Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Abstract

Particle tracking auf einer Videosequenz und die hinteren Analyse ihre Flugbahnen ist heutzutage ein häufiger Vorgang in vielen biologischen Studien. Mit der Analyse der Zellmembran Rezeptor-Cluster als Modell, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für dieses Bild Analyseaufgabe Fidschi (ImageJ) und Matlab Routinen zu verwenden: 1) Regionen von Interesse zu definieren und gestalten Masken angepasst auf diese Regionen; (2) die Partikel in Fluoreszenz-Mikroskopie-Videos zu verfolgen; (3) Analyse der Verbreitung und Intensität Eigenschaften der ausgewählten Stücke. Die Quantitative Analyse der die Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größe durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildverarbeitung bietet ein wertvolles Werkzeug, um Partikel Dynamik und die Folgen einer Änderung Objektiv zu bestimmen Umweltbedingungen. In diesem Artikel präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Analyse dieser Funktionen. Die beschriebene Methode hier können nicht nur Einzelmolekül-Tracking-Erkennung, aber auch automatisiert die Schätzung der lateralen Diffusion Parameter an der Zellmembran, klassifiziert den Typ der Flugbahn und ermöglicht die vollständige Analyse so überwinden die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Punktgröße in seiner gesamten Flugbahn an der Zellmembran.

Introduction

Membranproteine in der Lipid-Bilayer eingebettet sind in kontinuierlicher Bewegung durch thermische Diffusion. Ihre Dynamik sind für Zell-Reaktionen zu regulieren wie intermolekulare Wechselwirkungen Bildung von komplexen, die variieren in der Größe von Monomeren, Oligomeren und beeinflussen die Stabilität erlauben der komplexe Signalisierung. Aufklärung der Mechanismen, die Steuerung von Proteindynamik ist somit eine neue Herausforderung in der Zellbiologie, notwendig, Transduktion Signalwege zu verstehen und unerwartete Zellfunktionen zu identifizieren.

Einige optische Methoden zu studieren diese Interaktionen in lebenden Zellen

Protocol

1. Vorbereitung von biologischen Proben

1. Jurkat Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % FCS, NaPyr und L-Glutamin (komplette RPMI). Electroporate Jurkat-Zellen (20 x 10⁶ Zellen/400 µL von RPMI 1640 mit 10 % FCS) mit einem Monomeren GFP gekennzeichnet Chemokin-Rezeptor Vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) ermöglichen die Erkennung mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
   Hinweis: Es ist möglich, andere Monomeren fluoreszierende Proteine wie mCherry, mScarlet, etc. zu verwenden.
2. 24 h nach Transfektion analysieren Zellen im Durchflusszytometer Zellviabilität und CXCR4-AcGFP Ausdruck bestimmen.
3. Wählen Sie Zellen mit dem Ausdruck ....

Results

Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die automatische Verfolgung von Fluoreszenz-Mikroskopie-Filme und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften detektierten Partikel. Zunächst werden Zellen mit dem Eindringmittel gekoppelt Protein zu verfolgenden transfiziert. Die angemessene Höhe der Rezeptoren präsentiert auf der Zelloberfläche, die ermöglicht, dass SPT durch Zelle sortieren (Abbildung 1) gewonnen wird. Markierten Zellen werden von TIRF-Mikroskopi.......

Discussion

Das beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen, auch ohne Vorkenntnisse, die Arbeit mit Matlab. Matlab-Routinen erfordern jedoch extrem Genauigkeit mit der Nomenklatur der verschiedenen Befehle und die Lokalisation der verschiedenen Ordner das Programm angestellt. In der Überwachungsdatenbank Analyse-Routine (Schritt 3), mehrere Parameter können geändert werden. Das Fenster "Einstellung passend Gauß-Mischung-Modell" (Schritt 3,8) steuert, wie U-Track einzelne Partikel auf dem Video zu erkennen. Dies geschieht durch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Humane Jurkat-Zellen	ATCC	CRL-10915	Humane T-Zelllinie. Jeder andere Zelltyp kann mit dieser Software analysiert werden
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Verschiedene fluoreszierende Proteine können mit diesem routinemäßigen
Gene Pulse X Cell Elektroporator	BioRad		Wir verwenden 280 V, 975 mF, für Jurkat-Zellen. Verwenden Sie die Transfektionsmethode, die am besten in Ihren Händen arbeitet.
Cytomics FC 500 Durchflusszytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Zellsortierer	Beckman Coulter		Je nach Grad der Transfektion ist eine Zellsortierung möglicherweise nicht erforderlich. Sie können auch Zellen mit stabiler Expression angemessener Spiegel des interessierenden Rezeptors verwenden.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Wird zur Quantifizierung der Anzahl der Rezeptoren auf der Zelloberfläche verwendet.
Mikrotiterschüsseln mit Glasboden	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Humanes Fibronektin aus Plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Rekombinantes humanes CXCL12	PeproTech	300928A
Invertierte Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD-Kamera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 Software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 Software			Matlab-Werkzeug.  Laden Sie zur Installation .zip Datei von der Webseite (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) herunter und entpacken Sie die Datei in einem Verzeichnis Ihrer Wahl
GraphPad Prism	GraphPad-Software