Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Summary

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Abstract

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind eine patientenspezifische, proliferative Zellquelle, die sich in jeden somatischen Zelltyp differenzieren kann. Bipotente endotheliale Vorläufer (EPs), die sich in die Zelltypen differenzieren können, die für die Zusammenbau einer reifen, funktionellen Vaskulatur erforderlich sind, wurden sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet. Diese Zellen wurden jedoch in dreidimensionalen Umgebungen nicht streng evaluiert, und ein quantitatives Maß ihres vaskulogenen Potenzials bleibt schwer fassbar. Hier beiderin skizziert die Erzeugung und Isolierung von iPSC-EPs über fluoreszierend aktivierte Zellsortierung, gefolgt von einer Beschreibung der Verkapselung und Kultur von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen. Diese extrazelluläre Matrix (ECM)-mimitierende Mikroumgebung fördert eine robuste vaskulogene Reaktion; Gefäßnetzwerke bilden sich nach einer Woche Kultur. Die Erstellung einer Rechenpipeline, die Open-Source-Software verwendet, um diese vaskulogene Reaktion zu quantifizieren, wird abgegrenzt. Diese Pipeline wurde speziell entwickelt, um die 3D-Architektur des Kapillarplexus beizubehalten, um die Anzahl der Verzweigungen, Verzweigungspunkte und die gesamte Netzwerklänge mit minimaler Benutzereingabe robust zu identifizieren.

Introduction

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und andere primäre Endothelzelltypen werden seit zwei Jahrzehnten verwendet, um das Keimen von Blutgefäßen und die Entwicklung in vitro¹zu modellieren. Solche Gefäßplattformen versprechen, molekulare und Gewebe-Level-Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beleuchten und können physiologische Einblicke in die Entwicklung von primitiven Gefäßnetzwerken darstellen^2,3. Obwohl das Gebiet der vaskulären Modellierung erhebliche Fortschritte gemacht hat, bleibt ein "Goldstandard"-Assay, der die physiologische Gefäßentwicklung quantitativ mo....

Protocol

1. Vorbereitung von Kulturmedien und Beschichtungslösungen

1. Zur Herstellung einer vitronectin-Beschichtungslösung ist vitronectin 1:100 in der phosphatgepufferten Saline (DPBS) von Dulbecco verdünnt.
   VORSICHT: Nach der Verdünnung wird nicht empfohlen, diese Lösung für die zukünftige Verwendung zu speichern.
2. Bei Aufnahme von phenolrot-frei, Wachstumsfaktor-reduzierten gelatinösen Protein-Mischung (siehe Tabelle der Materialien) vom Hersteller, tauen auf Eis bei 4 °C, bis die Mischung transparent und flüssig ist. Halten Sie das Gemisch in einer laminaren Durchflusshaube auf Eis, Pipette 75 l des Gemischs in ein 1,8 ml Mikrozentrifu....

Results

Nach der Differenzierung (Abbildung1), FACS und Verkapselung von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen bleiben die Zellen in der Regel 24 h gerundet, bevor sie mit der Migration beginnen und erste Lumen bilden. Nach ca. 6 Tagen Kultur wird ein primitiver Kapillarplexus im Hydrogel sichtbar sein, wenn er mit der Hellfeldmikroskopie betrachtet wird (Abbildung 2). Nach der Abbildung der fixierten, mit Zell beladenen Hydrogele auf einem kon.......

Discussion

Dieses Protokoll bezieht die langfristige Zellkultur in drei Arten von Zellkulturmedien ein: E8, LaSR Basal und EGM-2. Daher sollte sehr darauf geachtet werden, alle Materialien angemessen zu sterilisieren. Darüber hinaus sollten Labormäntel und ethanolgereinigte Handschuhe immer getragen werden, wenn sie in der laminaren Durchflusshaube des Labors arbeiten. Es wird empfohlen, häufig auf Mykoplasmenkontamination zu testen; Wenn während der iPSC-Kultur eine große Menge an Schmutz beobachtet wird oder ein plötzlicher Rückg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Eine flache Gewebekulturplatte mit Glasboden und Seitenwänden ermöglicht eine einfache konfokale Bildgebung
96 Well, Mikroplatte mit rundem Boden, extrem niedrig haftendbar, steril	Corning	7007	Verhindert die Bindung von zellbeladenen Kollagen-Hydrogelen an die Zellkulturschale
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Sanfte Lösung zur Zellablösung; baut extrazelluläre Epitope nicht ab, die für FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Das Basismedium für die iPSC-EP-Differenzierung.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Wasseraufbereitungssystem; andere können leicht substituiert werden
Rinderserumalbuminlösung, 7,5 % in DPBS, sterilfiltriert, BioXtra, geeignet für Zellkulturen	Fisher Scientific	A8412	Zur Erhaltung der Lebensfähigkeit von Zellen bei der Sortierung von FACs
CD34-PE, human (Klon: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antikörper zur FAC-Isolierung von iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induziert die Bildung von Mesoderm aus pluripotenten Stammzellen
Kollagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Hauptbestandteil der 3D-Mikroumgebung
Konische Zentrifugenröhrchen (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Wird zum Lagern und Mischen relativ großer Mengen an Reagenzien und Zellkulturmedien
verwendetDAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Zur Gegenfärbung und Visualisierung von Zellkernen
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Zur Verdünnung von Matrigel und zum Auftauen von pluripotenten Stammzellen
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Zum Waschen von Monolayer-Kulturen
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Zur Passage von pluripotenten Stammzellkolonien und zur Verhinderung der Zellaggregation bei der Sortierung von FACs
Endothelzellwachstumsmedium 2	PromoCell	C-22011	Fördert die Lebensfähigkeit und Proliferation von Endothelzellen
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Zur Erhaltung von pluripotenten Stammzellen
Glycin, BioUltra, für die Molekularbiologie, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralisiert restliches Detergens
L-Ascorbinsäure, 2-phosphat, Sesquimagnesiumsalzhydrat, >=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Bestandteil des iPSC-EP-Differenzierungsmediums
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multiparadigmen-numerische Rechenumgebung (an den meisten akademischen Einrichtungen kostenlos erhältlich)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Maus 10 mL (gallertartige Proteinmischung)	Fisher	Scientific 356231	Verdünnt in DMEM/F12 zur Beschichtung von Platten für die iPSC-EP-Differenzierung
Medium-199 10X	Thermo	Fisher Scientific 1825015	Wird verwendet, um die endgültige Hydrogel-Osmolarität und den pH-Wert
Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 ml)	VWR	87003-294	Speichert kleine Mengen an Reagenzien
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	Der Hauptbestandteil der Immunfärbelösungen
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotikum, das nach der Sortierung verwendet wird, um mögliche Kontaminationen von FACS-Instrumenten zu entfernen
Rekombinantes humanes VEGF 165 Protein	R& D Systems	293-VE	Mitogen, das die Proliferation von Endothelzellen und die Tubulogenese stimuliert
Rhodamin-Phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	Zur Identifizierung der F-Aktin-Ablagerung und damit zur Umriss der Grenzen der Gefäßnetzwerke
Triton X-100 (nichtionisches Tensid)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergens zur sanften Permeabilisierung der Zellen
Tween-20 (emulgierendes Reagenz)	Fisher Scientific	BP337	Erhöht die Bindungsspezifität der zugesetzten Antikörper
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Zur Identifizierung von 3D-Endothellumen in Kollagen-Hydrogelen
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Zur Erhaltung von pluripotenten Stammzellen
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Bewahrt die Lebensfähigkeit pluripotenter Stammzellen und iPSC-EP bei dissoziierter und erneuter Aussaat