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Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

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Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Abstract

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Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie untersucht die Position und Bewegungen einzelner Moleküle in lebenden Zellen mit einer räumlichen und Millisekunden-Zeitlichen Auflösung von Zehnmetern Nanometer. Diese Fähigkeiten machen die Einmolekül-Lokalisationsmikroskopie ideal geeignet, um biologische Funktionen auf molekularer Ebene in physiologisch relevanten Umgebungen zu untersuchen. Hier zeigen wir ein integriertes Protokoll zur Erfassung und Verarbeitung/Analyse von Single-Molekül-Tracking-Daten, um die verschiedenen diffusiven Zustände zu extrahieren, die ein Protein von Interesse aufweisen kann. Diese Informationen können verwendet werden, um molekulare komplexe Bildung in lebenden Zellen zu quantifizieren. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines kamerabasierten 3D-Einzelmolekül-Lokalisierungsexperiments sowie der nachfolgenden Datenverarbeitungsschritte, die die Bahnen einzelner Moleküle ergeben. Diese Bahnen werden dann mit hilfe eines numerischen Analyserahmens analysiert, um die vorherrschenden diffusiven Zustände der fluoreszierend markierten Moleküle und die relative Häufigkeit dieser Zustände zu extrahieren. Das Analyseframework basiert auf stochastischen Simulationen intrazellulärer Brownianer Diffusionsbahnen, die durch eine beliebige Zellgeometrie räumlich begrenzt sind. Basierend auf den simulierten Flugbahnen werden rohe Einzelmolekülbilder auf die gleiche Weise erzeugt und analysiert wie experimentelle Bilder. Auf diese Weise werden experimentelle Präzisions- und Genauigkeitseinschränkungen, die experimentell schwer zu kalibrieren sind, explizit in den Analyse-Workflow integriert. Der Diffusionskoeffizient und die relativen Bevölkerungsfraktionen der vorherrschenden diffusiven Zustände werden bestimmt, indem die Verteilungen der experimentellen Werte mithilfe linearer Kombinationen simulierter Verteilungen einzupassen sind. Wir demonstrieren den Nutzen unseres Protokolls, indem wir die diffusiven Zustände eines Proteins auflösen, das bei der Bildung von homo- und heterooligomeren Komplexen im Zytosol eines bakteriellen Erregers unterschiedliche diffusive Zustände aufweist.

Introduction

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Die Untersuchung des diffusiven Verhaltens von Biomolekülen gibt Einblick in ihre biologischen Funktionen. Fluoreszenzmikroskopie-basierte Techniken sind zu wertvollen Werkzeugen für die Beobachtung von Biomolekülen in ihrer nativen Zellumgebung geworden. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)1 bieten ensemble-gemittelte diffusive Verhaltensweisen. Umgekehrt ermöglicht die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Beobachtung einzelner fluoreszierend markierter Moleküle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung2,3,

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Protocol

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1. Doppelhelix Punkt-Spread-Funktionskalibrierung

HINWEIS: Die in diesem und den folgenden Abschnitten beschriebenen Bilder werden mit einem kundenspezifischen invertierten Fluoreszenzmikroskop, wie in Rocha et al.23beschrieben, erstellt. Das gleiche Verfahren gilt für verschiedene Mikroskop-Implementierungen für die Ein-Molekül-Lokalisierung und Tracking-Mikroskopie2,3,4. Alle in diesem Artikel beschriebenen Software zur Bildaufnahme und -verarbeitung ist verfügbar (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-....

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Results

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Unter den hier beschriebenen Experimentellen Bedingungen (20.000 Frames, Trajektollänge mindestens 4 Lokalisationen) und je nach Expressionsniveau der fluoreszierend markierten Fusionsproteine, ergeben ca. 200-3.000 Lokalisationen 10-150 Pro Zelle können Flugbahnen erzeugt werden (Abbildung 2a,b). Eine große Anzahl von Flugbahnen ist notwendig, um eine gut beprobte Verteilung der scheinbaren Diffusionskoeffizienten zu erzeugen. Die Größe des .......

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Discussion

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Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Anwendung des vorgestellten Protokolls ist es, sicherzustellen, dass einmolekulare Signale gut voneinander getrennt sind (d.h. sie müssen räumlich und zeitlich spärlich sein (Ergänzende Mov. 1)). Wenn es mehr als ein Fluoreszenzmolekül in einer Zelle gleichzeitig gibt, dann könnte die Lokalisierung fälschlicherweise der Flugbahn eines anderen Moleküls zugeordnet werden. Dies wird als Verknüpfungsproblem30bezeichnet. Experimentelle Bed.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken Alecia Achimovich und Ting Yan für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Ed Hall, Senior Staff Scientist in der Advanced Research Computing Services Gruppe an der University of Virginia, für die Hilfe bei der Einrichtung der Optimierungsroutinen, die bei dieser Arbeit verwendet werden. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der University of Virginia bereitgestellt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,6-DiaminopimelsäureChem Impex International5411Notwendig für das Wachstum von Y. enterocolitica verwendeten Zellen.
4f ObjektiveThorlabsAC508-080-Af = 80mm, 2"
514 nm LaserCoherentGenesis MX514 MTMZur Verwendung zur Fluoreszenzanregung
Agarose Inivtrogen16520100Wird zur Herstellung von Gel-Pads verwendet, um flüssige Bakterienproben auf das Mikroskop zu montieren.
AmmoniumchloridSigma AldrichA9434M2G Inhaltsstoff.
BandpassfilterChromaET510/bpAnregungsweg.
Gehirn Herz InfusionSigma Aldrich53286Wachstumsmedien für Y. enterocolitica.
CalciumchloridSigma AldrichM2G-Inhaltsstoff.
KameraImaging SourceDMK 23UP031Kamera für Phasenkontrast-Bildgebung.
Dielektrische PhasenmaskeDouble Helix, LLCN/AErzeugt ein DHPSF-Signal.
DinatriumphosphatSigma Aldrich795410M2G Inhaltsstoff.
EthylendiamintetraessigsäureFisher ScientificS311-100Chelate Ca2+. Induziert die Sekretion im T3SS.
Flip-SpiegelNewport8892-KErmöglicht das Umschalten zwischen Fluoreszenz- und Phasenkontrastwegen.
FluosphärenInvitrogenF8792Fluoreszierende Kügelchen. 540/560 Exikations- und Emissionswellenlängen. 40 nm Durchmesser.
Glas-DeckglasVWR16004-302#1.5, 22mmx22mm
GlukoseChem Impex International811M2G Inhaltsstoff.
ImmersionsölOlympusZ-81025Auf die Objektivlinse gelegt.
Eisen(II)-sulfatSigma AldrichF0518M2G-Inhaltsstoff.
LangpassfilterSemrockLP02-514RU-25Emissionspfad.
MagnesiumsulfatFisher ScientificS25414AM2G-Inhaltsstoff.
Mikroskop-PlattformMad City Labs benutzerdefiniertePlattform für inverse Mikroskope.
NalidixinsäureSigma AldrichN4382Y. enterocolitica verwendeten Zellen sind resistent gegen Nalidixinsäure.
ObjektivOlympus1-U2B99160X, 1.4 NA
OzonreinigerNovascanPSD-UV4Wird verwendet, um Hintergrundfluoreszenz auf Glasabdeckfolien zu eliminieren.
KaliumphosphatSigma AldrichM2G-Inhaltsstoff.
Rote LEDThorlabsM625L3Beleuchtet die Probe für die Phasenkontrastbildgebung. 625 nm.
sCMOS-KameraHamamatsuORCA-Flash 4.0 V2Kamera für Fluoreszenzbildgebung.
KurzpassfilterChromaET700SP-2P8Emissionsweg.
TubuslinseThorlabsAC508-180-Af=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasdN/AN/AStrain AD4442, eYFP-YscQ
Viertelwellenplatte nullter OrdnungThorlabsWPQ05M-514Anregungsweg.
223506 795488

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

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Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

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