Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Abstract

Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.

Introduction

Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren¹. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen². Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzell....

Protocol

Das Protokoll wurde vom Standing Committee on Animals an der Harvard Medical School und dem Brigham and Women es Hospital, Protokoll 2016N000230, genehmigt.

1. Mäuse, die für das Experiment verwendet werden

1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse auf dem B6-Hintergrund für die Verabreichung der Antikörpermischung.
2. Verwenden Sie CX3CR1^GFP/WTCCR2^{RFP/WT-Mäuse,} um festzustellen, ob ex vivo ganze LN-Bildgebung auch auf Reportermäuse angewendet werden kann, ohne Antikörpermischung zu verabreichen, sowie um das Vorhandensein von mononukleären Zellen zu untersuchen, einschließlich Antigen,....

Results

Dieses Manuskript zeigt Techniken zur Entfernung von Leisten- und Popliteal-Lymphknoten, ohne ihre Struktur nach der Injektion fluoreszierender Antikörper zu beschädigen, um bestimmte Zellpopulationen in diesen Organen zu färben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ).

Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von LN-Zellen mit BV421 Anti-CD4 und BB515 Anti-CD19 und konfokaler Bildgebungsanalyse definierte die Lokalisation von T-Zelle.......

Discussion

Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen³ <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 Anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1,5; 0,2 mg mL-1
>BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0,2 mg mL-1
BB515 Ratten-IgG2a & Kappa; Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
>BV421 Maus IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview Kulturschale	Greiner-Bio	627861	35x10 mm mit Glasboden
Insulinspritzen	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	Größe 21 x 20 cm / 100 Blatt pro Karton
Mikrochirurgie gebogene Pinzette	WEP Chirurgische Instrumente	nach Maß	12,5 cm
Mikrochirurgie gebogene Schere	WEP Chirurgische Instrumente	nach Maß	11,5 cm
Nadel	BD PrecisionGlide-30		Gauge × ½ Zoll
Nikon Eclipse Te + A1R konfokaler Kopf	Nikon	-	beladen mit 4 Hauptlaserlinien (405, 488, 543 und 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL<>-1
PE Ratte IgG2a, & kappa; Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 konfokales Mikroskop			Zeiss-bestückt mit 4 Hauptlaserlinien (405, 488, 543 und 647 nm)