortierte Zellen in komplette RPMI und inkubieren Sie für mindestens 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2. Zentrifugieren Sie Zellen (300 X g, 5 min), und Nukleinsäuretablette sie in TIRF Puffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2 % FCS, pH 7,3).
    1. Platte auf 35 mm Glasboden Microwell Gerichte (2-3 x 105 Zelle/Gericht) ummantelt mit Fibronektin (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) das Vorhandensein oder Fehlen der entsprechenden Liganden (z. B. CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Inkubieren Sie Zellen (20 min bei 37 ° C, 5 % CO2) vor der Bildaufnahme.
  6. Experimente mit einem TIRF-Mikroskop, ausgestattet mit einer EM-CCD-Kamera, ein 100 x Ölimmersion Ziel (HCX PL APO 100 X / 1,46 NA) und einem 488 nm Diodenlaser. Das Mikroskop ermöglicht Kontrolle der Temperatur und Inkubation mit CO2. Suchen Sie und konzentrieren Sie sich Zellen mit grob- und Fokusknöpfe, mit Hellfeld, um Immunofluoreszenz Auswirkungen zu minimieren. Verwenden Sie für feine Fokus-Einstellung im TIRF-Modus, eine niedrige Laserintensität, nicht ausreichend für einzelne Partikeldetektoren oder Immunofluoreszenz Effekte (5 % Laserleistung, 28 Wμ) induzieren.
  7. Erwerben Sie Filme (Bildsequenzen) von ca. 50 s das Zeitintervall zwischen den Frames zu minimieren. Durchdringung der evaneszenten Feldes sollte 70-90 nm Tiefe. Speichern Sie die erworbenen Filme für jede experimentelle Bedingung als ".lif" (video.lif).
    Hinweis: Filme im beschriebenen Beispiel mit 49 % am Laserleistung erworben wurden (2 mW) mit einer Belichtungszeit von 90 ms und ein Zeitintervall von 98 ms für 49 s (500 Bilder). Durchdringung der ausgewählten evaneszenten Welle war 90 nm.

2. Auswahl von Bildern und Erstellen von Masken

  1. Für jede Versuchsbedingung (video.lif) Erstellen eines neuen Ordners (VideoName), das verschiedene Ordner für jede Serie enthalten muss. Jeder Ordner enthält einen Ordner "VideoSeq" für die Videobilder und einen Ordner "Ergebnisse" für die Ergebnisse der Analyse. Stellen Sie sicher, dass die Dateistruktur in diesem Moment die folgende ist:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/VideoSeq
    VideoName/Series1/Ergebnisse
    Hinweis: Vom Mikroskop werden verschiedene .lif Dateien mit mehreren Videos für jede Behandlung Zustand (d. h. FN, FN + SDF) erzielt. "video.lif" entspricht die input.lif video-Datei mit allen TIRF Filme Akquisitionen (Serie) unter dem Mikroskop durchgeführt. "VideoSeq" Ordner enthält die 500 Frames des Films, die wir analysieren. Die "Ergebnisse"-Ordner enthält alle Dateien, die aus der Analyse durchgeführt. Exakte Nomenklatur und Lokalisierung von den verschiedenen Ordnern sind unerlässlich für die korrekte Funktion der Algorithmen. Namen in Fettschrift in der obigen Liste sind festgelegt (d. h., sie haben auf diese Weise aufgerufen werden, denn das sind die Namen von den Skripts gesucht). Namen nicht in Fett können ändern sich entsprechend der Versuch durchgeführt.
  2. Öffnen Sie das TIRFM Video (.lif Datei) mit Fidschi oder ImageJ per Drag & Drop die Datei auf die Fidschi-Menüleiste und klicken Sie auf OK um die Lif-Datei mit BioFormats (ergänzende Abbildung1) zu importieren.
  3. Wählen Sie die Serie zu verarbeiten und klicken Sie auf "OK" (zusätzliche Abbildung 2A). Um eine Maske für die Analyse des Videos zu entwerfen, auch die Einfuhr von einem Mehrkanalbild mit verschiedenen Chromophore (im Beispiel Serie 1 ist das Multichannel-Bild und Serie 2 das entsprechende Video). Das Video (und die Mehrkanalbild) sollte als eine ImageJ-Stapel öffnen. Im Beispiel (Supplemental Abb. 2 b) das Bild auf der linken Seite und das Video ist auf der rechten Seite.
    Hinweis: Wenn Erstellung einer Maske für das Video nicht benötigt wird, fahren Sie mit Schritt 2.5.
  4. Erstellen Sie eine Maske. Erstellen Sie ein einzelnes Bild mit den Kanälen nützlich für das Design der Maske. In diesem Fall sind die interessante Kanäle rot, grün und grau.
    1. Die Kanäle von Mehrkanalbild (ergänzende Abbildung 3A) aufgeteilt: Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und klicken Sie auf Farbe | Kanäle trennen. Die verschiedenen Kanäle zeigen als Einzelbilder (ergänzende Abbildung 3 b).
    2. Verschmelzen wieder die drei Kanäle in einem einzigen Bild (ergänzende Abbildung 4A): Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und wählen Sie Farbe | Kanäle verbinden. Wählen Sie die entsprechenden Kanäle und drücken Sie "OK" (zusätzliche Abbildung 4 b). Ein neues Bild nicht gestapelt werden generiert (ergänzende Abbildung 4).
    3. Synchronisieren Sie die beiden Fenster mit dem Synchronisieren Windows -Werkzeug (ergänzende Abbildung 5A): Wählen Sie analysieren in der Bar Menü | Werkzeuge | Synchronisieren Windows. Ein neues Fenster mit der Synchronisation Bild Möglichkeiten erscheint (ergänzende Abbildung 5 b).
    4. Mit den beiden Fenstern synchronisiert (nur das Video ist keine Mehrkanalbild verbunden sind) kann die gleiche Region in beiden Fenstern beschnitten werden. Zeichnen Sie die Region von Interesse mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug ImageJ schwebenden Menüs. Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und wählen Sie Ernte (ergänzende Abbildung 6A). Die beiden abgeschnittenen Bilder zeigen individuell (ergänzende Abbildung 6 b).
    5. Unsynchronize Sie beide Fenster (ergänzende Abbildung 6 b) durch Drücken der Unsynchronize alle im Sync Windows Manager.
  5. Wenn eine Maske nicht wie in Schritt 2.4 erstellt wurde, zeichnen Sie die Region von Interesse mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug ImageJ schwebenden Menüs.
  6. Speichern Sie das Video als eine Bildsequenz in das Verzeichnis VideoSeq unter dem entsprechenden video-Verzeichnis (ergänzende Abbildung 7A): Wählen Sie die Datei in der Bar-Menü und klicken Sie auf als speichern | Bild-Sequenz... benennen Sie die Beschriftungen für die video-Sequenz als video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (ergänzende Abbildung 7 b): in das Feld Name benennen Sie als video und klicken Sie auf "OK". Die Sequenz muss allein in seinem Verzeichnis erfolgreich von U-Track verwendet werden.
    Hinweis: Wenn nicht entwerfen eine Maske für das Video, gehen Sie zu Schritt 2,8.
  7. Entwerfen Sie eine Maske. Wählen Sie das Mehrkanal-Bild und öffnen Sie die Segmentierung Editor Plugin (ergänzende Abbildung 8A): Wählen Sie Plugins in der Bar-Menü und wählen Sie Segmentierung | Segmentierung Editor. Fügen Sie hinzu und benennen Sie die Beschriftungen der Segmentierung nach Bedarf mit der rechten Maustaste auf den Etiketten der Segmentierung Editor (ergänzende Abbildung 8 b, C).
    1. Wählen Sie die entsprechende Auswahl-Werkzeug in ImageJ Schwebendes Menü (hier freihändig verwenden), wählen Sie eine Beschriftung (grün) und entwerfen zunächst die Regionen in äußerster Maske (ergänzende Abbildung 9A). Nachdem gestaltet, wird das + drücken Sie Option "Auswahl" der Verbundfenster und die ausgewählte Maske auf den Betrachter (ergänzende Abbildung 9A) angezeigt. Wiederholen Sie diesen Schritt mit folgenden Labels (innen in rot) (ergänzende Abbildung 9 b).
      Hinweis: Nachdem Sie die Maske für die grünen und Interieur Etiketten entworfen, wird die äußere Maske der Rest des Bildes einnehmen.
    2. Masken werden als Bereiche 0, 1, 2 im Bild codiert... entsprechend der Reihenfolge der Bezeichnungen in der RGB-Etiketten-Fenster. Wenn alle Masken für die verschiedenen Etiketten entworfen sind, speichern Sie die Maske mit den gleichen Dateinamen wie das Video mit dem Namen mask.tif (ergänzende Abbildung 9): Wählen Sie die Datei in der Bar-Menü und wählen Sie als speichern | TIFF....
      Hinweis: Die ausgewählte Masken werden in die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und Einteilung der Bahnen (siehe Punkt 4.2) eingesetzt werden.
  8. Überprüfen Sie, dass die Dateistruktur in diesem Moment die folgende ist:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/Ergebnisse
    Hinweis: Die mask.tif ist ein Bild mit der Maske wie Schritte 2.4 und 2.7 konzipiert. Die video*.tiff ist das Video, wie in Schritt 2.6 gespeichert. Wie oben beschrieben, die Namen in Fettdruck in die obigen Liste sind fest vorgegeben, d. h., sie müssen auf diese Weise bezeichnen, denn das sind die Namen von den Skripts gesucht. Namen nicht in Fett können ändern sich entsprechend der Versuch durchgeführt.

3. tracking die Partikel

  1. Verfolgen Sie alle Partikel, die in den ausgewählten Videos mit U-Track zu sehen.
  2. Öffnen Sie Matlab und U-Track-Verzeichnis auf den Pfad mithilfe Set Path hinzufügen | Fügen Sie mit Unterordnern Option im Menü. Speichern Sie den Pfad, sodass in Zukunft Hinrichtungen von Matlab U-Track ist auf dem Weg. Diese Einstellung muss nur einmal durchgeführt werden.
  3. Ändern Sie das Arbeitsverzeichnis in das Verzeichnis mit der Serie analysiert werden. U-Track durch Eingabe in die Konsole (ergänzende Abbildung 10) MovieSelectorGUI aufrufen, und drücken Sie die Eingabetaste. Die Film-Auswahl -Fenster wird geöffnet (ergänzende Abbildung 11A).
  4. Drücken Sie auf die Schaltfläche neu Film und der Film Edition Fenster erscheint (ergänzende Abbildung 11 b).
  5. Drücken Sie auf Kanal hinzufügen , wählen das Verzeichnis mit dem Video (VideoName/Series1/Video) und füllen die Film-Informationen-Parameter. Legen Sie das Ausgabeverzeichnis für die Ergebnisse von U-Track auf Ergebnisse (VideoName/Series1/Ergebnisse).
    Hinweis: Das Mikroskop und die Übernahme-Bedingungen können der Film Informationsparameter entnommen werden.
  6. Drücken Sie auf die erweiterten Kanaleinstellungen und füllen Sie die Parameter in Bezug auf den Erwerb. Suchen Sie die Werte der Parameter in das Beispiel (ergänzende Abbildung 11).
  7. Drücken Sie im Fenster Erweiterte Einstellungen Speichern und Speichern im Fenster Film Edition . Das Programm fragt nach Bestätigung des Schreibens der Datei namens movieData.mat im Verzeichnis Ergebnisse . Bestätigen.
  8. Nach dem Erstellen des Films, drücken Sie auf weiter im Fenster Film Auswahl. U-Bahn fragt über den Typ des Objekts analysiert werden. Wählen Sie Single-Partikel (ergänzende Abbildung 12). Das Control Panel Fenster erscheint (Supplemental Abb. 13A).
    1. Wählen Sie den ersten Schritt Schritt 1: Erkennung und drücken Sie auf Einstellung. Die Einstellung "glockenförmig" Mischung-Modell-Montage Fenster erscheint (ergänzende Abbildung 13 b). Im Beispiel ist "Alpha-Wert für den Vergleich mit lokalen Hintergrund" 0,001 und "Rolling-Fenster Zeit durchschnittlich" auf 3 (ergänzende Abbildung 13 b) festgelegt.
    2. Drücken Sie auf Apply im Fenster " Einstellungen" glockenförmig "Mischung-Modell passend " und in der Systemsteuerung Ausführen . Mit der Konfiguration in ergänzenden Abbildung 13läuft nur die Detektion . Dieser Schritt dauert ein paar Minuten (2-5). Überprüfen Sie die Ergebnisse durch Drücken der Schaltfläche " Ergebnis " von Schritt 1 (Erkennung, ergänzende Abbildung 14).
      Hinweis: Wie oben dargestellt, zeigt der Film rote Kreise auf die detektierten Partikel. Wenn kein roter Kreis angezeigt wird, hat diesen Schritt nicht richtig funktioniert.
  9. Führen Sie die Identifizierung von Spuren, d. h. Zusammenführung der Partikel, die im vorherigen Schritt in Tracks, die sich über mehrere Frames erkannt. Dies ist die Schritt2: Tracking- von U-Track, dessen Einstellungen werden, wie in Zusätzliche Abbildung 15A-Cgezeigt definiert müssen. Schritt2 Kosten Funktionseinstellungen für Verknüpfung von Frame zu Frame und Lücke schließen, Verschmelzung und Spaltung im Beispiel zusätzliche Abbildung 15 b und C, bzw. entnehmen Sie bitte.
  10. Nach dem Einstellen der Parameter für Schritt2, drücken Sie in der Systemsteuerung ausgeführt und nur Schritt2 läuft (ergänzende Abbildung 16).
  11. Durchzuführen Sie Track-Analyse, Schritt 3. Definieren Sie die Einstellungen wie in zusätzliche Abbildung 17 (rechte Abbildung) dargestellt. Drücken Sie anwenden im Bereich der Einstellung-Bewegungsanalyse und im Control Panel-U-Track laufen . Dieser Schritt dauert wenige Sekunden.
  12. Überprüfen Sie mit der Schaltfläche " Ergebnis " von Schritt 3, dass der Prozess alle Titel korrekt identifiziert hat. Dazu klicken Sie auf Show-Track-Nummer des Fensters Filmoptionen , und überprüfen Sie Frame für Frame, dass jeder Track wurde richtig erkannt (ergänzende Abbildung 18). Manuell kommentieren Sie diese Teilchen, die nicht wahr sind.
    Hinweis: Wenn diese manuelle Auswahl nicht erfolgt ist, kann eine schwächere automatische Auswahl später durchgeführt werden, wenn die Diffusionskoeffizienten berechnet wird (siehe Schritt 4).

4. Berechnung des Diffusionskoeffizienten und Klassifizierung von Trajektorien

  1. Achten Sie darauf, dass die Skripte aus dem Verzeichnis des Videos analysiert (im Beispiel VideoName/Serie1) aufgerufen werden.
  2. Lesen Sie die Bahnen zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten durch die Ausgabe in der Matlab Konsole den Befehl: trajectories=readTrajectories(0.1), wo 0,1 die Zeit in Sekunden zwischen zwei aufeinander folgenden Frames (Zeitintervall ist, gezeigt im Bedienfeld "Film" Informationen, ergänzende Abbildung 11 b).
  3. Schließen Sie Trajektorien entsprechend nicht falsch identifizierten Flecken/Flugbahnen aus. Geben Sie eine Liste der Orte, auszuschließen. Zum Beispiel um die Plätze 4, 5 und 28 auszuschließen, geben Sie: Bahnen = ReadTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Berechnen Sie die momentane Diffusionskoeffizienten für jeden von den Spuren dieser Zelle. In diesem Fall berechnen die Diffusionskoeffizienten für eine zeitliche Verzögerung = 4, D-1-4genannt. Dafür, in der Matlab-Konsole den Befehl ausführen: D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') wo Bahnen sind die Bahnen, die in Schritt 3, 113.88e-3 ist die Pixelgröße der erworbenen Bilder in Mikron, 0,0015 ist eine Obergrenze für die Diffusionskoeffizienten von unbeweglichen Teilchen gemessen in µm2/s und "Alpha" ist das angepasste Modell, wie nachfolgend erläutert.
    Hinweis: Wenn ein schneller Kamera und müssen mit mehr Frames zur Berechnung des Parameters Verbreitung erhöhen sie die z. B. auf 20, von D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', '', 20). Die String-Parameter vor 20, im obigen Beispiel '', das Suffix hinzugefügt, um die Ausgabedateien. Das Suffix kann verwendet werden, um verschiedene Analysen zu unterscheiden.
  5. Passen Sie die MSD mit einer anderen Funktion durch Aufrufen der CalculateDiffusion-Funktion wieder mit einem unterschiedlichen Montage-Modus ("beschränkt", "frei" oder "gerichtet"). In diesem Beispiel beschränkt: D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015 "beschränkt").
  6. Erhalten Sie die passenden Ergebnisse für das gerichtete Modell wie in zusätzliche Abbildung 20dargestellt.
  7. Zerlegen Sie die Bahnen in kurzen und langen Bahnen. Verwenden Sie den Befehl: [ShortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) wo 50 ist die minimale Länge im Rahmen einer Flugbahn lange (im gezeigten Beispiel) berücksichtigt werden.
  8. Kurze Flugbahnen mit dem gleichen passende Verfahren in Schritt 4.3 beschriebenen zu studieren: D = CalculateDiffusion (ShortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, "Regie", "Short"). Analysieren Sie kurze und anomale Flugbahnen mit dem Befehl: D = CalculateDiffusion (ShortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, "alpha", "Short").
  9. Analysieren Sie lange Bahnen um die Art der Bewegung durch ihre Moment Skalierung Spektrum (MSS)7zu klassifizieren. Der Befehl: TrajectoriesClassification = ClassifyLongTrajectories (LongTrajectories, 113.88e-3,0.0015, "Long") zeigt die Analyse in Bildschirm und erzeugt eine Datei namens TrajectoryClassification < Suffix > .txt der Verzeichnis Results\TrackingPackage\tracks.

5. Berechnung der Cluster Ssize durch die Teilchendichte

Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Skripte aus dem Verzeichnis des Videos analysiert (in diesem Beispiel gezeigt, VideoName/Serie1) aufgerufen werden.

  1. Analysieren Sie die Intensität der einzelnen Partikel entlang ihrer Flugbahn. Dafür, das Skript aufrufen, indem Sie in der Matlab-Konsole eingeben: AnalyzeSpotIntensities, die als akzeptiert Eingabe die Flugbahnen von U-Track im ersten Abschnitt berechnet. In seiner einfachsten Form, rufen Sie einfach das Skript ohne irgendein Argument aus dem Verzeichnis des Videos (im Beispiel gezeigt, VideoName/Series1) analysierten analyzeSpotIntensities(). Konfigurieren Sie dieses grundlegende Verhalten in vielfältiger Weise durch die Bereitstellung von Argumente an das Skript wie in: AnalyzeSpotIntensities ("Arg1´, Wert1, ' Arg2´, Value2,...). Stichhaltige Argumente mit ihren entsprechenden Variablen Werten ("ArgN´, ValueN) aufgeführt sind.
    1. ("SpotRadius´, 1)
      Analysieren der Fluoreszenzintensität mit SpotRadius von 1 Pixel (standardmäßig), das entspricht einen Patch der Größe 3 x 3 zentriert an der Stelle ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Hinweis: Für einen Patch von 5 x 5 an der Stelle zentriert, wählen Sie eine SpotRadius von 2, usw..
    2. ("OnlyInitialTrajectories´, 1)
      Wenn dieses Argument (wahr, Wert 1) gegeben ist, analysieren Sie nur die Bahnen, die in den ersten Frame des Videos zu beginnen. Dies ist sinnvoll, Kontrolle Bilder (standardmäßig 0, false) zu analysieren.
    3. ("TrackTrajectory´, 0)
      Wenn dieses Argument auf 0 (False) gesetzt ist, dann halten Sie die Koordinate des Punktes in seinem ersten Rahmen für alle Frames (Dies ist nützlich für immobile Spots). Wenn das Argument (standardmäßig 1, true) auf 1 festgelegt ist, wird dann vor Ort verfolgt entlang video Folgendes die Koordinaten berechnet von U-Track.
    4. ("ExcludeTrajectories´, [4,5,28])
      Auch die Flugbahn an diese Trajektorien im Schritt 4.3 (im Beispiel 4, 5, 28) ausgeschlossen.
    5. ("ExtendTrajectory ´, 1)
      Wenn dieses Argument auf 1 (True) gesetzt ist, dann analysieren Sie die Intensität in den Patch, um das Ende des Videos (auch wenn die Bahn früher stoppt). Die Koordinate des Punktes ist die letzte Koordinate in der Bahn (wenn TrackTrajectory wahr ist) oder die erste Koordinate in der Bahn (wenn TrackTrajectory falsch ist). Dieses Argument ist falsch (0) standardmäßig.
    6. ("SubtractBackground´, 1)
      Wenn dieser Parameter gesetzt ist, gemessen, dann richtig die rohe Fluoreszenz an jedem Ort die Schätzung der Hintergrundfluoreszenz für diesen Platz (siehe unten). Dieses Argument ist wahr (1), standardmäßig.
    7. ("MeanLength´, Frame-Nummer)
      Wenn dieser Parameter gesetzt ist, wird der mittlere Intensität-Spot in der angegebenen Länge gemessen. Set 'MeanLength', 20, die mittlere Platz Intensität an die ersten 20 Frames zu messen. Wenn das Argument nicht festgelegt ist, wird die Stelle Intensität auf die ganze Bahn (standardmäßig in voller Länge) berechnet.
    8. ("ShowIntensityProfiles´, 1)
      Setzen Sie diesen Parameter als 1 (standardmäßig 0, false), um die Intensität Profil entlang der verschiedenen Frames sowie ihren Hintergrund zu zeichnen.
      Hinweis: Diese Grundstücke sind sehr nützlich für Immunofluoreszenz zu identifizieren, wie in der ergänzenden Abbildung 21dargestellt. Für jeden Pfad analysiert die Routine automatisch wenn es möglich ist, dass Immunofluoreszenz stattgefunden hat. Dies geschieht durch den Vergleich der Intensitätswerte mit ein Student t in den vor- und Nachnamen N-Frames auf dem Weg. Standardmäßig ist N 10, aber dieser Wert kann geändert werden, durch das Argument "Nbleach´.
    9. ("BackgroundMethod´, Wert)
      Setzen Sie diesen Parameter, um den Hintergrund von jedem Ort zu bestimmen. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen kann, und die man verwenden ausgewählte Wandel der "Wert":
      1. ("BackgroundMethod´, 0)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für das komplette Video manuell zu identifizieren. 8 Punkte in den ersten Frame des Videos wählen lassen. Ein Patch um diese Punkte wird entlang der ganzen Videos analysiert und das 95 %-Quantil diese Intensitäten wird als die Hintergrundintensität für alle Spots gewählt.
      2. ("BackgroundMethod´, 1)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für die einzelnen Frames manuell zu identifizieren. Wählen Sie 8 Punkte für jeden Punkt und jedes Frame. Dies ist eine Zeit raubende Aufgabe, aber es gibt eine Menge Kontrolle für dem Benutzer. Das 95 %-Quantil der Intensitäten in diese Patches wird als die Hintergrundintensität für diese Stelle in diesem Rahmen gewählt.
      3. ("BackgroundMethod´, 2)
        Verwendet diesen Wert, um den Hintergrund von jedem Fleck berechnen von 8 Punkten befindet sich in einem Kreis um die Stelle mit einem Radius gesteuert durch das Argument geschätzt "BackgroundRadius´ (standardmäßig 4 * SpotRadius).
      4. ("BackgroundMethod´, 3)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für jeden Frame berechnen, indem Sie zuerst die Zelle in dem Video suchen und dann analysieren die Intensitäten der Zelle in jedem Frame (ergänzende Abbildung 22).
        Hinweis: Der Hintergrund wird als Grauwert auf einen bestimmten Quantil dieser Distribution gewählt (standardmäßig 0,5 (= 50 %), obwohl dieser Parameter kann, durch das Argument gesteuert werden "BackgroundPercentile´, dieser Wert kann höher eingestellt werden, zum Beispiel 0,9 (= 90 %) Wenn die meisten der Zelle als Hintergrund zu betrachten wollen. Um bei der Identifizierung der Zelle helfen, anzugeben, die die maximale Hintergrundwert entlang den Rahmen mit dem Argument erwartet "MaxBackground´ (zum Beispiel in allen analysierten Videos, den Hintergrundwert geht normalerweise nie über 6000)13. Standardmäßig ist diese Option festgelegt auf 0, was bedeutet, dass diese Hilfe nicht standardmäßig verwendet wird. Sehen, welche die Zelle-Erkennung und ausgewählte für die Hintergrund-Schätzung durch setzen das Argument Bereich ' ShowImages´, 1 (Haltestelle der Ausführung jederzeit durch Drücken von Strg-C).
  2. Informieren Sie die Verbreitung und Intensität für die Bahnen, die in den Schritten 4 und 5.1, jeweils mit berechnet (gatherDiffusion.AndIntensity). Informieren Sie sich nur die Verbreitung und Intensität für kurze Bahnen. Dazu verwenden die Suffixe in Schritt 4.7 und Art verwendet: GatherDiffusionAndIntensity ('Short´) wo ' Short´ ist das Suffix in Schritt 4.7 verwendet.
  3. Sammeln die Moment-Spektrum-Skalierung und die Intensität Informationby Typisierung: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') wo 'Long' wird das Suffix für Schritt 4.7. Eine Übersicht über alle Dateien, die generiert mithilfe dieses Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt.

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Ergebnisse

Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die automatische Verfolgung von Fluoreszenz-Mikroskopie-Filme und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften detektierten Partikel. Zunächst werden Zellen mit dem Eindringmittel gekoppelt Protein zu verfolgenden transfiziert. Die angemessene Höhe der Rezeptoren präsentiert auf der Zelloberfläche, die ermöglicht, dass SPT durch Zelle sortieren (Abbildung 1) gewonnen wird. Markierten Zellen werden von TIRF-Mikroskopi...

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Diskussion

Das beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen, auch ohne Vorkenntnisse, die Arbeit mit Matlab. Matlab-Routinen erfordern jedoch extrem Genauigkeit mit der Nomenklatur der verschiedenen Befehle und die Lokalisation der verschiedenen Ordner das Programm angestellt. In der Überwachungsdatenbank Analyse-Routine (Schritt 3), mehrere Parameter können geändert werden. Das Fenster "Einstellung passend Gauß-Mischung-Modell" (Schritt 3,8) steuert, wie U-Track einzelne Partikel auf dem Video zu erkennen. Dies geschieht durch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind dankbar, dass Carlo Manzo und Maria García Parajo für ihre Hilfe und Quell-Code der Diffusion Koeffizient Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (SAF 2017-82940-R) und die RETICS-Programm des Instituto de Salud Carlos III (RD12/0009/009 und RD16/0012/0006; RIER). LMM und JV unterstützt das COMFUTURO-Programm von der Fundación General CSIC.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Humane Jurkat-ZellenATCCCRL-10915Humane T-Zelllinie. Jeder andere Zelltyp kann mit dieser Software analysiert werden
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Verschiedene fluoreszierende Proteine können mit diesem routinemäßigen
Gene Pulse X Cell ElektroporatorBioRad Wir verwenden 280 V, 975 mF, für Jurkat-Zellen. Verwenden Sie die Transfektionsmethode, die am besten in Ihren Händen arbeitet.
Cytomics FC 500 Durchflusszytometer Beckman Coulter
MoFlo Astrios Zellsortierer Beckman CoulterJe nach Grad der Transfektion ist eine Zellsortierung möglicherweise nicht erforderlich. Sie können auch Zellen mit stabiler Expression angemessener Spiegel des interessierenden Rezeptors verwenden.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Wird zur Quantifizierung der Anzahl der Rezeptoren auf der Zelloberfläche verwendet.
Mikrotiterschüsseln mit GlasbodenMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Humanes Fibronektin aus PlasmaSigma-AldrichF0895
Rekombinantes humanes CXCL12PeproTech300928A
Invertierte Leica AM TIRFLeica
EM-CCD-KameraAndorDU 885-CSO-#10-VP
MATLABThe MathWorks, Natick, MA
U-Track2 SoftwareDanuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 SoftwareMatlab-Werkzeug.  Laden Sie zur Installation .zip Datei von der Webseite (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) herunter und entpacken Sie die Datei in einem Verzeichnis Ihrer Wahl
GraphPad PrismGraphPad-Software
verfolgt und analysiert werden.

Referenzen

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Einzelmolekül-TrackingPartikel-TrackingDiffusionsanalyseClustergrößenanalyseRegion of InterestMaskendesignFiji ImageJMATLAB-Routinen
Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie
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