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Methodenartikel

Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

8K Aufrufe

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DOI:

10.3791/59340

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12. September 2019

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode zum Wachstum von VX2-Zellen in Kultur dar und zur Erstellung eines orthotopischen VX2-Modells von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen bei Kaninchen. Orthotopische Endometriumkrebsmodelle sind wichtig für die präklinische Untersuchung neuartiger bildgebender Modalitäten für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen.

Zusammenfassung

Endometriumkrebs ist die häufigste gynäkologische Malignität in Nordamerika und die Inzidenz steigt weltweit. Die Behandlung besteht aus einer Operation mit oder ohne adjuvante Therapie in Abhängigkeit von lymphen Knoten Beteiligung, wie durch Lymphadenektomie bestimmt. Lymphadenektomie ist ein morbides Verfahren, das bei vielen Patienten keinen therapeutischen Nutzen hat, und daher ist eine neue Methode zur Diagnose von Lymphknotenmetastasen erforderlich. Um neuartige Bildgebungsmittel zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich. Das Modell des VX2-Endometriumkarzinoms wurde häufig in der Literatur beschrieben; Hinsichtlich der Methode der Modelleinrichtung bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Darüber hinaus wurden keine Studien über die Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells berichtet, da bisher nur in vivo propagierte Zellen verwendet wurden. Hierbei stellen wir eine standardisierte chirurgische Methode und postoperative Überwachungsmethode zur Etablierung des VX2-Endometriumkrebsmodells vor und berichten über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells.

Einleitung

Endometriumkrebs, oder Krebs der Gebärmutterschleimhaut, ist die zweithäufigste gynäkologische Malignität weltweit und die häufigste Malignität in entwickelten Ländern1. Die Inzidenz von Endometriumkrebs hat stetig zugenommen und ist zwischen 2005 und 2013 um 2,3 % pro Jahr gestiegen, wobei die Sterblichkeit entsprechend um 2,2 % gestiegen ist1,2,3. Die Diagnose von Lymphknotenmetastasen ist von größter Bedeutung, da das Vorhandensein positiver Lymphknoten ein starker negativer Vorhersagegeber für das Überleben4,5,6,7 ist und die adjuvante Therapie8,9,10,11,12,13. Lymphknotenmetastasen werden derzeit diagnostiziert, indem das Lymphgewebe, das über die wichtigsten Blutgefäße im Becken und Bauch liegt, operativ entfernt wird. Dieses Verfahren, bekannt als Lymphadenektomie, ist aufgrund widersprüchlicher Überlebensdaten aus zwei großen Studien14,15,16,17,18 und der bekannten Risiko einer intraoperativen15,19,20 und postoperativen Morbidität21,22,23. Da die aktuellen nicht-invasiven bildgebenden Modalitäten nicht über die erforderliche Empfindlichkeit und Spezifität verfügen, um lymphknotendissektion24zu ersetzen, wurde versucht, neue diagnostische Bildgebungstechniken zu entwickeln. Um diese neuartigen Techniken in einem präklinischen Umfeld zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich.

Das Kaninchen VX2 Tumormodell ist ein etabliertes Modell, das ausgiebig verwendet wurde, um mehrere menschliche solide Organtumoren25 einschließlich Lunge26, Kopf und Hals27,28, Leber29, Niere30, Knochen31,32, Gehirn33, Bauchspeicheldrüse34 und Gebärmutter35,36,37. Das VX2-Modell wurde ursprünglich 1940 von Kidd und Rous38 durch die erfolgreiche Transplantation eines Baumwollschwanz-Kaninchen-Papilloma-Virus von Shope im Jahr 1933entdeckt 39entwickelt. Seit dieser Zeit wurde das VX2-Modell in vivo beibehalten, was eine serielle Passage im Quadrizeps-Muskel von White New Zealand Kaninchen40erfordert. In jüngerer Zeit jedoch haben mehrere Gruppen erfolgreich VX2-Zellen in vitro40,41,42 angebaut und die zurückgehaltene Tumorigenität der kultivierten Zelllinie31 , 42,43. VX2-Tumoren sind histologisch als anaplastische Plattenepithelkarzinome44 definiert und enthalten Drüsenmerkmale, die dem Adenokarzinom26ähneln. Tumore zeichnen sich durch einfache Implantation, schnelles Wachstum und Hypervaskularität44,45 und zuverlässig metastasieren, am häufigsten auf regionale und entfernte Lymphknoten45. Ähnlichkeiten in der Gefäß- und Lymphanatomie46 sowie der orthotopischen Wachstumsstelle stellen sicher, dass das metastasierende Muster des Kaninchens VX2-Karzinom dem des menschlichen Endometriumkrebses nachahmt, was das VX2-Modell zu einem zuverlässigen Modell für die Untersuchung menschlicher metastasierende Erkrankung. Darüber hinaus deuten histologische Merkmale wie abnorme mikrovaskuläre Proliferation47 sowie immunologische48 und genetische Ähnlichkeiten49,50 zwischen Mensch und Kaninchen darauf hin, dass der Tumor Mikroumgebung kann die des menschlichen Endometriumkrebses widerspiegeln.

Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von VX2 berichtet, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen mit einer hohen gemeldeten Erfolgsrate36,51,52zu erstellen; In der aktuellen Literatur bestehen jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Methode der Modellerstellung. Zellsuspensionsdosen so niedrig wie 4 x 105 Zellen/Gebärmutterhorn51 und so hoch wie 5 x 109 Zellen/Uterushorn37,53 wurden ohne Standardkonsens über die erforderliche VX2 Zelldosis berichtet. Außerdem wurden eine Vielzahl von Impfmethoden berichtet, einschließlich mikrochirurgischer Implantation von Tumoren in das Uterusmyometrium36, Injektion von VX2-Zellsuspension37,44,52 , 53 und in einigen Fällen die Zugabe von Uterushorn-Nähte vor der Innokulation52. Schließlich haben keine Gruppen die Verwendung von kultivierten VX2-Zellen gemeldet, um dieses Modell zu erstellen. Der Zweck dieser Studie besteht also darin, eine erfolgreiche standardisierte Methode der VX2-Modellerstellung zu demonstrieren und die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zu melden, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen bei einem Kaninchen zu erstellen.

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Protokoll

Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und greifen Sie das Peritoneum, den Rectusmuskel und die Faszien mit Gewebezangen. Alle Tierstudien wurden in den vom Animal Resource Center (ARC) zugelassenen Einrichtungen des University Health Network und in Übereinstimmung mit zugelassenen Tiernutzungs- und Pflegeprotokollen (AUP #3994/#4299) durchgeführt. Die VX2-Zelllinie wurde aus Dr. Akens Labor am University Health Network gewonnen.

1. Erstellung von In-vitro-VX2-Zelllinie

  1. Ernten Sie den VX2-Tumor von Kaninchen Quadricep Muskel und Wachstum in Mausflanke.
    1. Gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auftauen, mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte hacken und durch einen 70-mm-Filter steil ieren, indem man kleine Mengen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) sequenziell hinzufügt, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein Endvolumen von 1 ml belastet werden.
    2. Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferter Salinelösung auf eine Konzentration von 1 x 107/ml verdünnen und in einem sterilen Rohr auf Eis legen.
      HINWEIS: Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus der vorherigen Ausbreitung von VX2-Tumoren in Kaninchen-Quadrizeps-Muskeln erhalten.
    3. Anästhetisieren Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung. Injizieren Sie 500 l der vorbereiteten VX2-Zellsuspension (5 x 106 Zellen/ml) in den Quadrizepsmuskel des Kaninchens. Überwachen Sie das Kaninchen klinisch auf Tumorwachstum ab Tag 10.
    4. Euthanisieren Sie die Kaninchen nach Tumoren erreichen 1-1,5 cm im Durchmesser (extern mit Sätteln gemessen) mit einer vom Tierarzt zugelassenen Methode. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie die Lebenszeichen einschließlich Herzfrequenz und Atemfrequenz überprüfen. Verbrauchen Sie den Tumor mit sterilen Instrumenten nach der Reinigung des Bereichs mit Betadin-Lösung.
    5. In einem biologischen Sicherheitsschrank mit sterilen Instrumenten den Tumor in kleine Stücke (0,2 cm) auf einer 10 cm Gewebekulturschale mit einer Skalpellklinge zerkleinern. Übergeben Sie die Tumorfragmente durch ein 70-m-Zellsieb mit 1 ml HBSS, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie mit 0,9% Salinelösung, um 7,5 x 105 Zellen in 200 l zu erhalten.
    6. Anästhetisieren Sie männliche NOD-Scid-Gamma-Mäuse (Gewicht 25 g) mit 4% Isofluran bei 1 L/min und halten Sie anästhesie mit 2% Isofluran. Sobald Mäuse anästhesiert sind, injizieren Sie 200 l der Lösung ab Schritt 1.1.5 mit einer 27-Spur-Nadel in das subkutane Gewebe der Mausflanke.
  2. Ernte und Passierung von VX2-Zellen in vitro
    1. Überwachen Sie das Xenograft-Wachstum klinisch zweimal wöchentlich, bis Die Tumoren mit Sätteln einen Durchmesser von 1 cm erreichen.
    2. Euthanisieren Sie Mäuse, indem Sie sie in eineCO2-Kammer legen oder zervikale Dislokationen nach der Anästhesisierung mit 4% Isoflurangas durchführen. Verbrauche Tumore unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank.
    3. Mince Tumoren mit einem Skalpell in 1-2 mm Stücke in einer 6 cm Gewebekulturschale mit 3 ml Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham es F12+ 10% fetales Rinderserum (FBS) Medien.
    4. Lassen Sie Tumorfragmente ungestört in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für zwei Tage, bis die Zellen aus den Tumorstücken zu wachsen beginnen. Anschließend überprüfen Sie kultivierte Platten täglich durch Lichtmikroskopie auf Zellkonfluenz. Nach Erreichen von 70% Koninfluenza, Trypsinisieren Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin in den Kolben und wieder in den 37 °C Inkubator für 5 min.
    5. Trypsin mit 6 ml DMEM/Schinken F12 + 10% FBS-Medium neutralisieren, Zellen und Zentrifuge bei 4 °C für 5 min bei 300 x gsammeln. Entfernen Sie Überstand und setzen Sie Pellet in 3,5 ml der neuen DMEM/Ham F12 + 10% FBS-Medien wieder auf. Samen frische 6 cm Kollagen I beschichtete Platten mit 1,6 x 106 Zellen pro Platte, um etwa 50% Zellsaatdichte zu erreichen.
      HINWEIS: 50 % Zelldichte bezieht sich auf die Zellen, die 50 % der Oberfläche der Platte einnehmen, wenn sie befestigt sind.
    6. Frühe Spassierung: Wiederholen Sie den obigen Prozess (Trypsinisierung, Aussaat), bis die Zellen 5 Mal durchlaufen wurden, und bewerten Sie dann die Zelllinienreinheit mit PCR mithilfe eines quantitativen PCR-Tests, um die genomische DNA von Derichmaus von der genomischen DNA der Maus zu unterscheiden (siehe Schritt 1.3.1-1.3.4).
      HINWEIS: Nach 8 Passagen können Zellen auf nicht kollagenbeschichteten regulären, anhaftenden Gewebekulturplatten vermehrt werden.
    7. Durchgang, Trypsinisieren und Einfrieren von Aliquots von Zellen in DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO bei einer Konzentration von 2 x 106 pro Durchstechflasche. Speichern Sie Zellen in flüssigem Stickstoff, bis sie für Experimente benötigt werden.
  3. Bestätigung des VX2-Ursprungs von überlebenden Zellen:
    1. Erstellen Sie eine Standardkur aus gereinigter genomischer Maus- und Kaninchen-DNA (Schritt 1.3.2 und Schritt 1.3.3). Verwenden Sie Primer, die auf artspezifische Sequenzen im zweiten offenen Leserahmen des LINE-1-Retrotransposonelements abzielen.
      HINWEIS: Primer-Sequenzen für CRPV E6 sind: 5'- GATCCTGGACCCACAAGTGund 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Die LINE-1 Retrotransposon-Elemente wurden verwendet. Primer-Sequenzen für Kaninchen LINE-1 sind: 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC und 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Primer Sequenzen für Maus LINE-1 sind: 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG und 5'-CCTTCTGACCAAGGTATCATTG
    2. Um eine Standardkurve für CRPV E6 zu erstellen, reinigen Sie VX2-Tumorzelllysat (Schritt 1.1.1) mit einem kommerziellen Kit nach dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie diese DNA mit einem kommerziellen Test. Führen Sie 6 serielle Verdünnungen von 225 pg/l bis 0,925 pg/L in niedrigem EDTA-TE-Puffer durch. Um eine Standardkurve für die genomische DNA der Maus zu erstellen, verdünnen Sie 100 g kommerzielle Mausgenom-DNA in niedrigem EDTA-TE-Puffer in 5 Verdünnungen von 125 pg/l bis zu 0,0125 pg/l.
    3. Legen Sie aus jeder verdünnten Lösung aus den Proben ab Schritt 1.3.2 4 l in Brunnen und führen Sie Proben in einem PCR-Thermocycler aus. Verwenden Sie die Cq-Werte aus jedem Lauf zusammen mit den DNA-Beträgen pro Bohrgut, um eine Standardkurve mit den Auto-Schwellenwerteinstellungen der Thermocycler-Software zu berechnen.
    4. Verwenden Sie standard qPCR-Verfahren, um PCR mit 40 Zyklen 2-stufigen Zyklus (98 °C und 60 °C) auf einem Thermocycler durchzuführen. Legen Sie Schwellenwerte fest, und legen Sie Delta-Ct-Werte auf >35 fest, um sicherzustellen, dass die VX2-Zelllinie des Kaninchens minimal kontaminiert ist. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion betrug 10 l, bestehend aus 5 l 2x Mastermix, 1 l Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung mit endliegender Primerkonzentration in Reaktion bei 250 nM und 4 l DNA-Probe.
      HINWEIS: Weitere Informationen zur Ausführung von PCR finden Sie unter Verweise54,55. Schwellenwerte werden festgelegt, und Delta-Ct-Werte werden auf >35 festgelegt, um eine minimale Mauskontamination in der VX2-Zelllinie des Kaninchens zu gewährleisten. Der empfohlene VX2-DNA-Gehalt für eine zuverlässige Detektion durch qPCR beträgt 1-10 pg.

2. VX2-Zellkultur und Bildung von Zellsuspension

  1. Durchstechflaschen mit VX2-Zellen (in Schritt 1.2.7 eingefroren) in einem Wasserbad bei 37 °C für 1 Minute auftauen und Zellen in ein konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml Kulturmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) übertragen. Zentrifuge für 8 min bei 107 x g, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 9 ml Medien wieder auf.
  2. Übertragen Sie wieder suspendierte Zellen in einen großen Kulturkolben. Zellen ohne Schütteln bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie Zellen täglich auf Zusammenfluss mittels Lichtmikroskopie und wechseln Sie kulturmedien alle drei Tage.
  3. Erstellung einer kultivierten VX2-Zellsuspension zur Injektion
    1. Trypsinize Zellen durch Zugabe von 3 ml von 0,25% Trypsin zu Kolben, sobald Zellen 80% Zusammenfluss erreicht haben. Kolben in Inkubator (37 °C) für 5 min legen. Lösung auf ein konisches Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge für 8 min bei 107 x g übertragen und dann überstand entfernen.
    2. Waschen Sie die Zellpellets 3 mal mit 9 ml Phosphat gepufferte Saline, Zentrifuge und entfernen Sie Überstand wie oben. Die Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferter Salinelösung mit einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml verdünnen und in ein steriles konisches Zentrifugenrohr auf Eis legen.
  4. Erstellung einer in vivo vermehrten VX2-Zellsuspension zur Injektion
    1. Gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auftauen, mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte zerkleinern und durch einen 70-mm-Filter wie in Schritt 1.1.1 s. Fügen Sie kleine Mengen HBSS sequenziell hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein Endvolumen von 1 ml belastet sind. Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferte Saline auf eine Konzentration von 1 x107/ml verdünnen und in einem sterilen Rohr auf Eis legen.
      HINWEIS: Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus der vorherigen Ausbreitung von VX2-Tumoren in Kaninchen-Quadrizeps-Muskeln erhalten.

3. Chirurgische Modelleinrichtung

  1. Einrichtung von chirurgischer Anästhesie und präoperativer Präparation
    1. Vormedikamentöse weibliche weiße neuseeländische Kaninchen (2,5-3,5 kg) 1 h vor dem geplanten chirurgischen Eingriff mit Injektionen von Acepromazin (1 mg/kg IM) und Meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anästhetisieren Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung.
    2. Intubierte anästhesierte Kaninchen mit einer Kehlkopfmaske (LMA) und sicher an Ort und Stelle mit Klebeband, Aufrechterhaltung einer tiefen Anästhesie durch Titierung der inhalativen Isofluran-Dosis zwischen 2-5%. Überwachen Sie die chirurgische Anästhesie während des gesamten Eingriffs regelmäßig, indem Sie die Vitalzeichen (Atemfrequenz, Kapillarnachfüllung, Sauerstoffsättigung, falls vorhanden) und die Überwachung auf Anzeichen, die auf Schmerzen hindeuten (Bewegung, Entzug von Reizen, Geräuschen) oder Licht, überprüfen. Anästhesie (Bewegung, Kauen auf LMA-Rohr).
      HINWEIS: Dies sollte von jemandem mit Erfahrung bei der Überwachung der chirurgischen Anästhesie durchgeführt werden.
    3. Legen Sie einen 22-Spur-Ohrveinkatheter in die marginale dorsale Vene. Cefazolin (20 mg/kg) 10 min intravenös verabreichen, bevor sie einen chirurgischen Hautschnitt aufwies.
    4. Schneiden Sie die Haare über das Becken und den Bauch, bevor Sie das Kaninchen auf den Operationstisch legen, und legen Sie die Kaninchen dann in eine dorsale Position auf den Operationstisch. Reinigen Sie das chirurgische Feld mit einer 3-stufigen chirurgischen Hautpräparat (Betadinseife, Chlorhexidinlösung, Betadinlösung). Das Operationsfeld mit Laparotomie-Vorhängen drapieren, nachdem die Oberseite des Schambeins auf dem Land markiert wurde, so dass ein 5 cm x 5 cm großer Bereich des Unterbauchs freigelegt wird.
  2. Erstellung des Laparotomieschnitts und Identifizierung der Gebärmutterhörner
    1. Setzen Sie eine chirurgische Kappe und Gesichtsmaske auf. Peeling Hände mit Chlorhexidin oder Betadine chirurgische Peeling-Lösung. Mit steriler Technik, setzen Sie ein steriles Kleid und sterile chirurgische Handschuhe.
    2. Machen Sie mit einem Skalpell von 11 Blatt einen 2,5 cm langen Schnitt von 1 cm Schädel zur Symphyse pubis durch haut- und unterkutanes Gewebe des Kaninchenbauchs. Incise die rectus fascia und sezieren Sie die Rectus-Muskeln seitlich, um das zugrunde liegende Peritoneum zu entlarven. Geben Sie das Peritoneum scharf ein, nachdem Sichergestellt ist, dass die Unterfläche frei von Darm oder anderen Bauchorganen ist.
    3. Finden Sie die Uterushörner, die die Harnblase identifizieren und einen gehandicapten Finger überlegen, nachträgig und seitlich über die Spitze der Blase fegen.
      HINWEIS: Bei Bedarf kann die volle Blase mit digitalem Druck entleert werden. Einmal lokalisiert, bringen Sie die Uterushörner durch den Bauchschnitt, um auf der Bauchwand zu ruhen.
    4. Führen Sie mit einer 3-0 geflochtenen resorbierbaren Naht eine einzige Nahtligation jedes Gebärmutterhorns von ca. 1,5-2,0 cm distal für die Cervices durch. Legen Sie die Naht nur medial auf die Gebärmutterarterien, die entlang der seitlichen Aspekt jedes Horns laufen. Binden Sie die Nähte eng, um die distalen Uterushörner zu verschließen (Abbildung 1).
  3. Myometriale VX2-Impfung
    1. Mit einer 27-Spur-Nadel 0,5 ml der zuvor vorbereiteten VX2-Zellsuspension von Schritt 2.3.2 (für kultiviertes VX2-Modell) oder 2,4 (für in vivo propagiertes VX2-Modell) in das Myometrium jedes Uterushornproximals in die Nahtstelle (zwischen der Nahtstelle) injizieren. und den Gebärmutterhals). Injizieren Sie über 1 Minute und stellen Sie sicher, dass Zellen nicht in die zugrunde liegende Gebärmutterhöhle injiziert werden. Anästhesisieren von Tieren mit inhaliertem Isofluran (2-5%) und eine Anästhesiemaschine mit Bain-Schaltung.
    2. Wenden Sie Druck auf die myometriale Injektionsstelle für 30 s nach der Injektion an, um das Auslaufen von Zellen zu minimieren. Inspizieren Sie die Injektions- und Nahtstellen auf Hämostase und legen Sie die Uterushörner wieder in den Bauch.
  4. Schließen des chirurgischen Schnitts
    1. Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und greifen Sie das Peritoneum, den Rectusmuskel und die Faszien mit Gewebezangen.
      1. Um dies zu tun, verankern Sie die Naht an einem Scheitelpunkt des Einschnitts, indem Sie oberflächlich bis tief auf der einen Seite des Einschnitts und tief bis oberflächlich auf der anderen Seite nähten. Binden Sie einen Knoten. Mit der beigefügten Naht, machen Laufstiche senkrecht zum Schnitt durch die Schichten der Bauchwand arbeiten schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite. Binden Sie die Naht und schneiden.
    2. Oberflächlicher Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie den Scheitelpunkt des Hautschnitts und verschließen Sie die Bauchhaut mit vergrabenen untercuticularen 3-0 resorbierbaren Poly-Filament-Nähten. Tragen Sie chirurgischen Kleber auf den geschlossenen Schnitt auf, um die Hautränder zu widersetzen.
      1. Um dies zu tun, verankern Sie die Naht an einem Scheitelpunkt des Einschnitts, indem Sie tief bis oberflächlich auf der einen Seite des Einschnitts und oberflächlich bis tief auf der anderen Seite. Binden Sie einen Knoten. Mit den angehängten Nähten, machen Laufstiche in der dermalen Schicht parallel zum Schnitt, der schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite arbeitet. Binden Sie die Naht und schneiden.
  5. Postoperative Pflege
    1. Erwachen aus der Anästhesie: Schalten Sie das Isofluran aus, sobald der Schnitt geschlossen ist, und lassen Sie das Kaninchen Sauerstoff durch Maske atmen, während Sie auf Anzeichen des Erwachens (z. B. spontane Bewegungen, Augenöffnung und Kaubewegungen auf der Kehlkopfmaske Atemwege) achten. Extubieren Sie das Kaninchen, sobald diese Zeichen bemerkt werden, und liefern Sie Sauerstoff durch Maske und eine warme Decke, bis die Kaninchen wachsam sind und in der Lage sind, unabhängig zu sitzen.
    2. Postoperative Überwachung: Überwachen Sie Kaninchen zweimal täglich für 4 Tage und täglich für weitere 10 Tage nach der Operation. Zur Überwachung, bewertung ihres allgemeinen Zustands, ihrer Nahrungs- und Wasseraufnahme, Urin- und Fäkalienleistung, Schmerzbeurteilung, Gewicht, Vitalzeichen (Herzfrequenz, Atmungsrate) und ihrer chirurgischen Stelle auf der Suche nach Schwellung, Erythem, Entladung oder Dehiszenz.
    3. Postoperative Schmerzkontrolle: Verabreicht Meloxicam täglich (0,2 mg/kg SQ) für 48 h postoperativ und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung. Buprenorphin sofort postoperativ und alle 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) für 24 h und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung verabreichen
    4. Antibiotika (Enrofloxacin 5mg/kg IM) können täglich für sieben Tage postoperativ verabreicht werden, um Eine Wundinfektion zu verhindern, wie von Ihrem Tierarzt empfohlen. Verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (15 ml SQ) zweimal täglich, wie für Dehydrierung und weiche Lebensmittel oder andere Nahrungsergänzungsmittel benötigt werden täglich zur Verfügung gestellt, wie für die Gewichtsabnahme erforderlich.

4. Tumorwachstumsüberwachung

  1. Klinische Überwachung: Überwachen Sie Kaninchen alle 2 Tage auf klinische Anzeichen von Tumorwachstum ab dem postoperativen Tag 14. Klinische Anzeichen von Tumorwachstum können verminderte orale Einnahme, Lethargie, Bauchzärtlichkeit, spürbare Bauchmasse und Verlust von Cekotrophie.
  2. Bildgebung und invasive Überwachung
    1. CT-Bildgebung: Am postoperativen Tag 21-28, vormedikat, anästhesieren und intubieren Kaninchen, wie zuvor in 3.1.1-3.1.2 beschrieben. Positionieren Sie Kaninchen in einer dorsalen Position in einem präklinischen CT-Scanner und erhalten Sie Bilder des Beckens und des Bauches nach der Verabreichung von 10 ml intravenösem Iohexol-Kontrastmittel.
    2. Chirurgische Überwachung: Überführen Sie Kaninchen nach der Bildgebung in den Operationssaal, während sie noch unter Vollnarkose stehen. Positionieren, präparieren und drapieren Kaninchen, wie zuvor in Schritt 3.1.4 beschrieben und führen Sie einen wiederholten Laparotomie-Einschnitt von etwa 1,5 cm Länge durch den vorherigen Schnitt durch. Identifizieren Sie die und die Gebärmutterhörner und sorgfältig auf Tumor zu untersuchen. Schließen Sie den Schnitt und bieten Sie eine postoperative Versorgung, wie zuvor in Schritt 3.5.2-3.5.4 beschrieben.
    3. Verwendung von Kaninchenmodellen: Wenn Kaninchen zum Zeitpunkt der chirurgischen Überwachung Tumore haben, verwenden Sie Kaninchen-Endometriumkrebsmodelle für geplante Experimente. Verwenden Sie Kaninchen, die aus in vivo vermehrten Zellen für zusätzliche Experimente nach der Inokulation erstellt wurden, und verwenden Sie Kaninchenmodelle, die aus kultivierten VX2-Zellen bei etwa 5-6 Wochen nach der Impfung erstellt wurden, um ein langsameres Tumorwachstum zu berücksichtigen. Euthanisieren Sie die Kaninchen nach Tumoren erreichen 1-1,5 cm im Durchmesser (extern mit Sätteln gemessen) mit einer vom Tierarzt zugelassenen Methode. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie die Lebenszeichen einschließlich Herzfrequenz und Atemfrequenz überprüfen. Verbrauchen Sie den Tumor mit sterilen Instrumenten nach der Reinigung des Bereichs mit Betadin-Lösung.

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Ergebnisse

28 Kaninchen wurden für die Erstellung des Endometriumkrebsmodells verwendet. Kaninchen hatten zum Zeitpunkt des Experiments ein Durchschnittsgewicht von 2,83 kg (2,71-3,58 kg). Uterustumoren wuchsen erfolgreich bei 21 Kaninchen für eine Gesamterfolgsrate von 75%. Vor der Aufnahme von Gebärmutternaht in das Protokoll betrug die Erfolgsrate 57% im Vergleich zu 81% nach der Gebärmutternaht. Uterine Nähte wurde dem Protokoll nach dem7. Kaninchen als Reaktion auf die anfängliche ni...

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Diskussion

Hierin haben wir über eine standardisierte chirurgische Methode zur Etablierung eines VX2-Endometriumkrebsmodells berichtet und über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen berichtet, um dieses Modell zu erstellen. Die Tumoraufnahmerate von 75% ist niedriger als die 100% Prozent Rate zuvor in der Literatur berichtet35,37,53,56; jedoch ist die Rate der pathologisch bestätigten Lymphknotenme...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dem Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dem Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Stiftung für Innovation und Prinzessin Margaret Cancer Foundation.

Ich möchte Dr. Marguerite Akens für die Bereitstellung der ersten VX2-Zellen für die Etablierung des ursprünglichen VX2-Modells und der gefrorenen VX2-Tumorblöcke danken. Ich möchte Marco DiGrappa für die Unterstützung bei der Durchführung erster VX2-Zellkulturexperimente und Lili Ding für die Unterstützung bei der VX2-Zellkultur danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
11-Klingen-Skalpell, steril,Einweg-Aspen Surgical (VWR)80094-086
22-Gague-OhrvenenkatheterCDMV14332
3-0 resorbierbares Polyfilament-Nahtmaterial (Polysorb)Covidien356718
3-0 geflochtenes resorbierbares Nahtmaterial (Polysorb)Covidien356718
70uM Zellsieb, einzeln verpackt, NylonFalcon352350
Acepromazin (Atravet)CDMV1047
Betadinseife (Poviodon Jod 7,5%)CDMV4363
Betadine Lösung (Poviodon Jod 10%)UHN Stores457955
BuprenorphinMcGill University
CefazolinUHN stationäre ApothekeKeine Katze # Benötigt
ChlorhexidinlösungCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Kollagen Typ I, 100mm SchalenCorning354450Marke nicht wichtig
Corning BioCoatCellware, Kollagen Typ I, 24-Well-PlattenCorning354408Marke nicht wichtig
Corning BioCoatCellware, Kollagen Typ I, 6-Well-PlattenCorning354400Marke nicht wichtig
Corning Matrigel Basalmembranmatrix, *LDEV-frei, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320Marke nicht wichtig
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injizierbar)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Fötales Rinderserum, qualifiziert, kanadischer Ursprung, 500mlLife Technologies12483020Marke/Quelle nicht wichtig
IsofluranUHN stationäre ApothekeKeine Katze # Benötigt
Isohexol-KontrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0,5%)CDMV104674
Normal KochsalzlösungHausmarke (UofT Medstore)1011
PBSMulticell oder Sigma331-010-CL oder D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)Corning-CellgroCA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenolrot)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Chirurgischer Kleber (Gewebekleber)3M Vetbond14695B
Trypsin (0,25%), Proteomics GradeSigmaT-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0,05%, 100mlWisent Inc325-542-ELMarke nicht wichtig

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