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Methodenartikel

Präferenzbewertung der Weißrücken-Zikade, die sich von Reis ernährt

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DOI:

10.3791/59323

⸱

23. Mai 2020

 ,  , 
1Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine einfache und praktikable Methode vor, um die Resistenz gegen Weißrückenzikaden zu bewerten, die sich unter Laborbedingungen von Reis ernähren. Die Verbesserung der Strategien und die Zusammensetzung der aktuellen Methode zur Identifizierung der Resistenz gegen Weißrücken- und Braunrückenzikaden werden diskutiert.

Zusammenfassung

Die Nutzung der keimfähigen Ressourcen von Reis und der damit verbundenen Gene ist die Hauptanforderung für die Züchtung insektenresistenter Sorten, aber die Genauigkeit der Identifizierung insektenresistenter Phänotypen von Reis ist eine große Schwierigkeit. Es ist dringend notwendig, eine neue Methode zu entwickeln oder bestehende Methoden zu verbessern, um Reis auf Insektenresistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und praktikable Methode, um die Resistenz von Reis gegen die Weißrückenzikade (WBPH), Sogatella furcifera, im Labor zu beurteilen. Die Präferenz adulter WBPHs, die sich von reifenden Reispflanzen ernähren oder dort leben, wird kontinuierlich durch paarweisen Vergleich analysiert. Die dynamischen Veränderungen der WBPHs an Reispflanzen werden als Index zur Resistenzidentifikation erfasst und verglichen. Die derzeitige Methode ist einfach bedienbar und leicht beobachtbar und hat einen kurzen Zyklus. Die Anwendung dieser Methode könnte erweitert werden, um die Fress- und Eiablagepräferenz ähnlicher Hemipteren, wie z.B. der Braunen Zikade (BPH), Nilaparvata lugens (Stål), zu untersuchen.

Einleitung

Reis ist ein Grundnahrungsmittel für mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung, und mehr als 90 % des Reises werden in Asien produziert und konsumiert 1,2. WBPH und BPH sind die zerstörerischsten Schädlinge von Reis und eine erhebliche Bedrohung für die Reisproduktion3. Aus Kosten- und Umweltsicht ist die Züchtung und Anwendung von insektenresistentem Reis der effektivste Ansatz, um die durch Zikaden verursachten Schäden zu kontrollieren 4,5,6. Dementsprechend ist das Screening resistenter Reiskeimplasma-Ressourcen eine wichtige Voraussetzung für die Züchtung von insektenresistentem Reis. Die Genauigkeit bei der Identifizierung des reisresistenten Phänotyps ist hilfreich für die Feinkartierung und die weitere funktionelle Erforschung von Zielgenen. Die phänotypische Identifizierung ist jedoch aufgrund der Komplexität des Resistenzmechanismus zu einer großen Schwierigkeit geworden. Die Resistenz von Reis gegen Schädlinge kann in drei Typen unterteilt werden, nämlich Antibiose, Toleranz und Nichtpräferenz7. Jede Sorte spiegelt einen anderen Aspekt des Resistenzmechanismus von Reis gegen Schädlinge wider. Die derzeit am weitesten verbreitete Methode zum Screening auf Resistenz gegen Zikaden ist die Standard-Saatgutkasten-Screening-Technik (SSST), mit der die phänotypische Resistenz einer großen Anzahl von Reispflanzen schnell identifiziert und in kurzer Zeit resistente Keimplasmalinien gewonnen werden können8.

Die SSST-Methode spiegelt jedoch nur die Resistenz von Reis im Sämlingsstadium wider und ist effektiver bei der Beurteilung von Resistenzmechanismen vom Toleranztyp. Die Resistenz von Reis gegen Insekten spiegelt sich auch in Antibiosen wider, wie z. B. der Überlebensrate der Nymphen, der Dauer der Nymphe und der Schlüpfrate der Eier, sowie in der Nichtpräferenz wie Lebensraum, Nahrungsaufnahme und Präferenz für die Eiablage9. Hinzu kommt, dass die Widerstandsfähigkeit von Reissetzlingen oft nicht sehr stabil ist. Mit dem Wachstum der Pflanzen wird die Resistenz tendenziell stabiler. Daher kann die SSST-Methode den Resistenzgrad von Reis nicht vollständig widerspiegeln. Darüber hinaus variiert die Resistenz von Reis gegen Schädlinge in den verschiedenen Wachstumsstadien, und es gibt offensichtliche Unterschiede in den Resistenzmechanismen zwischen Sämlingen und reifenden Pflanzen. Studien haben gezeigt, dass reifende Reispflanzen flüchtige Sekundärmetaboliten freisetzen können, um einen Befall durch Schadinsekten zu vermeiden, was sich in der Unselektivität des Insekts bei der Nahrungsaufnahme oder Eiablage auf der Reispflanze äußert10,11. Dies ist auch eine sehr wichtige Art von Resistenzmechanismus, der eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung von Insektenschädlingen und der Sicherung des Reisertrags bei der Reife spielt.

Gegenwärtig ist es noch eine Herausforderung, die Resistenz von Reis durch Nichtpräferenz zu identifizieren. In diesem Fall werden derzeit zwei Hauptansätze verwendet. Zum einen werden Zikaden und Reispflanzen in einen quadratischen Nylonnetzkäfig12 gesetzt. Obwohl dieser Ansatz als relativ effizient für die gleichzeitige Durchführung von Experimenten an mehreren Reislinien angesehen wird, benötigt er einen größeren Versuchsraum und verursacht daher aufgrund undurchsichtiger Nylonnetzmaterialien einige Schwierigkeiten bei der Beobachtung und Zählung. Auf der anderen Seite wird die Methode des Y-Röhren-Olfaktometers in Insektenselektionsexperimenten nach der Differenz der aus dem Reis freigesetzten flüchtigen Substanzen verwendet. Dieses Verfahren erleichtert die Beobachtung aufgrund seines Glasbehälters14. Einer der wichtigsten einschränkenden Faktoren dieser Methode ist, dass sie nur flüchtige Gerüche beurteilen kann, und sie stellt auch strenge Anforderungen an die Dichtheit der Versuchsgeräte und dauert lange.

Darin beschreiben wir eine verbesserte Methode zur Bewertung der nicht-präferenzartigen Resistenz der Reispflanze gegenüber WBPHs, die einfach zu bedienen und leicht zu beobachten ist. Diese Methode kann auch verwendet werden, um den Lebensraum, die Nahrungsaufnahme und das Eiablagepräferenzverhalten von BPHs und anderen hemipterösen Schädlingen zu untersuchen.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Zikaden, Reispflanzen und dem Polyvinylchlorid-Käfig

  1. Zikaden
    1. Züchten Sie WBPHs auf Bodenfräsen einer anfälligen Reissorte namens Taichung Native 1 (TN1) in insektensicheren Käfigen und lassen Sie sie sich über Generationen hinweg auf natürliche Weise vermehren. Wählen Sie langflügelige, neu geschlüpfte weibliche Erwachsene für weitere Experimente.
      HINWEIS: Die WBPHs wurden vom Agricultural Genomics Institute in Shenzhen, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, zur Verfügung gestellt.
  2. Reispflanzen
    1. Weichen Sie die Samen jeder Reislinie in Wasser ein und stellen Sie sie in einen klimatisierten Raum mit Parametern von 28 °C, 75 % bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) und Zyklen von 14 h hell / 10 h dunkel für 2 Tage bis zur Keimung.
    2. Säen Sie 30 gekeimte Samen jeder getesteten Reislinie gleichmäßig in eine Plastiksaatbox (20 cm [Länge] x 15 cm [Breite] x 10 cm [Höhe]), die bis zu einer Tiefe von 3-4 cm mit Reiserde gefüllt ist.
    3. Bedecken Sie die Samen mit einer dünnen Schicht feiner trockener Erde; Befeuchten Sie dann den trockenen Boden mit Wasser.
    4. Stellen Sie die Saatkiste in einen insektensicheren Käfig mit 200 Maschen (75 cm [Länge] x 75 cm [Breite] x 75 cm [Höhe]) bei 28 °C, mit 75 %-80 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 14 h hellen/10 h dunklen Zyklusbehandlung in einem klimatisierten Raum. Gießen Sie jeden Tag, um die Erde feucht zu halten. Setze den Anbau der Pflanzen 7 Tage lang fort, bis sie das zwei- bis dreiblättrige Stadium erreicht haben.
    5. Wählen Sie 20 Sämlinge mit ähnlichem Wachstumspotenzial aus, verpflanzen Sie die Sämlinge in Kunststofftöpfe mit einem Durchmesser von 10 cm (ein Sämling pro Topf) mit einem Loch am Boden.
    6. Stellen Sie die Töpfe in einen insektensicheren Käfig mit 200 Maschen (75 cm [Länge] x 75 cm [Breite] x 75 cm [Höhe]) bei 28 °C, mit 75 %-80 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 14 h hellen/10 h Dunkelzyklusbehandlung in einem klimatisierten Raum mit Wasser am Boden der Schale, für etwa 30 Tage Wachstum, bis sie mit einer oder zwei Pinnen die Bestockungsphase erreichen.
    7. Schneiden Sie die Reispflanzen 48 h vor Beginn des Versuchs auf eine Motorhacke.
  3. Zylindrischer Käfig aus Polyvinylchlorid
    1. Erhalten Sie transparentes Polyvinylchlorid (PVC) mit den Maßen 120 cm x 90 cm und einer Dicke von 0,5 mm.
    2. Machen Sie daraus eine zylindrische Struktur mit einer Höhe von 90 cm und einem Durchmesser von 35 cm.
    3. Verwenden Sie einen Hefter, um den Überlappungsbereich an beiden Enden des Zylinders zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass der Überlappungsbereich etwa 90 cm lang und 10 cm breit ist.
    4. Dichten Sie den gesamten Überlappungsbereich von der Peripherie des Zylinders mit Haftklebeband ab.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der zylindrische Käfig senkrecht zum Boden aufgestellt werden kann und kein offensichtlicher Spalt zwischen dem Käfig und dem Boden vorhanden ist.
    5. Schneiden Sie 200 Maschennetze aus Nylon mit den Maßen 50 cm x 50 cm zu; Bereiten Sie sich ausreichend auf die folgenden Schritte vor.
    6. Besorgen Sie sich geeignete Gummibänder; Achten Sie darauf, dass der Durchmesser etwa 1,5 mm und der Umfang mindestens 32 cm beträgt, wenn das Band zusammengezogen wird.

2. Behandlung von Insekten und Reis

  1. Stellen Sie eine runde Kunststoffwanne mit einem Durchmesser von 28 cm und einer Höhe von 10 cm auf einen ebenen Betonboden in einem klimatisierten Raum mit Parametereinstellungen, wie in Schritt 1.2.6 beschrieben.
    HINWEIS: Wenn der Gewächshausboden aus Erde besteht, suchen Sie eine möglichst ebene Oberfläche, um sicherzustellen, dass das Tablett flach liegt.
  2. Wählen Sie zwei Töpfe mit unterschiedlichen Reislinien (aus Schritt 1.2.7) und stellen Sie diese nebeneinander in die Schale und füllen Sie die Plastikschale mit ausreichend Wasser.
  3. Decken Sie die beiden Testreistöpfe mit dem in Schritt 1.3.4 hergestellten zylindrischen Käfig ab.
  4. Legen Sie ein Stück Nylonnetz (aus Schritt 1.3.5) auf den Käfig.
    HINWEIS: Die beiden Reistöpfe im Käfig können als Gruppe verwendet werden; Wiederholen Sie 15 Sätze jeder Gruppe. Platzieren Sie die Reistöpfe zufällig in Position und Richtung, aber versuchen Sie darauf zu achten, dass sich die Blätter der beiden Reispflanzen nicht berühren.
  5. Verwenden Sie eine handgefertigte Saugfalle, um 40 neu geschlüpfte weibliche WBPH-Erwachsene zu sammeln (siehe Abschnitt 1.1).
  6. Legen Sie die WBPH Erwachsenen in ein Glasröhrchen (mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Höhe von 15 cm) und decken Sie es mit einem Schwammstopfen ab.
  7. Heben Sie eine Ecke des Nylonnetzes an (siehe Schritt 2.4).
  8. Entfernen Sie den Schwammstopfen von der Glasröhre und setzen Sie die Röhre in den mittleren Teil des Käfigs ein, um alle WBPHs freizusetzen.
  9. Decken Sie das Nylonnetz schnell ab und verwenden Sie ein Gummiband, um es abzudichten, um ein Entweichen der WBPHs zu verhindern (Abbildung 1).

3. Aufzeichnung und Beobachtung

  1. Beobachten Sie die Verteilung der WBPHs auf jeder Reispflanze 3, 6, 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach dem Befall.
  2. Notieren Sie die Anzahl der WBPHs an verschiedenen Reispflanzen einschließlich Blattscheide und Blatt aus allen Richtungen durch den transparenten Käfig.
    HINWEIS: Seien Sie während des Beobachtungsprozesses vorsichtig, um die WBPHs nicht zu stören.

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Ergebnisse

In dieser Studie wurden drei Testreislinien verwendet. Die Reislinie FY01 ist WBPH-anfällig und wird als Kontrollgruppe verwendet. Die Reislinie HZ08 und HZ06 waren transgene Linien, in denen das potentiell WBPH-resistente X1-Gen bzw. das X5-Gen auf der Grundlage des Hintergrunds des GJ01 eingeführt wurden. Daher könnte ein Reisresistenzvergleich zwischen HZ08/HZ06 und FY01 zeigen, ob das entsprechende eingefügte Gen eine potentielle Resistenzfunktion hat. In dieser Studie wurde die Resis...

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Diskussion

Reifende Reispflanzen setzen flüchtige Sekundärmetaboliten frei, um Schadinsekten zu bekämpfen oder die Paarungsfähigkeit dieser Schädlinge (z. B. in WBPHs) über eine spezielle physikalische Struktur auf der Oberfläche der Blattscheide zu verringern, die ein wichtiger Resistenzmechanismus ist13. Bei Reispflanzen hängt die Nichtpräferenz nicht nur mit der Nahrungsaufnahme zusammen, sondern auch mit dem Lebensraum und der Paarung. Aktuelle Studien haben sich jedoch ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Lang Yang für die Fütterung der Weißrückenzikaden und den Reisanbau. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Sonderfonds für die industrielle Entwicklung des Dapeng New District, Shenzhen City (Grant No. KY20180216 und KY20180115).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
klimatisierter RaumNingbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit, photoperiodische Kontrolle
Glasrohr mit Schwammstopfen//Durchmesser 2 cm und Höhe 15 cm
handgefertigte Saugfalle//
/insektensicherer Käfig//200 Maschen, (L & mal; W &mal; H, 75 &mal; 75 & mal; 75 cm)
Nylonnetz//200 Mesh
Reiserde//
/Kunststoff-Saatgutkiste // ( L & mal; W &mal; H, 20 & mal; 15 & mal; 10 cm)
Saattopf aus Kunststoff//Kunststoffschale mit 10 cm Durchmesser
// ( D & mal; H, 28  &mal; 10 cm)
Reissamen der Linie FY01//60 Samen
Reissamen der Linie HZ06//30 Samen
Reissamen der Linie HZ08//30 Samen
Reissamen der Sorte TN1//viele
Gummiband//Durchmesser beträgt 1,5 mm und der Umfang beträgt 32 cm
Klebeband///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/Hefter für statistische
Datenanalysen///transparentes
PVC //120 cm & mal 90 cm Abmessungen und Dicke von 0,5 mm

Referenzen

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
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  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
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Insektenresistenz bei Reispaarweiser VergleichResistenz vom Nichtpräferenztypinsektenresistenter ReisAnalyse des FressverhaltensPräferenz von HemipteraLabor-Screening-MethodeÜberwachung dynamischer Veränderungen

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