Nachahmung einer Weltraum-Mission zum Mars mit Megalosauridae entladen und teilweisen Belastung bei Ratten

Außerirdische Ziele, einschließlich der Mond und Mars, die Zukunft der menschlichen Raumfahrt repräsentieren, aber beide haben deutlich schwächer Schwerkraft als die Erde. Während die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf den Bewegungsapparat ausgiebig in Astronauten^1,2,3,4,5 und Nagetiere^6, untersucht wurden ^{7 , 8 , 9}, etablierten Megalosauridae entladen (HLU) Model¹⁰, Letzteres ist sehr wenig über die Wirkung der Schwerkraft teilweise bekannt. Mars Schwerkraft ist 38 % der Erdoberfläche und diesem Planeten geworden im Mittelpunkt der langfristigen Exploration¹¹; Daher ist es wichtig zu verstehen, die muskulären Veränderungen, die in dieser Umgebung auftreten können. Dazu entwickelten wir ein teilweise Gewicht tragen (PWB) System in Ratten¹², basierend auf früheren Arbeit in Mäusen^6,13, die mit Muskeln und Knochen Ergebnisse validiert wurde. Jedoch wird die Erforschung des Mars durch einen längeren Zeitraum der Schwerelosigkeit, vorausgehen, die nicht in unsere oben beschriebenen Modell¹²gerichtet war. Daher in dieser Studie verändert unser Modell um eine Reise zum Mars simulieren wir, bestehend aus einer ersten Phase des gesamten Megalosauridae entladen und unmittelbar gefolgt von einer zweiten Phase des teilweisen Gewichtsbelastung bei 40 % der normalen Belastung.

Im Gegensatz zu den meisten HLU Modellen wählten wir einen Becken-Gurt (basierend auf dem von Chowdhury Et Al.⁹beschrieben) verwenden anstatt einer Rute Suspension, Komfort der Tiere zu verbessern und sich nahtlos bewegen können und mühelos von HLU, PWB in wenigen Minuten. In Verbindung verwendeten wir die Käfige und Aussetzung Geräte, die wir zuvor entwickelt und¹²ausführlich beschrieben. Neben der Bereitstellung von zuverlässigen/konsistenten Daten, haben wir auch zuvor gezeigt, dass die festen Befestigungspunkt des Federungssystems in der Mitte des Stabes nicht verhindern, die Tiere dass von Bewegung, Pflege, Fütterung oder trinken. In diesem Artikel beschreiben wir wie Sie entladen der Tiere Hinterbeine (sowohl vollständig als auch teilweise), überprüfen ihre erzielten Schwerkraft-Ebenen, sowie wie funktional die resultierenden muskulären Veränderungen mit Griff bewerten Kraft und nass Muskelmasse. Dieses Modell wäre äußerst nützlich für Forscher versuchen, untersuchen die Folgen der teilweisen Schwerkraft (künstliche oder extra-terrestrial) auf einem bereits infizierten Muskel-Skelett-System, so dass sie zu untersuchen, wie Organismen anpassen teilweise Nachladen, und für die Entwicklung von Gegenmaßnahmen, die zur Erhaltung der Gesundheit während und nach der bemannten Raumfahrt entwickelt werden könnte.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center unter Protokoll-Nummer 067-2016 genehmigt.

Hinweis: Es werden männliche Wistar Ratten im Alter von 14 Wochen vor Behandlungsbeginn (Tag 0) verwendet. Ratten sind in benutzerdefinierten Käfige 24 h vor Grundlinie Akklimatisierung ermöglichen individuell untergebracht.

(1) Megalosauridae entladen

Hinweis: Das Becken Gurtzeug an narkotisierten oder wach Tieren einsetzbar. Hier ist die Beschreibung des Protokolls an narkotisierten Tieren gegeben. Tragen Sie geeigneten persönliche Schutzausrüstung (PSA), Tiere zu behandeln.

1. Legen Sie die Ratte in eine Anästhesie-Box mit 3,5 % Isofluran und ein Sauerstoff-Flow von 2 L/min.
   Hinweis: Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn eine feste Prise der hinteren Pfote keine Reaktion hervorrufen wird.
2. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, legen Sie die Ratte auf der Bank mit betäubende Gas aus einem Nosecone mit 2 % Isofluran und eine Sauerstoffzufuhr von 1,5 L/min.
3. Die Ratte in Bauchlage legen Sie und das Becken Gurtzeug auf in einer Rostro-kaudalen Bewegung.
4. Biegung der Becken-Gurt ermöglichen einen gemütlichen passen, während Sie darauf achten, nicht drücken Sie vorsichtig die Hintergliedmaßen, Abschürfungen und Beschwerden zu verhindern.
5. Legen Sie Edelstahlkette mit dem drehbaren Verschluss an die Spitze der Becken-Gurt, wo ein Haken an der Unterseite der Rute befestigt ist.
6. Entfernen Sie die Ratte aus der Narkose und legen Sie das Tier in einem benutzerdefinierten Käfig mit der Kette verlängert ihr Maximum.
7. Sobald die Ratte vollständig wach und mobil ist, kürzen Sie die Kette mit den oberen drehbaren Verschluss, bis die Hinterbeine nicht mehr den Boden erreichen können.
8. Beobachten Sie das Tier für ein paar Minuten zu beurteilen, seinen Komfort und stellen sicher, dass zu allen Zeiten, beide Hinterbeine bleiben vollständig entladen.

(2) teilweise Gewichtsbelastung

Hinweis: Dieser Schritt kann bei wach und narkotisierten Tieren realisiert werden.

1. Wandeln Sie die HLU Aufhängevorrichtung in PWB Aussetzung durch Hinzufügen das dreieckige Teil bestehend aus Edelstahl-Ketten und einem hinteren Stab.
2. Betäuben Sie das Tier nach den gleichen Verfahren wie für die HLU (Schritte 1.1 und 1.2).
3. Legen Sie eine Leine Jacke der entsprechenden Größe auf die Vorderbeine der Ratte (M für Ratten von 400 g oder niedriger, L für Ratten mit einem Gewicht von über 400 g) und schließen Sie es mit der Rückseite BH-Extender.
4. Der Haken an der Rückseite BH-Extender und den gegenüberliegenden Verschluss auf den Haken an der Becken-Gurt an der Schwanzwurzel zuordnen Sie einen Verschluss der dreieckige Teil.
5. Lassen Sie das Tier wieder aus der Narkose in den Käfig. Einmal wach, überprüfen Sie, ob die Aussetzung auf die Vorderbeine und die Hinterbeine gleich ist, durch die Verkürzung der Kette und Bearbeiten der Position der unteren Wirbel schließe, wenn nötig.
   Hinweis: Dieser Schritt kann auch realisiert werden mit einer Kraftplatte, um die gleiche Belastung alle Gliedmaßen zu bestätigen.
6. Legen Sie die Ratte auf der Skala aufzunehmen "geladen" Körpergewicht, d.h. das Gewicht des Tieres und den gesamten Apparat, ohne die Kette zu verkürzen.
7. Die Kette zu verkürzen, bis die Waage 40 % der "geladen" Körpergewicht und Aufzeichnung der erzielten zeigt Schwerkraft Ebene (ausgedrückt als das Verhältnis zwischen Leergewicht und geladenen Gewicht).
8. Beobachten Sie das Tier, um sicherzustellen, dass das Leergewicht stabil ist und dass die Ratte auf alle Glieder gleich geladen ist.
9. Den gesamten Apparat aus die Waage mit der Rute und die Ratte zurück in seinen Käfig.

3. Bewertung der Megalosauridae grip force

1. Halten Sie die Ratte mit einem traditionellen Zurückhaltung, indem er eine Hand unter die Vorderbeine. Das Heck mit der zweiten Hand sanft zu halten.
2. Nähern Sie sich den Haltebügel mit den hinteren Pfoten und stellen Sie sicher, dass beide Pfoten voll und ganz auf die Bar ruhen.
   Hinweis: Wenn die Ratte die Bar nicht voll greifen oder keine Anzeichen zeigt für freiwillige greifen, lösen Sie leicht die Zurückhaltung. Wenn dies nicht erfolgreich ist, die Ratte zu seinem Käfig zurück und wiederholen Sie nach ein paar Minuten.
3. Ziehen Sie die Ratte gerade zurück, bis es seinen Griff freigibt. Notieren Sie die maximale Kraft auf den Aufnehmer angezeigt.
4. Warten Sie ca. 30 s zwischen Messungen und wiederholen Sie den Test 3 Mal.
5. Berechnen Sie den Mittelwert der drei Messungen für das scoring, um Müdigkeit zu berücksichtigen.

(4) Aufnahme des Muskels nasse Masse

1. Legen Sie die Ratte in eine CO₂ Euthanasie Kammer. Bestätigen Sie nach der entsprechenden Wartezeit nach IACUC und AVMA Richtlinien die Euthanasie durch eine visuelle Beobachtung eines Mangels an Atmung.
2. Legen Sie die Ratte auf dem Seziertisch in Bauchlage und entfernen Sie das Fell und die Haut in der Nähe des Knöchels mit kleinen Dissektion Schere einritzen. Verwenden Sie Hände, um die Hautschicht abziehen.
3. Mit kleinen Dissektion Schere, sanft brechen Sie die Muskel-Faszie und isolieren Sie die Kalkaneus Sehne zu.
   Hinweis: Die Kalkaneus Sehne ist der Ansatzpunkt der Soleus und Gastrocnemius Muskeln.
4. Halten Sie die Kalkaneus Sehne mit einer kleinen Pinzette, verwenden Sie die Dissektion Schere, um Gastrocnemius und Soleus Muskeln von der Bizeps Femoris, oberhalb zu isolieren.
5. Einmal isoliert, schneiden Sie den Ansatzpunkt der Gastrocnemius und Soleus Muskeln im Bereich der Kniekehle.
6. Vorsichtig ziehen Sie den Soleus abseits der Gastrocnemius und durch Schneiden der Kalkaneus Sehne zu lösen.
7. Legen Sie die Ratte in Rückenlage. Sorgfältig entfernen der Faszie und schälen die Tibialis anterior vom Knöchel in einer Aufwärtsbewegung.
8. Schneiden Sie die Tibialis anterior an seine überlegene Befestigungspunkt.
9. Notieren Sie die genaue nasse Masse des ausgeschnittenen Muskel mit einer geeichten Präzisionswaage und mit einem Gewicht von Boot.

Die Vorteile der neuen Käfige, dass wir bereits entworfen und im Detail12beschrieben, wir ein Edelstahl-Kette-basierte Aufhängevorrichtung, die Megalosauridae entladen verwendet (HLU, Abb. 1) und teilweise tragende (PWB, eignet Abbildung 2). Der entscheidende Vorteil unseres Designs ist die Fähigkeit, von einer Art zur anderen in einer Angelegenheit von Minuten unter Beibehaltung einer identischen Umgebung für die Tiere entladen zu gehen. Wir haben einen maßgeschneiderten Becken-Gurt (Abbildung 2A), der die eine einzelne maßgeschneiderte Edelstahlkette mit einem drehbaren Verschluss auf jeder Seite für HLU zugeordnet ist. Um ändern diese Aufhängevorrichtung und PWB erzielen, ist die Zugabe von einem dreieckigen Stück Edelstahl-Kette, die einen starren zurück Stab, entworfen, um direkt über der Wirbelsäule (Abbildung 3) sitzen eingebaut die einzige Voraussetzung. Diese Schritte können in wach oder narkotisierten Tieren durchgeführt werden.

Mit dem vielseitigen Umfeld in diesem Experiment zur Verfügung gestellt konnten wir erfolgreich entladen die Megalosauridae aller unserer Tiere für 7 Tage ohne Komplikationen und schnell setzen sie auf eine partielle Schwerkraft bei 40 % ihrer normalen Laden (PWB40, Durchschnitt erreicht Schwerkraft-Niveau von 0,4076 g ± 0,0036 g). Während der ersten Woche des gesamten HLU Tiere angezeigt einen erheblichen Körper Gewichtsverlust (Abbildung 4A:-7.19 ± 0,87 %, n = 9, p < 0,001), die in anderen gezeugt worden hat14Modelle und unterscheidet sich nicht wesentlich von dem, was wir in beobachtet Ratten auf PWB40 für die gleiche Dauer ausgesetzt (-5.53 % ± 1,44 %, n = 10, p = 0,37). Aber Tiere weiter Gewicht zu verlieren, im Laufe der Zeit während der anschließend ans PWB40 (-9.06 % ± 1,35 % gegenüber dem Ausgangswert, p < 0,0001).

Megalosauridae Griffkraft ist ein Standardmaß der Muskelfunktion, die längs verwendet werden kann (Abbildung 4 b). Wir haben festgestellt, dass eine Woche der gesamten Entladung führte zu einem durchschnittlichen Rückgang der Griffkraft 50,16 % ± 4.10 % im Vergleich zum Ausgangswert (p < 0,0001). Nach einer anschließenden Woche teilweise Belastung bei 40 % der normalen Belastung, bemerkten wir keine Änderung hinsichtlich Griffkraft (-44.29 ± 4,67 % im Vergleich zum Ausgangswert, p < 0,0001). Zu allen Zeitpunkten, die prozentuale Veränderung im hinteren Pfote Griffkraft war signifikant unterschiedlich von den Steuerelementen Alter abgestimmt (p < 0,0001 für Tag 7 und Tag 14, n = 11). Darüber hinaus wir beobachtet, dass nach Abschluss des Studiums, Tiere, die unterzog sich total entladen gefolgt von teilweise tragende (HLU-PWB40) einen deutlich größeren Griff Kraft Verlust im Vergleich zu der PWB40 Gruppe angezeigt (p = 0,03).

Muskel nasse Masse war am Ende des Experiments aufgezeichnet und im Vergleich zu Daten erhalten, nach zwei Wochen der normalen Belastung oder zwei Wochen des PWB40 (Abbildung 4) und von unserer Gruppe12zuvor veröffentlichten Daten. Wir fanden, dass die PWB40 und HLU-PWB40 Gruppen deutlich niedriger feuchte Masse des Soleus (S), Gastrocnemius (G), und Muskeln Tibialis anterior (TA) als Alter abgestimmten Kontrollen (PWB100). In der Tat verzeichneten wir eine durchschnittliche Soleus Masse von 0,1681 g ± 0,007 g für unsere Tiere, die erheblich niedriger als die Ratten, PWB100 für 2 Wochen in unseren vorherigen Experimenten ausgesetzt war (-24.60 % ± 3,18 %, p < 0,0001). Für die Gastrocnemius verzeichneten wir einen nassen Durchschnittsmasse 2,192 g ± 0,096 g (-10.55 ± 3,93 %, p = 0,038 Vs PWB100) und einer nassen Masse von 0,759 g ± 0,029 g für den m. Tibialis anterior (-14.40 ± 3,27 %, p = 0,009 Vs PWB100). Während unserem Datensatz, dass hervorgehoben die Tiere ausgesetzt, ein Mars-Mission-Analogon (HLU-PWB100) hatten eine verminderte nasse Masse der Soleus und Gastrocnemius Muskeln im Vergleich zu den Tieren ausgesetzt PWB40 für 2 Wochen kontinuierlichen (-8.75 % ± 3.84 % und-5.85 % ± 4,14 % beziehungsweise), wir keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen beobachten.

Abbildung 1: Beschreibung der Aussetzung Geräte und wie Konvertieren von HLU auf PWB. (A) auf der Grundlage unserer vorherigen Entwurf, wir nutzten einen Aluminiumstab sitzt oben auf den Käfig, eine stabile Suspension zu halten Gerät, bestehend aus einem Schlüsselring befestigt in der Mitte des Stabes (Pfeil 1), eine Kette aus Edelstahl (Pfeil 2), und zwei schwenkbar Verschlüsse (Pfeil 3). (B), konvertieren Sie die Aufhängevorrichtung um PWB, eine Dreiecksform Struktur zu erreichen ist mit der unteren Wirbel Verschluss befestigt. Dieses Stück besteht aus Edelstahl-Ketten und einer Polyvinylchlorid (PVC) zurück Rute, die über die Ratte Wirbelsäule (Pfeil 1) sitzt. Auf jeder Seite der hinteren Stange ist befindet sich einen Verschluss der Gurt und die Jacke bzw. befestigen (Pfeil 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Hind Gliedmaßen entladen mit einem Becken-Gurt. (A) vorne und seitlich anzeigen Zeichnungen der Kabelbaum-Struktur verwendet, um den hinteren Gliedmaßen der Tiere zu unterstützen. (B) der Becken-Gurt wurde wie beschrieben angepasst Snuggly rund um den hinteren Gliedmaßen der Ratte positioniert. Die Edelstahl-Link ist über der Schwanzwurzel positioniert und an der drehbaren Verschluss befestigt. Die genaue Lage und Form des Gurtes können variieren zwischen Tieren aber Ratten sollte bequem sein und es ist notwendig, dass ihre Hinterbeine nie den Boden berühren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: teilweise Gewichtsbelastung. Teilweiser Entladung erfordert das Hinzufügen einer Jacke für das Tier um die vorderen Gliedmaßen zu unterstützen. Die Jacke wird mit einem hinteren BH-Extender geschlossen und ein Haken an den Extender, liegend zwischen die Schulterblätter befestigt ist. Die Jacke und der Becken-Gurt sind Spangen befindet sich an jedem Ende der hinteren Stange befestigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Beispiele für längs-Follow-up bei Tieren ausgesetzt sind, verschiedene entladen. (A) Körpergewicht (BW) ändern. Tiere wurden wöchentlich gewogen, ohne den Gurt oder Jacken und Körpergewicht aufgenommen wurde. PWB100 = teilweise Belastung bei normaler Belastung; PWB40 = teilweise Belastung bei 40 % der normalen Belastung; HLU-PWB40 = eine Woche der Megalosauridae entladen, gefolgt von einer Woche nach PWB40. Die Ergebnisse der Tukey post-hoc-Test nach einer 2-Fach gestapelt ANOVA als *: p < 0,05 **: p < 0,01 ***: p < 0,001 und ***: p < 0,0001 Vs PWB100. (B) Änderung der hinteren Pfote Griffkraft. Wöchentlich, hintere Pfote Griffkraft wurde gemessen und Ergebnisse wurden in prozentuale Veränderung gegenüber dem Ausgangswert für jedes Tier. Die Ergebnisse der Tukey post-hoc-Test nach einer 2-Fach gestapelt ANOVA als ***: p < 0,001 und ***: p < 0,0001 Vs PWB100, α: p < 0,05 Vs PWB40. (C) Muskel nasse Masse nach 14 Tagen. Muskel, den nassen Masse sofort nach Opfer 14 Tage auf eine Präzisionswaage aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse werden als Prozent der feuchten Masse in der Alter abgestimmt Kontrollgruppe (PWB100) erhalten. S = Soleus; G = Gastrocnemius; TA = m. Tibialis anterior. Die Ergebnisse der Tukey post-hoc-Test nach einem One-Way ANOVA als *: p < 0,05 **: p < 0,01 und ***: p < 0,0001 Vs PWB100. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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