Methodenartikel

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

DOI:

10.3791/59353

⸱

9. Mai 2019

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieses Protokolls ist es, Proteinexpressionsänderungen auf zellzyklusabhängige Weise mithilfe einzelner Zellen zu erkennen und zu quantifizieren, die von der Epidermis der Maushaut isoliert sind. Es gibt sieben wichtige Schritte: Trennung der Epidermis von der Dermis, Verdauung der Epidermis, Färbung der epidermalen Zellpopulationen mit Cisplatin, Proben-Barcoding, Färbung mit metallmarkierten Antikörpern für Zellzyklusmarker und Proteine von Interesse, Detektion von metallmarkierten Antikörpern durch Massenzytometrie und die Analyse der Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber histologischen Methoden ist das Potenzial, das Expressionsmuster von >40 verschiedenen Markern in einer einzelnen Zelle in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu assayen. Dieser Ansatz ermöglicht auch die multivariate Korrelationsanalyse der Proteinexpression, die quantifizierbarer ist als histologische/bildgebende Verfahren. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass eine Suspension einzelner Zellen erforderlich ist, was zum Verlust von Standortinformationen führt, die durch die Färbung von Gewebeabschnitten bereitgestellt werden. Dieser Ansatz kann auch die Aufnahme zusätzlicher Marker erfordern, um verschiedene Zelltypen in Rohzellsuspensionen zu identifizieren. Die Anwendung dieses Protokolls zeigt sich in der Analyse von hyperplastischen Hautkrankheitsmodellen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Analyse bestimmter Untertypen von Zellen (z. B. Stammzellen) durch Zugabe von linienspezifischen Antikörpern angepasst werden. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von Hautzellen in anderen Versuchsarten angepasst werden.

Einleitung

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Die Korrelation der Genexpression mit den Zellzyklusstadien bleibt eine Herausforderung bei der Analyse von Tiermodellen hyperplastischer Krankheiten wie Krebs. Ein Teil dieser Herausforderung ist die Ko-Detektion von Proteinen von Interesse (POI) mit Markern der Proliferation. Proliferative Zellen können in verschiedenen Zellzyklusphasen einschließlich G1, S, G2 und M gefunden werden. Ki67 ist einer der am häufigsten verwendeten Marker der Proliferation und wird in allen Phasen des Zellzyklus exprimiert. Es wurde ausgiebig in der Analyse von menschlichen und Mausgewebe1,2,3verwendet. Jedoch, wie andere allgemeine Proliferation Marker, Ki67 erkennt nicht einzelne Zellzyklusphasen. Ein präziserer Ansatz nutzt die Einbeziehung von Thymidin-Nukleotid-Analogen wie Bromodeoxyuridin (BrdU) in Zellen, die ihr Genom aktiv replizieren (d.h. S-Phase)4,5. Ein Nachteil der Verwendung von Nukleotid-Analoga ist die Notwendigkeit, sie lebenden Tieren Stunden vor der Analyse zu verabreichen. Ki67 und BrdU werden häufig auf festen Gewebeabschnitten durch die Verwendung von Antikörpern nachgewiesen. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Position von POIs innerhalb der Gewebearchitektur (z. B. der Basalschicht der Hautepidermis) ermittelt werden kann. Dieser Ansatz erfordert auch keine Gewebedissoziation, die zu Veränderungen in der Genexpression führen kann. Ein Nachteil ist, dass die Gewebefixierung oder die Verarbeitung des Gewebes für OCT eingefroren oder Paraffin-Sektion kann Antikörper-Ziele (d. h. Antigene) okkludieren. Die Rückgewinnung von Antigenen erfordert in der Regel Wärme- oder Gewebeverdauung. Die Quantifizierung der Färbeintensitäten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen. Dies ist auf Variationen in Färbung, Schnittdicke, Signalerkennung und Experimentierverzerrung zurückzuführen. Darüber hinaus kann eine begrenzte Anzahl von Markern gleichzeitig in den meisten typischen Labor-Setups nachgewiesen werden. Doch neuere Multiplex-Färbungsansätze versprechen, diese Einschränkungen zu überwinden; Beispiele sind bildgebende Massenzytometrie und Tyramid-Signalverstärkung6,7.

Die Durchflusszytometrie ist eine weitere leistungsstarke Technologie zur Erkennung von sich ausbreitenden Zellen. Es ermöglicht die Multiplex-Erkennung von Markern in den gleichen Zellen, erfordert aber Gewebedissoziation für die meisten nicht-hämatopoetischen Zelltypen. Die Analyse von vermehrenden Zellen erfolgt routinemäßig durch die Verwendung von Farbstoffen, die DNA binden (z.B. Propidium Iodid (PI))8. Die Durchflusszytometrie ermöglicht auch eine genauere Bestimmung der Zellzyklusphasen in Verbindung mit dem Nachweis der BrdU-Inkorporation9. Obwohl ein leistungsstarker Ansatz, BrdU / PI Durchflusszytometrie hat seine Nachteile. Es ist nicht in der Lage, die G2/M- und G0/G1-Phasen ohne die Einbeziehung phasenspezifischer Antikörper zu lösen. Die Anzahl der Antikörper, die verwendet werden können, wird jedoch durch zelluläre Autofluoreszenz, spektrales Ausstrahlung von Fluorophoremissionen und die Verwendung von Kompensationskontrollen begrenzt. Diese Einschränkung markiert es schwieriger und mühsamer, die Expression von Zellzyklusmarkern mit POIs zu erkennen. Ein leichterer Ansatz ist die Verwendung von Massenzytometrie10,11. Diese Technologie verwendet metallkonjugierte Antikörper, die ein schmaleres Detektionsspektrum haben. Sobald Zellen mit metallgetaggten Antikörpern gefärbt sind, werden sie verdampft und die Metalle durch Cytometrie-Zeit-of-Flight (CyTOF)-Massenspektrometrie nachgewiesen. Aufgrund dieser Eigenschaften ermöglicht die Massenzytometrie die Multiplexerkennung von >40 verschiedenen Markern mit vorhandenen Plattformen10,11. Darüber hinaus ist es möglich, Barcode-Proben mit Metallen, die in der Einsparung von wertvollen Antikörpern führen, während Die Proben-zu-Probe-Färbungvariabilität reduziert wird. Auf der anderen Seite hat die Massenzytometrie mehrere Nachteile. Es gibt eine begrenzte Anzahl von handelsüblichen metallmarkierten Antikörpern für nicht blutbildende Zellen. Die Quantifizierung des DNA-Gehalts ist im Vergleich zur Verwendung fluoreszierender DNA-Farbstoffe weniger empfindlich, und die Massenzytometrie hat einen reduzierten Dynamikbereich der Signaldetektion im Vergleich zur Fluoreszenzflusszytometrie.

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Zellzyklusdynamik von neu isolierten Keratinozyten (KCs) aus der Maushaut zu analysieren und die zellzyklusspezifische Proteinexpression in diesen Zellen mittels Massenzytometrie zu charakterisieren. Dieses Protokoll kann auch mit kultivierten Zellen verwendet oder an andere Zelltypen angepasst werden.

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Protokoll

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Das Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigte die in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche.

1. Vorbereitungen

  1. Entwerfen Sie eine mit Metall markierte Antikörperplatte. Nutzen Sie die kostenlose Online-Panel-Design-Software12 und enthalten 127IododeoxyUridin (IdU), 164Dy (Dysprosium) mit Anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) Phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) und 150 Nd (Neodym)-pRETINOBLASTOMA ProteinSer807/811 (pRB)13. Fügen Sie zusätzliche metallmarkierte Antikörper hinzu, die sich in ihrem Kanalsignal14nicht überlappen.
  2. Bereiten Sie eine IdU-Lagerlösung vor. IdU-Pulver bei 10 mg/ml in 0,1 N NaOH bei 60 °C auflösen. Aliquot IdU-Lagerlösung in Mikrozentrifugenröhren und gefrieren bei -20 °C zur Langzeitlagerung.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der IdU-Lösung unmittelbar vor Dem Gebrauch auf 7,5 mit 12 N HCl ein. Testen Sie mit einem pH-Streifen auf einem Ablage-Aliquot, um sicherzustellen, dass die Lösung bei pH 7,5 liegt.
      HINWEIS: Längere Zeit (>5 min) von IdU bei pH 7,5 führt zu Niederschlägen und ein neuer Aliquot von IdU ist erforderlich, wenn dies geschieht.
    2. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) und arbeiten Sie in einem Sicherheitsschrank, wenn Sie Mithaben von NaOH- oder HCl-Lösungen verwenden.
  3. Bereiten Sie eine 2x Paraformaldehyd (PFA) Befestigungslösung vor. Kombinieren Sie 5 ml 10x PBS (pH 7,5) und 1 ml 16% PFA mit 44 ml reinem molekularem Grad dH2O (3,2% Endkonzentration).
    HINWEIS: Ein PFA-Bestand kann wie bisherveröffentlicht 15 erstellt werden oder 16% Aktien ohne kontaminierende Metalle kaufen.
    1. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem Sicherheitsschrank, wenn SIE PFA-Pulver und Lösungen handhaben.
  4. Barium (Ba2+) frei 1x PBS vorbereiten, indem Sie 5 ml metallfreie 10x PBS (pH 7,5) mit 45 ml reinem molekularem dH2O kombinieren.
    HINWEIS: Die Qualität von PBS und anderen Reagenzien ist sehr wichtig, um eine Kontamination von Metallen zu vermeiden, die bei der Analyse von zytometrischen Massendaten Hintergrundgeräusche verursachen können.
  5. Bereiten Sie eine 100 mM Cisplatin-Lagerlösung vor. 300,5 mg Cisplatinpulver in 10 ml DMSO auflösen. In Aliquots bei -80 °C lagern. Bereiten Sie eine 10 mM Cisplatin-Arbeitslösung für Experimente vor, die über 1 d verwendet werden.
  6. Epidermis/Dermis-Trennungslösungen vorbereiten. Bereiten Sie eine 20x Dispase-Stammlösung vor, indem Sie 30 mg in 1 ml HBSS oder PBS auflösen. Filter durch einen 0,22 m Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 °C lagern. Bereiten Sie eine 1x Typ IV Kollagennase-Lagerlösung bei 1 mg/ml in HBSS vor, filtern Sie sie durch einen 0,22-mm-Filter und lagern Sie Aliquots bei -20 °C.

2. Kennzeichnung der S-Phase durch IdU-Eingemeindung

  1. Wiegen Sie Mäuse. Verwenden Sie P1-P3 neonatale Welpen oder 8-10 Wochen alte erwachsene Mäuse und männliche oder weibliche Mäuse aus einem C57BL/6, FvB oder 129 Hintergründen. Bestimmen Sie eine Dosis bei 0,1 mg IdU (pH 7,5)/g Körpergewicht. Eine 25 g-Maus benötigt beispielsweise 0,25 ml IdU.
  2. Verabreichen Sie die Dosis von IdU durch eine intraperitoneale Injektion und warten Sie 2 h, bevor Sie Zellen ernten. Verwenden Sie eine Tuberkulinspritze, um neonatale Welpen zu injizieren.
    HINWEIS: Eine Dosis von 2 mg/ml IdU kann mit Gewebekulturzellen mit einer Inkubation von 1 h bei 37 °C vor der Ernte und Etikettierung für Massenzytometrie verwendet werden.

3. Isolierung von Zellen zur Kennzeichnung

  1. Tauen Dispase und Kollagenase Lagerlösungen. Verdünnen Sie die 20x Dispase-Stammlösung auf 1x (1,5 mg/ml) in sterilen HBSS oder PBS. Auf Eis bleiben, bis es einsatzbereit ist.
  2. Kombinieren Sie 2 Bände Dispase mit 1 Volumen Kollagenase in einem Gesamtvolumen, das die Haut frei schweben lässt. Zum Beispiel kann die Verdauung von 5 neonatalen Maushäuten auf 8 ml 1x Dispase mit 4 ml Kollagenase in einer 100 mm Petrischale schweben.
  3. Befolgen Sie zugelassene Methoden zur Einschläferne von Versuchsmäusen (z. B. Isofluran-Überdosierung/Zehen-Pinch-Check oder CO2-Inhalation/Zervixdislokation). Reinigen Sie die erwachsene Ohrhaut mit einer Jodlösung (siehe Materialtabelle)und spülen Sie sie mit sterilem Wasser ab, wenn isolierte Zellen für die Gewebekultur verwendet werden sollen.
  4. Chirurgische entfernen Sie das Ohr an der Basis (Abbildung 1A). Spülen Sie die Ohren in sterilem PBS, wenn isolierte Zellen für die Gewebekultur verwendet werden sollen. Auf eine trockene 100 mm Petrischale geben.
  5. Trennen Sie sorgfältig vordervon der hinteren Haut, indem Sie zunächst eine Tasche in der Mitte oder am Rand des Schnittbereichs mit feinen Zangen erstellen und die beiden Hautklappen auseinander ziehen ( Abbildung 1B-D). Fahren Sie sowohl mit den vorderen als auch mit den hinteren Skins fort.
    HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur Zerlegung der neonatalen Maushaut werden von Litchi et al.16 Bereitgestellt. Haut: Das Haar ist auf der Epidermisseite sichtbar, während die Dermis ein gelatinöses Aussehen hat.
  6. Legen Sie vorsichtig die vorderen und hinteren Häute des Ohres mit der Dermisseite der Haut, die die Dispase/Kollagenase-Lösung berührt ( Abbildung 1E). Verwenden Sie 1 ml sowohl für die vordere als auch für die hintere Haut eines einzelnen Ohres pro Brunnen einer 12 Brunnenkulturplatte. Bei 37 °C für 1 h inkubieren. Alternativ schwimmen Skins auf 1x Dispaselösung bei 4 °C für 16-18 h.3
    HINWEIS: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik, wenn Zellen kultiviert werden sollen.
  7. Legen Sie die verdaute Haut mit der Epidermisseite, die die Oberfläche einer sauberen Petrischale berührt. Glätten Sie die Haut und schieben Sie die Dermis vorsichtig von der Epidermis, indem Sie in einem kreisförmigen Muster von der Mitte bis zu den Rändern arbeiten.
  8. Entsorgen Sie die Dermis oder verdauen Sie sie weiter, um Fibroblasten für die Gewebekultur oder Analyse zu befreien16.
    HINWEIS: Die Dermis wird dunkler aussehen und eine gelatinöse und klebrige Zusammensetzung haben. Die Dermis sollte leicht abgehen. Ein Versagen oder Schwierigkeiten bei der Entfernung der Dermis deutet auf eine unzureichende Gewebeverdauung hin. Eine erweiterte Inkubation im Verdauungspuffer verringert jedoch die Zelllebensfähigkeit. Die Epidermis bleibt auf der Petrischale und hat ein gebleichtes Aussehen.
  9. Heben Sie die Epidermis vorsichtig ab, indem Sie sie an den Rändern greifen und von der Oberfläche der Petrischale schälen. Die Epidermis vorsichtig auf vorgewärmte Zellablösung (siehe Materialtabelle) für 5 min bei 37 °C oder 20 min bei RT. Verwenden Sie 500 l Zellablösung für 2 erwachsene Ohrepidermisen pro Bohrung einer 12-Well-Kulturplatte und verwenden Sie 750 l Zellablösung Lösung für eine einzelne neonatale Epidermis pro Brunnen einer 6-Well-Kulturplatte.
  10. Greifen Sie die Epidermis mit sterilen Zangen und Peeling, indem Sie die Epidermis gegen den Boden der Schale ziehen, um Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie 1 ml DMEM mit 1% FBS (0,01 ml) hinzu und durchgeben Sie ein 40-m-Zellensieb in ein Sammelrohr. Spülen Sie gut mit einem zusätzlichen 2 ml DMEM und fügen Sie die Zellsuspension hinzu.
  11. Zentrifuge bei 120 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen.
  12. Zellpellet in 1-2 ml DMEM mit 1% FBS resuspendieren. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und % der Lebenden Zellen mit Trypan Blue und einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zählgerät. Pelletzellen, wie in Schritt 3.11 beschrieben.
    HINWEIS: Zellen können nach Schritt 3.12 in geeigneten Gewebekulturmedien kultiviert werden. 17

4. Cisplatin-Kennzeichnung zur Bestimmung lebender/toter Zellen

  1. 1-3 x 106 Zellen pro 1 ml DMEM mit 25 M Cisplatin (2,5 l Lager/ml) wieder aufhängen. 1 min inkubieren und durch Pipettieren mit gleichem FBS-Volumen (z.B. 1 ml) abschrecken.
  2. Zentrifuge bei 120 x g für 5 min. Dekanatsüberstand in ein Becherglas mit verdünnten Bleich- und Inverkübelrohren, um die Restlösung auf ein Papiertuch abzutropfen. Tippen Sie sanft, um die auf Pellet und Seitenwand des Rohres verbleibende Lösung zu befreien.
  3. Zellpellet in 2 ml Ba+2-freier PBS aufsetzen. Pelletzellen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Zellen zu fixieren, wenn sie nicht sofort gebeizt werden können.

5. Fixierung von Cisplatin-markierten Zellen (optional)

  1. 1-3 x 106 cisplatin markierte Zellen in 1 ml Ba+2-freier PBS wieder aufsetzen. Wirbelzellen unter kontinuierlicher geringer Leistung und fügen Tropfen1 ml (1 Volumen) des 2x PFA-Fixationspuffers hinzu. Inkubieren Sie bei RT für 10 min auf einer Schaukelplattform.
  2. Pelletzellen wie in Schritt 4.2 beschrieben, aber Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
  3. Waschen Sie Zellen mit 2 ml Ba+2-freier PBS- und Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 5.3 einmal.
  4. Das Pellet in 2 ml Ba+2-frei PBS wieder aufhängen. Bei 4°C für <3 d lagern. FBS zu 3% (z. B. 0,3 ml FBS/ml der Zellen) des Gesamtvolumens hinzufügen, wenn längere >3 d gespeichert werden, dann mischen und bei -80 °C einfrieren.
    HINWEIS: Die Fixierung kann die Erkennung bestimmter Epitope beeinflussen. Die Auswirkungen der Fixierung auf Antikörpersignale müssen empirisch bestimmt werden.

6. Barkodierung von Proben (optional, aber empfohlen)

  1. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben, und dann 1-3 x 106 Zellen in 1 ml 1x Fixationspuffer (siehe Tabelle der Materialien) wieder aussetzen. Inkubieren Sie bei RT für 10 min. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben.
  2. Waschen Sie Zellen mit 1 ml Barcode-Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle). Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 6.2 einmal.
  3. Fügen Sie 100 L Barcode-Permeabilisierungspuffer zu Barcodes hinzu (siehe Tabelle der Materialien)18 und mischen Sie sofort, während die Zellen aus Schritt 6.2 pelletieren.
  4. Setzen Sie das Zellpellet in 800 l Barcode-Permeabilisationspuffer wieder auf. Fügen Sie Barcode-Lösung zu Zellen, mischen und inkubieren bei RT für 30 min. Pellet-Zellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Waschen Sie Zellen in 2 ml Zellfärbepuffer (siehe Materialtabelle)und pellet wieder.
    HINWEIS: Bis zu 20 Proben können mit verschiedenen Kombinationen von Palladiummetallen18beschriftet werden. Andere Barcode-Strategien werden an anderer Stelle beschrieben15.

7. Kennzeichnung von Zellen für Massenzytometrie

  1. 1-3 x 106 Zellen in 1 ml Kernantigen-Färbungspuffer-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) wieder aufsetzen Kombinieren Sie Proben in einem einzigen Rohr für nachfolgende Schritte, wenn Sie Barcode-Proben verwenden. Inkubieren Bei RT für 30 min. Pellet wie in Schritt 5.2 beschrieben.
  2. 1-3 x 106 Zellen in 2 ml Kernantigen-Färbungspermeabilisationspuffer wieder aufsetzen (siehe Materialtabelle). Skalierung bei Bedarf. Verwenden Sie beispielsweise 6 ml Puffer für 10 kombinierte Proben mit einer Zellanzahl von 9 x 106 Zellen. Pellet, wie in Schritt 5.2 beschrieben.
  3. Wiederholen Sie Schritt 7.2. Wirbeln Sie das Zellpellet im Restvolumen, das in der Röhre verbleibt, sanft.
  4. Fügen Sie 50 l intrazellulären Antikörpercocktail pro 1-3 x 106 Zellen hinzu. Skalierung bei Bedarf. Verwenden Sie z. B. 150 l des Antikörpercocktails für 10 kombinierte Proben mit einer Zellzahl von 9 x 106 Zellen. Mischen und inkubieren bei RT für 45 min. Fügen Sie 2 ml Zellfärbung Puffer und Pellet wie in Schritt 5.2 beschrieben beschrieben.
  5. 1-3 x 10 6-Zellen-Pellet in 2 ml Zellfärbungspuffer wieder aufhängen. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 7.5 einmal.
    HINWEIS: Andere Pufferlösungen können zur Färbung der extrazellulären Membran oder zytoplasmatischen Marker verwendet werden, und Experimentatoren müssen möglicherweise die Färbung optimieren, wenn Epitope an verschiedenen zellulären Standorten erkannt werden müssen. Zellen können auch in PFA nach Schritt 7.5 fixiert werden, wenn lebende Zellen für die Färbung verwendet werden.
  6. 1-3 x 106 Zellen in 1 ml Interkalationslösung aufbewahren und 1-3 d bei 4 °C lagern.
    1. Speichern Sie Zellen bei -80 °C in DMSO, die die Lösung für >3 d. Pelletzellen enthalten, wie in Schritt 5.2 beschrieben, wenn zellen in Interkalationslösung sind. Pellet (1-3 x 106 Zellen) in 1 ml Zellfärbepuffer und Pelletzellen wie in Schritt 5.2 beschrieben resuspendieren. Pellet in 1 ml 10% DMSO/90% FBS19aufsetzen, in einen Isopropanol-Gefrierbehälter geben und bei -80 °C lagern.
  7. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Waschen Sie 1-3 x 106 Zellen mit 2 ml Zellfärbungspuffer, Pelletierung, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Führen Sie zwei zusätzliche Wähen mit 2 ml Wasser durch, wobei das Pelleten wie in Schritt 5.2 beschrieben beschrieben wird.
  8. Verdünnen Sie EQ-Kalibrierperlen 1:9 in Wasser (Lagerlösung bei 3,3 x 105 Perlen/ml).
  9. Setzen Sie das Zellpellet in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml mit verdünnter EQ-Perlenlösung wieder auf. Filtern Sie Zellen durch 35 m Siebkappendurchflussrohre.
  10. Führen Sie Proben auf dem Massenzytometer aus und erfassen Sie Daten. Die Daten werden im Flow Cytometry Standard (FCS)-Dateiformat hinterlegt.

8. Verarbeitung und Analyse von Massenzytometrie-Datendateien

  1. Normalisieren Sie FCS-Dateien. Nutzen Sie ein kostenloses Programm, das unter https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20 verfügbar ist
  2. Deconvolute Barcode-FCS-Dateien. Trennen Sie die gepoolte Barcode-Population in separate Barcode-Dateien mit einem kostenlosen Programm, das um18 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest verfügbar ist.
  3. Analysieren Sie normalisierte FCS-Dateien. Verwenden Sie kommerzielle21,22 oder Freeware-Programme (siehe web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

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Ergebnisse

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Tabelle 1 zeigt die erwarteten Zellerträge und lebensfähigkeit von erwachsenen Mausohren (Abbildung 1) und neonataler Haut unter nichtpathologischen Bedingungen. Die Tabelle zeigt auch repräsentative Daten von Tieren mit gemischtem C57/126-Hintergrund. Es wird erwartet, dass die Haut anderer Stämme zu ähnlichen Zellerträgen und Viabilitäten führen würde. Die ungefähre Ausbeute hängt von der Oberfläche der Haut ab und zeigt an, dass neonatale ...

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Diskussion

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Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll kann in ca. 8 h abgeschlossen werden. Das Endergebnis ist eine Suspension von Zellen, die in KCs angereichert sind und auf zellzyklusabhängige Weise auf Proteinexpression analysiert werden können. Mehrere frühere Studien haben Methoden skizziert, um KCs von der menschlichen und Maushaut zu isolieren16,25. Diese Studien umfassen auch Protokolle zur Isolierung von KCs für die Durchflusszytometrie26

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unterstützung für diese Arbeit kam vom Department of Dermatology, dem Gates Center for Regenerative Medicine an der University of Colorado und der University of Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Die Autoren würdigen das UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and Support Grant (NCI P30 CA046934) für den Betrieb des Massenzytometers und sind Karen Helm und Christine Childs im Kern für ihre fachkundige Beratung zu Strömung und zytometrischer Masse dankbar. Techniken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlatteCell Treat229512
InterkalatorlösungFluidigm201192A125 & micro; M - Ir-Interkalator-Lösung
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences30525-89-416 %  PFA
Siebkappe DurchflussschläucheFisher/Corning35223535 µ M Porengröße 
ZellsiebFisher2236354740 μ M Porengröße 
ZellzerlegungCELLnTECCnT-ACCUTASE-100Accutase
JodlösungThermoFisher/Purdue67618-151-17Betadin 7,5%-Jod chirurgisches Peeling
Barcode-PermeabilisierungspufferFluidigm201060Cell-ID 20-Plex PD Barcodes
Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH-StreifenEMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01Dulbecco' s Modified Eagle Media
Feine PinzetteDumont & Fils0109-5-PODumostar #5
Gebogene PräzisionszangeDumont & Fils0109-7-PODumostar #7
KalibrierperlenFluidigm201078EQ Vier-Elemente-Kalibrierperlen
HBSSGibco14175-095Hank's Balanced Salt Solution
WaterFisherSH30538.03Hyclone Molecular Biology Grade
Wasser Ioddesoxyuridin&nbsp; SigmaI7125IdU
Kryo-FläschchenThermoFisher366656PKInnengewinde
ZellfärbepufferFluidigm201068Maxpar Zellfärbepuffer
Fix & DauerwellenpufferFluidigm201067Maxpar Fix & Dauerwellenpuffer
Fix I PufferFluidigm201065Maxpar Fix I Puffer
Phosphatgepufferte KochsalzlösungRocklandMB-008Metallfrei 10x PBS
Isopropanol-GefrierbehälterThermoFisher5100-0001Mr.Frosty
NatriumhydroxidFisherBP359-500NaOH
PetrischaleKord-Valmark2900Zur Verfügung gestellt von Genesee 32-107 
15 mL konischOlympus/Genesee28-101
50 mL konischOlympus/Genesee28-106
6-Well-PlatteCell Treat229506
CisplatinSigma479306
Dispase IISigma/Roche4942078001
DMSOSigmaD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
SalzsäureFisherA144-212
Nukleare Antigenfärbung   PermeabilisierungspufferFluidigm201063
Nukleärer Antigen FärbepufferFluidigm201063
TrypanblauSigmaT8154
TuberkulinspritzeBD309626
Kollagenase Typ IVWorthington BioscienceCLSS-4
Lösung für die

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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