Abfragenden einzelne autoreaktive Germinal Center von Photoaktivierungen in einem gemischten Chimären Modell von Autoimmunität

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Generation der gemischten murinen Knochenmark Chimären mit spontanen autoimmune germinal Zentren, in denen, die autoreaktive Lymphozyten Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein (PA-GFP) Reporter tragen. Dies bietet die Möglichkeit, zelluläre Lage in Geweben mit nachgeschalteten molekulare und funktionelle Analysen zu verknüpfen.

Abstract

Autoimmune-Erkrankungen stellen eine erhebliche gesundheitliche Belastung. Grundlegende Fragen über die Entstehung und Progression von Autoimmun-Krankheit bleiben unbeantwortet. Eine Voraussetzung für Fortschritte im Verständnis der zugrundeliegenden Krankheitsmechanismen und zelluläre Dynamik ist die präzise Kopplung der microanatomical Position der Zelle Teilmengen mit nachgeschalteten molekulare oder funktionelle Analysen; ein Ziel, das seit jeher schwer zu erreichen. Die Entwicklung von stabilen Photoactivatable biologische Fluorophore und deren Integration in Reporter Stämme hat vor kurzem präzise microanatomical Kennzeichnung und Nachverfolgung von zellulären Teilmengen in murinen Modellen ermöglicht. Hier beschreiben wir wie autoreaktive Lymphozyten aus einzelnen germinal Center analysieren kann helfen, neuartige Einblicke in Autoimmunität, mit der Kombination von einem Roman chimärer Modell von Autoimmunität mit einem Photoactivatable-Reporter als Vorbild . Wir zeigen, dass ein Verfahren zur Erzeugung von Chimären mit spontanen autoreaktiven germinal Center bevölkert von Lymphozyten tragen einen Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein Reporter gemischt. Mit in-vivo-Kennzeichnung-Strategien, können einzelne germinal Center in explantierten lymphatischen Geweben und ihre zellulären Bestandteile photoaktiviert durch zwei-Photonen-Mikroskopie visualisiert werden. Photoaktiviert Lymphozyten aus einzelnen germinal Zentren können dann analysiert werden oder Fluss Cytometrically, sortiert, als Einzelzellen oder in loser Schüttung und zusätzliche nachgeschaltete molekulare und funktionelle Analyse unterworfen werden können. Dieser Ansatz kann direkt angewendet werden, um neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Autoimmunität zu bieten, aber das Verfahren zur Erzeugung von Knochenmark Chimären und das Photoaktivierungen-Verfahren kann zusätzlich finden breite Anwendung in den Studien von Infektionskrankheiten und Tumor Metastasen.

Introduction

Die Inzidenz von Autoimmun-Krankheit ist in den letzten Jahrzehnten, besonders in den westlichen Gesellschaften schnell gestiegen. Heute, Autoimmunerkrankung Reihen Dritter auf der Liste der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt¹. Grundlegende Fragen über die Entstehung und Progression von Autoimmun-Krankheit bleiben unbeantwortet. Eine Voraussetzung für Fortschritte im Verständnis der zugrundeliegenden Krankheitsmechanismen und zelluläre Dynamik ist die präzise Kopplung der microanatomical Position der Zelle Teilmengen mit nachgeschalteten molekulare oder funktionelle Analysen. In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung einer Reihe von stabilen Photoconvertible, Photoactivatable oder photoschaltbare biologische Fluorophore und deren Integration in Reporter Stämme die präzise microanatomical Kennzeichnung und Nachverfolgung von Mobilfunk ermöglicht. Teilmengen in murinen Modellen.

Kaede, eine Photoconvertible fluoreszierendes Protein aus einem Stony Coral erfährt irreversible Ladungszustand aus grün fluoreszieren, rote Fluoreszenz bei Kontakt mit violetten oder ultraviolettes Licht². Zunächst eingesetzt, um das dynamische Verhalten der einzelnen Zellen bei der Entwicklung von organotypischen Gehirn Scheiben³folgen, war Generation eine Kaede Knock-in Maus anschließend erlaubte in-vivo-zelluläre Bewegung verfolgen und das System auf Analysen von angewendet. Immunzelle Migration nach und von Lymphknoten⁴. Dieser Ansatz wurde anschließend verfeinert mit einer zweiten Generation Reporter-⁵. Ein ähnlicher Reporter ist Dendra⁶, die vor kurzem verwendet wurde, um die Lymphknoten-Metastasen in Vivo⁷zu verfolgen.

Das erste Photoactivatable Protein entwickelt wurde ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) entwickelt, mit einer einzigen Punktmutation (T203H), was zu einer sehr niedrigen Absorption in den Wellenlängenbereich von 450 bis 550 nm⁸. Nach Photoaktivierungen durch UV-Licht, schaltet diese Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein (PA-GFP) die maximale Absorption von ~ 400 bis ~ 500 nm, was eine ungefähre 100-fold Intensität zu erhöhen, wenn Sie gereizt mit einer Wellenlänge von 488 nm. Die Generierung von transgenen Mäusen in denen alle blutbildende Zellen PA-GFP Ausdrücken zulässig zum ersten Mal, fundierte Analysen von B-Zell-Auswahl in anatomisch definierten hellen und dunklen Zonen der germinal Center⁹.

Während Photoaktivierungen eine irreversible Umwandlung von einem nicht-fluoreszierenden Zustand in einen fluoreszierenden Zustand ist und Ladungszustand ein One-Way-Übergang von einer Wellenlänge zur anderen ist, sind photoschaltbare Proteine in der Lage, shuttle zwischen beide Bedingungen¹⁰ . Dieser letztere Eigenschaft wurde vor kurzem genutzt, um optische Kontrolle des Protein Aktivität¹¹Ingenieur.

Mit Hilfe der PA-GFP-Reporters, gekennzeichnet wir vor kurzem die B-Zell-Repertoires an einzelne germinal Center in einem neuartigen Modell der spontanen Lupus-ähnlichen Autoimmunität¹². Dieses Modell basiert auf gemischten Chimären mit 1 Teil Knochenmark beherbergen ein autoreaktiven B-Zell-Rezeptor Knock-in mit Spezifität für Ribonuclear-Protein-komplexe (564Igi^13,14) kombiniert mit 2 Teile des Knochenmarks von jedem gewünschten Spender. Bei ca. 6 Wochen Post Rekonstitution sind homöostatische Bedingungen erreicht in welche spontanen, die autoreaktiven germinal Zentren in der Milz und der kutanen Lymphknoten vorhanden sind. Vor allem die germinal Center B-Zell-Population ist fast ausschließlich (~ 95 %) bestehend aus Zellen abgeleitet aus dem nicht-564Igi-Fach, und diese Wild-Typ abgeleitet B-Zellen sind autoreaktive geworden. Daher kann das Modell ein "Plug & Play"-Konzept für Analysen der autoreaktiven germinal Center B-Zellen mit verschiedenen transgene, Durchbrüche und Reporter. Hier beschreiben wir das Verfahren für die Erzeugung von gemischten Chimären mit spontanen autoreaktiven germinal Zentren von Lymphozyten mit der PA-GFP-Reporter bevölkert. Mit in-vivo-Kennzeichnung-Strategien, können einzelne germinal Zentren in explantierten lymphatischen Geweben und ihre zellulären Bestandteile photoaktiviert mit einem zwei-Photonen-Mikroskop visualisiert werden. Photoaktiviert Lymphozyten aus einzelnen germinal Zentren können anschließend durch Durchflusszytometrie analysiert oder Fluorochrom-aktivierte Zelle sortieren (FACS) sortiert und zusätzliche nachgeschaltete molekulare und funktionelle Analysen unterzogen. Autoreaktive Lymphozyten aus einzelnen germinal Center analysieren kann direkt angewendet werden, um neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Autoimmunität zu bieten, aber die Techniken und Ansätze beschrieben können zusätzlich relevante Anwendungen in Studien finden Infektionskrankheiten und Tumor Metastasen.

Protocol

Alle Tierversuche gemäß den Leitlinien der Europäischen Gemeinschaft und des dänischen Tier Forschung Inspectorate (2017-15-0201-01348) verabschiedet.

1. Allgemeine Maus Haltung und Vorbereitung von Puffern und tools

1. Hausmaus Leinen unter spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen, mit regelmäßiger Überprüfung des Gesundheitsstatus nach einheitlichen Richtlinien.
2. Optional: Überprüfen Sie das Fehlen der spontanen germinal Center in naive Mäuse aufgrund zufälliger Infektionen nicht überwachte. Dies kann entweder durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie (Vorhandensein von germinal Center Strukturen) durchgeführt werden oder flow Cytometry (Frequenz von germinal Center B-Zellen) als zuvor beschriebenen¹².
   Hinweis: Entweder Frauen oder Männer eingesetzt werden. Im Allgemeinen ist es ideal, Sex Spiel Spender und Empfänger, da ein Ungleichgewicht des Geschlechts durch weibliche Empfänger/Spender¹⁵theoretisch zu Alloreactivity gegenüber dem männlichen Y-Antigen führen kann.
3. Verwenden Sie CD45.1 Empfänger (B6. SJL -Ptprc^eine Pepc^b/BoyJ) im Alter von 6 bis 10 Wochen. Verwenden Sie 564Igi (B6. Cg-Igh^{tm1 (Igh564) Tik}Igk^{tm1 (Igk564) Tik}j) und PA-GLP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) Geber im Alter von 6 bis 12 Wochen.
4. Chirurgische Instrumente (gerade feine Schere und Dumont Pinzetten #5 und #7) durch Autoklavieren zu sterilisieren Sie nach routinemäßigen Sterilisation Richtlinien.
5. Bereiten Sie 500 mL Knochenmark (BM) Puffer mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) bei pH 7.4 vor. Um BM Puffer vorzubereiten, fügen Sie 10 mL Hitze-inaktivierten (1 Stunde im Wasserbad 56 ° C, die Ergänzung zu inaktivieren) FBS und 1,25 mL 400 mM EDTA Lösung (eingestellt auf pH 7,4) 500 mL PBS, pH 7,4 und gut mischen. Filtern Sie den Puffer mit einem 0,2 µm-Filter-Kolben.
6. Bereiten Sie 10 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer (155 mM NH₄Cl, 12 mM Nahco3₃, 0, 1 mM EDTA vor) durch Verdünnen von 1 mL einer Aktie 10 X 10 ml Gesamtvolumen mit Reagenz Grade Wasser. 50 mL PBS mit 5 mM EDTA, pH 7.4 vorbereiten.

2. Schaffung von gemischten Knochenmark Chimären

1. Bestrahlung von Empfängern (Tag 0)
   1. Legen Sie die CD45.1 des Knochenmarks-Empfänger in einem entsprechenden Bestrahlung Behälter und Bestrahlen mit 1.100 Rad in ein Gamma-Strahler.
      Hinweis: Alternative Strahlungsquellen können verwendet werden. Unabhängig von der Quelle hat die Dosis/Timing optimiert, um maximale Bolusinjektion Effekt mit minimaler Sicherheiten Gewebeschädigung die Tiere weichen.
   2. Setzen Sie auf Antibiotika Wasser ad libitum (1 mg Sulfadiazin und 0,2 mg Trimethoprim/mL Trinkwasser).
2. Gewinnung von Knochen (Tag1)
   1. 564Igi Knochenmarkspender durch kontinuierlichen Fluss von 4 % Isofluran in Luft zu betäuben, und durch zervikale Dislokation einschläfern. Sprühen Sie hinunter die Geber mit Ethanol und legen Sie sie auf sterile chirurgische Pads in der Fluss-Haube. Fahren Sie mit Aufrechterhaltung sterile Bedingungen mit sterilen Puffer und Geräten zu arbeiten.
   2. Um den Femur und Tibia zu extrahieren, zuerst einen Einschnitt um den Knöchel und erstrecken sich bis hin zu der Hüfte mit gerade feine Schere. Mit einem Heavy-Duty Zangen oder Daumen und Zeigefinger, ziehen Sie die Haut auf und das Bein zum Körper hin. Ebenso ziehen Sie die Haut nach unten und Sie den Fuß.
   3. Die Knie und Knöchel Gelenke durch greifen das Bein in der Hüfte und ziehen den Fuß kräftig herausspringen. Gehen Sie zum gemeinsamen Knöchel zu brechen und ziehen den Fuß zum Körper hin beim Festhalten an der Tibia, Abisolieren damit die Sehnen und Muskeln aus der Tibia.
   4. Brechen Sie des Knies, die Tibia veröffentlichen gemeinsame, und ziehen Sie dieses in ähnlicher Weise zum Körper hin halten in den Oberschenkelknochen, so abisolieren, Sehnen und Muskeln aus dem Oberschenkelknochen. Machen Sie einen Einschnitt am Hüftgelenk und schneiden Sie die Sehnen, dann herausziehen Sie die Oberschenkel aus der Hüftpfanne. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 – 2.2.4 auf der kontralateralen Seite.
   5. Reinigen Sie sorgfältig die Knochen durch Reiben mit einem groben Papiertuch um alle restlichen Muskel- und Bindegewebe zu entfernen. Dann spülen Sie sie im eiskalten BM Puffer bevor Sie schließlich auf frische kalte BM Puffer übertragen, auf Eis mit einem Paar von Dumont #7 Zange. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für die PA-GFP-Spender.
      Hinweis: Die Anzahl der Knochenmarkzellen von einem einzelnen Spender variiert je nach Geschlecht und Alter. Skalieren Sie die Zahl der Spender nach gewünschten Eingang Knochenmark-Verhältnisse und Zahlen und die gewünschte Anzahl von Empfängern. Wenn Spender knapp sind, können die vorderen Gliedmaßen für die Entnahme von Knochenmark einbezogen werden. Dies ergibt in der Regel eine zusätzliche 1/3 bis ½ der hinteren Gliedmaßen gewonnenen Zellen. In der Regel können überall von 50 Millionen Zellen wiederhergestellt werden pro Spender, je nach Alter, Geschlecht, Hintergrund und ob nur Hind oder hinteren und vorderen Gliedmaßen enthalten sind.
3. Entnahme von Knochenmark-Zelle
   1. Bereiten Sie den Mörtel durch Spülen in eiskalten BM-Puffer. Abtropfen Sie den Puffer spülen und verwenden Sie einen elektrischen Pipette-Controller mit einer serologischen 10 mL-Pipette 10 mL frische eiskalte BM Puffer hinzufügen.
   2. Übertragen Sie die Knochen von 564Igi Geber auf den Mörtel mit einem Paar von Dumont #7 Zange und verwenden Sie die Stößel zerkleinern und Mahlen der Knochen um das Knochenmark zu lösen. Abzusaugen Sie den Knochenmark-Extrakt mit einer serologischen 10 mL-Pipette und passieren Sie es durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL Röhrchen auf Eis.
   3. Der Mörtel eine zusätzliche 10 mL frische eiskalte BM Puffer hinzu, und wiederholen Sie, um die vollständige Wiederherstellung der Zellen zu gewährleisten. Knochenmaterial aus dem Mörtel mit einem Papiertuch entfernen, entsprechend zu verwerfen und den Mörtel sorgfältig mit 70 % Ethanol, gefolgt von BM Puffer spülen. Wiederholen Sie Schritt 2.3 für die PA-GFP Knochenmark Spender Gruppe.
4. Knochenmarkzellen zählen
   1. Mit einer Mikropipette, legen Sie ein Tröpfchen mit 40 µL RBC Lyse Puffer auf ein Stück Plastik Paraffin Film. Invertieren Sie der 564Igi Knochenmark Tube ein paar Mal und nehmen Sie einen 10 µL aliquoten mit einer Mikropipette. Mischen Sie es mit 40 µL RBC Lyse Puffer ablegen.
   2. Anschließend fügen Sie 50 µL Trypan blau (0,4 % in wässriger Lösung) bis zum Tropfen. Sofort laden Sie 10 µL der resultierenden Mischung in einem Burker-Türk Hemocytometer und Graf unter die Lupe genommen. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro mL, 10 x total Verdünnungsfaktor verwenden. Angemessene Zellviabilität bestätigen > 90 %. Wiederholen Sie Schritt 2.4 für die PA-GFP Knochenmark Spender Gruppe.
5. Vorbereitung der Spender Suspensionen
   1. Basierend auf den Grafen in Schritt 2.4 und die gewünschte Anzahl von Empfängern erhalten, berechnen Sie das Volumen der Spender Knochenmark aus jeder Gruppe zwei Spender im Spender Mischung Rohr gemischt werden.
      Hinweis: zum Beispiel für eine Gruppe von 1:2 gemischte 564Igi:PA einrichten-GFP Chimären mit 6 CD45.1 Empfänger: jeder Empfänger erfordert 20 x 10⁶ Spender Zellen insgesamt, 1 Teil 564Igi und 2 Teile PA-GFP. Dies erfordert daher 6 X 1/3 x 20 x 10⁶ = 40 x 10⁶ 564Igi Spenderzellen und 6 X 2/3 x 20 x 10⁶ = 80 x 10⁶ PA-GFP Spenderzellen.
   2. Mischen Sie die entsprechenden Beträge von PA-GFP und 564lgi Spender-Knochenmark in einem 50 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Knochenmark-Mischung bei 200 x g und 4 ° C für 10 Minuten mit einem schwingenden Eimer Rotor.
   3. Den Überstand abgießen und Aufschwemmen der Zellen im eiskalten BM Puffer bei einer Dichte von 1 x 10-⁸ -Zellen pro mL. Übertragen Sie auf eine vorgekühlte 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
6. Neuaufbau des Knochenmarks-Empfänger mit Knochenmark Spender
   1. Empfänger mit Induktion mit kontinuierlichen Fluss von 4 % Isofluran in Luft, gefolgt von Wartung bei 3,75 % zu betäuben. Überprüfen Sie angemessene Ebene der Anästhesie durch Fehlen der Zehe-Prise Reflex.
   2. Streichen Sie sorgfältig die Röhrchen mit Knochenmark Mischung dafür angemessene Wiederfreisetzung von Knochenmarkzellen, dann Aspirat 200 µL des Knochenmark-Mix (~ 20 x 10⁶ Zellen), in einem 0,3 mL, 30 gauge Insulin Spritze.
   3. Den Empfänger auf die Seite legen, sanft dehnen die Haut oberhalb und unterhalb des Auges etwas "Pop" das Auge heraus, und setzen Sie sanft die Spitze der Spritze etwa in einem 30°-Winkel in die Front der Augenhöhle, kümmert sich um das Auge und das umliegende Gewebe zu vermeiden. Wenn die Spitze der Nadel zu spüren ist, tippen Sie auf den Knochen die Augenhöhle unterstreichend, leicht zurückziehen (~0.5 mm) und das Spender-Knochenmark mit gleichmäßigen Druck langsam zu injizieren.
      Hinweis: Es sollte keine Blutung, kein Auslaufen von Flüssigkeit und nicht auf sehr geringe Vorwölbung des Auges nach Einspritzung.
   4. Die Maus an den Käfig mit ad libitum Antibiotika Wasser zurück und sofortige Wiederherstellung aus dem Verfahren zu überprüfen. Wiederholen Sie Schritt 2.6 für jeden Empfänger.
      Hinweis: Tail-Vein Injektion kann anstelle von Retroorbital Injektion mit ähnlichen Ergebnissen verwendet werden, allerdings in unseren Händen ist es deutlich langsamer, die möglicherweise ein Problem bei der Arbeit mit großen Gruppen von Empfängern. Wiederherstellung der narkotisierter Tiere direkt auf kleinem Durchmesser Bettwäsche sollte vermieden werden, da es eine Aspiration und Erstickung Gefahr darstellt
7. Entfernung von Antibiotika Wasser (Tag 14)
   1. Entfernen Sie die antibiotische Wasser aus die Referenzdrehzahl und ersetzen Sie durch regelmäßige Trinkwasser.

3. Überprüfung erfolgreich Rekonstitution und Überprüfung der entsprechenden Grad der Chimärismus (Woche 6)

1. Retroorbital Blutungen von Chimären und Kontrollen
   1. Bereiten Sie Blutentnahmeröhrchen durch Kennzeichnung 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen nach Empfänger Ohr-Tag-Nummern und das Hinzufügen von 50 µL PBS mit 5 mM EDTA.
      Hinweis: Enthalten Sie entsprechende Kontrollen für PA-GFP, CD45.1 und CD45.2 und 9 11 (Idiotyp). Dies kann durch die Aufnahme 1 PA-GFP + Maus 1 CD45.1, 1 B6 Maus und Maus 1 564Igi Maus.
   2. Mäuse zu betäuben und angemessene Ebene der Anästhesie wie in Schritt 2.6.1 zu überprüfen. Legen Sie die Chimäre auf die Seite, dehnen Sie sanft die Haut oberhalb und unterhalb des Auges, das Auge leicht "pop".
   3. Sanft legen Sie eine BoPET gewickelt heparinisierten Kapillare (60 µL Innenvolumen) ungefähr in einem Winkel von 40° in vor der Augenhöhle, kümmert sich um eine Beschädigung des Auges und des umliegenden Gewebes. Drehen Sie sanft Twist/das Rohr bis es beginnt, sich mit Blut füllen.
   4. Das Blut passiv das Rohr durch Kapillarwirkung, bis fast ganz voll füllen lassen dann einfahren der Röhre und legen Sie sie in dem entsprechenden bereits beschriftete Sammelrohr und gleichzeitig sofort entspannen den Griff um das Auge, das Auge zu ermöglichen zurück in Position zu begleichen. Blutungen sollten sofort aufhören.
   5. Sicherzustellen Sie, dass das Kapillarrohr in dem Sammelrohr entleert hat und in einem Sharps Container entsorgen. Das Röhrchen verschließen und invertiere dreimal um vollständige Vermischung mit PBS/EDTA zu gewährleisten.
   6. Die Maus in den Käfig zurück und sofortige Wiederherstellung aus dem Verfahren zu überprüfen. Wiederholen Sie Schritt 3.1 für jede experimentelle Maus und die entsprechenden Steuerelemente.
      Hinweis: Vorsicht, wenn die submandibulären Vene Punktion zu verwenden, da diese Methode ein größeres Risiko für zufällige Infektion im bestrahlten Empfänger darstellen kann, bevor diese vollständig wieder hergestellt werden. Darüber hinaus in unserer Erfahrung finden wir, dass das Volumen des Blutes gesammelt und die Menge an Blut verloren wegen starken Blutungen variabler ist. Beide dieser Überlegungen sind wichtig, da die Knochenmark Chimären empfindlich in der Phase der Rekonstitution, sind bevor das neue Knochenmark voll gepfropft ist und Blutbildung hat normales Niveau fortgesetzt.
2. Peripheren mononukleären Zellen (PBMC) Blutreinigung
   1. Nach Abschluss der Blutentnahme, kurz (10 s) Zentrifugieren der Rohre bei niedriger Drehzahl (< 200 X g), die verdünnten sammeln stabilisiert Blut an der Unterseite der Rohre.
   2. Eine 10 mL Spritze mit Lymphozyten Trennmedium füllen und eine 18 G-Nadel befestigen. Stechen Sie die Nadel auf den Boden der ersten Röhre und der Blutprobe mit 1 mL der Lymphozyten Trennmedium underlayer. Vorsichtig ziehen Sie die Nadel heraus und wischen Sie es mit einem Papiertuch, Cross-Kontamination der nächsten Probe zu verhindern.
   3. Fahren Sie durch die Proben, dann Zentrifugieren für 25 Minuten bei 800 X g, bei Raumtemperatur in einer Zentrifuge schwingen-Eimer mit den Bremsen zu klein/aus einstellen.
   4. Bereiten Sie eine Reihe von entsprechend gekennzeichneten 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, enthält 1 mL eiskaltes BM Puffer.
   5. Geben Sie nach Zentrifugation für jede Probe die obere (Plasma) Schicht mit einer Mikropipette 200 µL und aspirieren Sie der mononukleären Zellschicht (MNC) direkt über die Schnittstelle. Übertragen Sie die Zellen auf die entsprechend beschrifteten Röhrchen mit 1 mL BM Puffer. Schließen Sie den Deckel und kehren Sie um zu mischen. Entsorgen Sie die Lymphozyten Trennung Medium-haltigen Röhre.
   6. Gehen Sie durch alle Proben und dann bei 200 X g für 5 min, 4 ° C in einem schwingenden Eimer Rotor zentrifugieren. Aspirieren überstand verwerfen und erneut das Pellet in 200 µL des eiskalten BM Puffer. Die Proben sind nun bereit für Antikörper-Färbung und durchflusszytometrischen Analyse.
3. Färbung für Durchfluss durchflusszytometrischen Bewertung
   Hinweis: Panel vorgeschlagen: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9d 11-A568, CD45.2-APC. Nicht aktivierte PA-GFP wird im Pazifik Orange (oder gleichwertig) Kanal erkannt. Keine Lebensfähigkeit Farbstoff ist erforderlich, da die Lymphozyten Trennung von abgestorbenen Zellen entledigt.
   1. Fügen Sie mithilfe einer Mikropipette 100 µL Zellsuspension pro Bohrloch für jede Probe Chimera und Kontrolle zu einer 96-Well-Platte.
   2. Für die 3 nicht-PA-GFP Kontrollproben bündeln Sie die restlichen 100 µL jeder Probe (insgesamt 300 µL). Fügen Sie 50 µL dieses Materials für die ungefärbten Kontrolle und einzelne gefärbten Kontroll-Vertiefungen. Für die PA-GFP Single-gefärbten Kontrolle darüber fügen Sie 50 µL ungefärbten PA-GFP-Probe hinzu.
   3. In jede Vertiefung hinzufügen 100 µL Puffer (ungefärbt), einzelne Antikörper (Single-gefärbten Entschädigung Kontrollen, mit Ausnahme von PA-GFP Entschädigung Kontrolle) oder Antikörper-Mix (Proben). 20 Minuten auf dem Eis inkubieren.
   4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 Minuten bei 4 ° C. Streichen Sie den Puffer. Fügen Sie 200 µL Puffer BM in jede Vertiefung und Zentrifugieren Sie wieder um zu waschen. Streichen Sie den Puffer und Aufschwemmen Sie Zellen in jede Vertiefung in 200 µL des BM-Puffers. Die Proben sind nun bereit für die Analyse auf einem Durchflusszytometer (Abbildung 1).
      Hinweis: Germinal Center Antworten in den Chimären können an jedem beliebigen Punkt ab 6 Wochen analysiert werden.

4. In-vivo Kennzeichnung des marginalen Zone/subkapsuläre Sinus zur Identifizierung der einzelnen germinal Center Unterstützung

Hinweis: Dieses Protokoll ist für Straßenräuber/Sprunggelenk (popliteal Lymphknoten) und intravenös (i.v., Milz) Injektionen unter Beweis gestellt, aber variiert werden, je nach Ziel-Site.

1. Bilateralen Straßenräuber Injektion zur Kennzeichnung popliteal Lymphknoten
   1. Die Mäuse wie in Schritt 2.6.1 zu betäuben.
   2. Verdünnen Sie in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 2 µL der PE-Label Ratte Anti-Maus CD169 Antikörper in 18 µL PBS, pH 7.4. Legen Sie zwei Tropfen von 10 µL des Gemisches auf ein Stück Plastik Paraffin Film. Aspirieren Sie jedes Tröpfchen mit einer 0,3 mL Insulin Spritze mit einer 30 Gauge-Nadel.
   3. Die 10 µL des Benennens Mischung entweder die Straßenräuber zu injizieren (geben Sie mit der Nadel in einem Winkel von 5-10 ° im zentralen Teil der Straßenräuber, proximal von Anfang an den Zehen, und stechen Sie die Nadel etwa auf halbem Weg in Richtung der Ferse) oder das Sprunggelenk (geben Sie mit der Nadel auf ein 5 - 10 ° Winkel knapp oberhalb der Ferse und über Einfügen zur Hälfte seiner Länge entlang der Achse der Achillessehne in die Richtung des Knies). Die Mäuse in ihren Käfigen zurück und warten Sie ca. 15 Minuten bevor Sie mit Schritt 5 fortfahren.
2. Intravenöse Injektion zur Kennzeichnung der Milz
   1. Die Mäuse wie unter Punkt 2.6.1 zu betäuben.
   2. Verdünnen Sie in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 10 µL des PE-Label Ratte Anti-Maus CD169 Antikörper in 90 µL PBS. Aspirieren Sie die Mischung mit einer 0,3 mL Insulin Spritze.
   3. Durchzuführen Sie Retroorbital i.v. Injektion gemäß Schritt 2.6. Die Mäuse in ihren Käfigen zurück und warten Sie ca. 15 Minuten bevor Sie mit Schritt 5 fortfahren.
      Hinweis: als Alternative zu Isofluran, Injektion Narkose wie Ketamin/Xylazin-Mischung verwendet werden kann; Dies führt jedoch in der Regel langsamer Recovery-Zeiten. Da die Lymphdrainage in der Regel durch Bewegung der Skelettmuskulatur beeinflusst wird, dürfte dies zu langsamer Entwässerung Zeit führen.

5. Prothesentyp Milz und Lymphknoten und der Vorbereitung auf Photoaktivierungen

1. Vorbereitung einer doppelseitigen Bildgebung und Photoaktivierungen Kammer
   1. Entfernen Sie den Kolben aus einer 20 mL Spritze und Rücken-Last es mit Vakuum Fett durch die Düse einer Röhre Vakuum Fett einlegen. Dann entfernen Sie den Kolben aus einer 5 mL Spritze und die 20 mL Spritze mit Rücken-Ladung mit Vakuum Fett.
   2. Verwenden Sie die Vakuum-Fett geladen 5 mL Spritze eine Bildgebung und Photoaktivierungen Kammer vorbereiten, indem du ein Quadrat Deckglas auf einer flachen Oberfläche und tracing an den Rändern der das Deckglas mit Vakuum Fett (ca. 1-2 mm von den Kanten).
      Hinweis: darauf achten Sie, um zu vermeiden, Vakuum Fett Verschmutzung von allen Oberflächen, die anschließend mit dem Mikroskop-Objektiv, wie Microdroplets Vakuum Fett emulgiert in Wasser eintauchen, das Objektiv verunreinigen können.
   3. Das Deckglas Vakuum Fettkammer mit eiskalten BM Puffer füllen und auf eine kalte Unterlage legen.
2. Ernte von Lymphknoten und Milz
   1. Einschläfern der in-vivo beschriftet chimärer Maus gemäß Schritt 2.2.1 analysiert werden. Sprühen Sie hinunter die Karkasse mit 70 % Ethanol.
   2. Für den Zugriff auf den popliteal Lymphknoten verwenden Sie gerade feine Schere einen Einschnitt in die Haut knapp unter dem Knie Grube zu, und erweitern Sie den Schnitt nach oben entlang der Achillessehne-Linie fast bis zum Hüftgelenk. Mit Dumont #5 oder #7 Zangen, ziehen Sie jeweils die exponierten Klappen der Haut nach außen, um das Gewebe in der popliteal Fossa (Abbildung 2A) verfügbar zu machen.
   3. Mit einem Paar von Dumont Nr. 5 Pinzetten, sorgfältig geben Sie die popliteal Fossa nur medial auf die Kniekehle Vene und zu zergliedern, öffnen Sie das Fett durch Einfügen und öffnen und Schließen der Zange entlang der Achse des Beines, um den zugrunde liegenden popliteal Lymphknoten freizulegen.
   4. Pop die Lymphknoten aus der Fossa durch Einklemmen des Quadrizeps-Muskels von der Frontseite her proximal bis zum Knie mit Daumen und Zeigefinger (Abb. 2 b). Schnappen Sie sich die Lymphknoten von unten mit der Pinzette aus dem umgebenden Gewebe (Abbildung 2) zu befreien und dann legen Sie es in das Vakuum Fettkammer im Schritt 5.1 vorbereitet.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2 – 5.2.4 für die kontralateralen Seite. Mehrerer Lymphknoten können in einer einzigen Kammer montiert werden, falls gewünscht.
   6. Schließlich schließen der Kammers indem ein zweiter Deckglas auf der Felge Vakuum Fett und leichtem Druck nach unten, kümmert sich um alle Luftblasen zu extrudieren.
      Hinweis: Einige der Puffer kann auch herausgedrückt werden, aber das Vakuum Fett sollte eine gute Abdichtung verhindert Austritt von Flüssigkeit (Abb. 2D) bilden. Die Lymphknoten sind jetzt in einer doppelseitigen bildgebenden Kammer.
   7. Milz, mit ein paar gerade feine Schere machen einen Schnitt durch die Bauchdecke auf der linken Seite der Maus, der anterior medialen Linie proximalen Zugriff auf knapp unter den Brustkorb, und um den Körper auf der hinteren Axillarlinie zu verlängern. Die Spitze der Milz sollte sichtbar (Abb. 3A).
   8. Die Milz mit einem Paar von Dumont #7 Zange herausziehen Sie und schneiden Sie die Verwachsungen an der Unterseite, es zu veröffentlichen. Verwenden der gerade feine Schere ~ 2 mm dickere, Querschnitt, Scheiben schneiden.
   9. Legen Sie die Scheibe in das Vakuum Fettkammer im Schritt 5.1 vorbereitet. Mehrere Scheiben der Milz können in einer einzigen Kammer montiert werden, falls gewünscht.
   10. Schließlich schließen der Kammers indem ein zweiter Deckglas auf der Felge Vakuum Fett und leichtem Druck nach unten, kümmert sich um alle Luftblasen zu extrudieren. Halten Sie alle bildgebende Kammern auf dem Eis zu allen Zeiten, außer bei der Bildgebung und Photoaktivierungen.
       Hinweis: Einige der Puffer kann auch herausgedrückt werden, aber das Vakuum Fett sollte bilden einen dichten Abschluss, Austreten von Flüssigkeit zu verhindern. Die Milz-Scheiben sind jetzt in einer doppelseitigen imaging-Kammer (Abb. 3 b).

(6) Photoaktivierungen

1. Identifizierung von einzelnen germinal Center
   Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Milz beschrieben, aber ist ganz analog für die Lymphknoten.
   1. Ort der bildgebenden Kammer auf den Mikroskoptisch. Mit einem 3,5 mL Kunststoff Transferpipette, geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die oberen Deckglas und senken Sie das Ziel bis zu dem Punkt des Kontaktes. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite des Gewebes mit dem Durchlicht.
   2. Wechseln Sie zu dunklen Modus und zwei-Photon Erregung und tune den Laser auf 940 nm.
      Hinweis: Mit den entsprechenden Filter-Sets dieser Wellenlänge ermöglicht, Erregung und Erkennung der zweiten Generation der Oberschwingungen im Kollagen-haltigen Strukturen verbunden mit großen Schiffen und Strukturelemente sowie die CD169-PE in Schritt 4.2, injiziert die identifiziert die Randzone. 940 nm Anregung jedoch nicht Photoactivate PA-GFP.
   3. Lokalisieren Sie weiß-Zellstoff Einzelbereiche (begrenzt durch die CD169-PE Färbung) nahe der Oberfläche des Gewebes zu und identifizieren Sie Periarteriolar lymphoide Mantel (PALS, T-Zell-Zone) der zweiten Oberwellen-Generation mit dem zentralen Arteriola verbunden. In der Zone zwischen der PALS und die Randzone, suchen das Vorhandensein von stark Autofluorescent aktiviert tingible Body Makrophagen (starke Autofluorescent Signal in allen Kanälen, Blob-Aussehen mit dunklen Vakuolen) (Abb. 4A).
      Hinweis: Gegebenenfalls aufgrund von unerwünschten Orientierung des Gewebes die bildgebende Kammer kann umgedreht werden und Bildgebung kann aus der anderen Richtung durchgeführt werden.
   4. Basierend auf Kennzeichen identifiziert in Schritt 6.1.3., eine Region of Interest Identifizierung einer einzigen germinal Mittelbereich zu zeichnen. Richten Sie einen Z-Stapel um 100-150 µm Tiefe, ausgehend von der Oberfläche des Gewebes, und mit einer Schrittweite von ~ 3 µm.
   5. Wechseln Sie zu 830 nm Anregung Wellenlänge. Ausschalten oder Dimmen alle Kanäle um lichtbedingten Detektoren zu vermeiden (wie Laserleistung und Ausgang Fluoreszenz ist in der Regel deutlich höher bei dieser Wellenlänge), und dann "Bild" im Stapel.
      Hinweis: Bestimmte Einstellungen, wie z. B. Laser Power und Pixel Verweilzeit, abhängig von der Tiefe in das Gewebe, das spezifische Gewebe verwendet und das Abbildungssystem. Jede Anwendung muss auf die spezielle imaging-System verwendet optimiert werden. Es zwar wichtig, effiziente Photoaktivierungen im gesamten Stapel zu erhalten, sollte darauf die Zellen nicht zu lichtbedingten geachtet werden.
   6. Wechseln Sie zurück zu 940 nm Anregung Wellenlänge und öffnen Sie Kanäle. Durchsuchen Sie den Stapel, effiziente Photoaktivierungen im gesamten (Abbildung 4 b) und das Fehlen von lichtbedingten (diffuse, nicht-Zelle-bounded PA-GFP-Signal, dunkle Flecken oder hoeherer Autofluoreszenz im photoaktiviert Bereich) zu bestätigen.
   7. Gehen Sie zu Photoactivate alle relevanten Gewebe in der bildgebenden Kammer, dann sofort wieder es zu Eis bis zu Weiterverarbeitung. Fahren Sie fort mit Photoaktivierungen zusätzliche bildgebende Kammern.
      Hinweis: Schadhaftes Gewebe, Montage und vor allem Photoaktivierungen sind zeitraubende Prozesse, aber total Turn-around-Zeit sollte auf 4 bis 6 Stunden, um zu verhindern, dass einen dramatischen Rückgang der Zellviabilität beschränkt werden.

7. Wiederherstellung und Analyse der photoaktiviert Zellen

1. Extraktion von Lymphozyten aus Lymphknoten und Milz
   1. Bereiten Sie für jede Probe photoaktiviert einen entsprechend beschriftete 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL Puffer BM auf Eis. Gehören Sie Proben aus einer nicht-PA-GFP-Kontrolle und eine nicht aktivierte PA-GFP Maus. Dies kann erreicht werden, indem ein B6-Steuerelement und ein PA-GFP-Kontrolle-Maus.
   2. Entfernen Sie vorsichtig die obere Deckglas aus der bildgebenden Kammer, kümmert sich um halten die Position der Proben (wenn mehrere Proben in einer einzigen Kammer vorhanden sind), und jede Probe in ihrer jeweiligen Probenröhrchen.
   3. Mit einem Stößel-Homogenisator, drücken Sie das Gewebe und drehen Sie den Stößel in der Röhre, die Lymphozyten freizugeben. Mit einer Mikropipette, aspirieren Sie der lysate und in einem frischen, vorgekühlte 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch durch ein 70 µm Zelle Sieb filtern. Überspringen Sie für Lymphknoten Proben Schritt 7.1.5..
   4. Zentrifugieren Sie für Milz Proben bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C in einem schwingenden Eimer-Rotor. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in 200 µL des RBC Lyse Puffer. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie dann fügen Sie 800 µL eiskalte BM Puffer und fahren Sie mit Schritt 7.1.5..
   5. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C in einem schwingenden Eimer-Rotor. Den Überstand verwerfen und in 200 µL des eiskalten BM Puffer Aufschwemmen. Die Proben können jetzt zum Beizen für Durchfluss durchflusszytometrischen Bewertung und Sortierung, wenn gewünscht.
2. Färbung für Durchfluss durchflusszytometrischen Bewertung
   Hinweis: Panel vorgeschlagen: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9d 11-A647, CD38-PE-Cy7, fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Nicht aktivierte PA-GFP wird im Pazifik Orange (oder gleichwertig) Kanal erkannt. Photoactivated PA-GFP ist in der GFP-Kanal erkannt. Jede Co gereinigten Makrophagen (das können oder kann möglicherweise nicht gewesen in-vivo mit CD169-PE gekennzeichnet) können ausgeschlossen werden, indem Färbung mit CD169-PE und dies als ein Dump-Tor.
   1. Fügen Sie mithilfe einer Mikropipette 100 µL Zellsuspension pro Bohrloch für jede Probe Chimera und Kontrolle in einer 96-Well-Platte.
   2. Fügen Sie für die Kontrollproben B6 50 µL dieses Materials für die ungefärbten Kontrolle und einzelne gefärbten Kontroll-Vertiefungen hinzu. Für nicht aktivierte PA-GFP Single-gefärbten Kontrolle darüber fügen Sie 50 µL ungefärbten nicht aktivierte PA-GFP-Probe hinzu. Für die aktivierten PA-GFP Single-gefärbten Kontrolle bündeln Sie das restliche Material für alle photoaktiviert Proben.
   3. Zu jedem gut, fügen 100 µL Puffer (ungefärbt und PA-GFP Entschädigung steuert), einzelne Antikörper (Single-gefärbten Entschädigung Kontrollen) oder Antikörper-Mix (photoaktiviert Muster). 20 Minuten auf dem Eis inkubieren.
   4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g 5 Minuten bei 4 ° C. Streichen Sie den Puffer. Fügen Sie 200 µL Puffer BM in jede Vertiefung und Zentrifugieren Sie wieder um zu waschen. Streichen Sie den Puffer und Aufschwemmen Sie Zellen in jede Vertiefung in 200 µL des BM-Puffers. Die Proben sind nun bereit für die Analyse auf einem Durchflusszytometer oder Sortierer (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5).

Results

Generation von gemischten Knochenmark Chimären

Dieses Protokolls erreicht robust gemischte Knochenmark Chimären mit einer nahezu vollständigen Chimärismus in der B-Zell-Fach, wie in der repräsentativen Ergebnis in Abbildung 1 dargestellt (für statistischer Signifikanz siehe ¹²). Die serotyping zeigt normalisierte B Zelle Zahlen 6 Wochen post Rekonstitution (Abbildung 1A), mit einer niedrigen Frequenz von 9-11 (Idiotyp) positive zirkulierende B-Zellen aus dem 564Igi-Fach (Abbildung 1 b) ableiten. Innerhalb der gesamten Lymphozyten-Tor, ist eine niedrige Häufigkeit der verbleibenden Empfänger-abgeleitete Zellen, ~ 6 % CD45.1 (Q1), einer allgemeinen Grad der Chimerism ~ 94 % (Abbildung 1). Innerhalb des Spenders Fach (CD45.1), Q4 + Q3) das Verhältnis der 564Igi (Q4), PA-GLP (Q3) liegt bei rund 23 % auf 77 %. Das etwas niedriger als Eingabe 33 bis 66 % Verhältnis durch die schwere negative Auswahl der B-Zellen zu erklären ist abgeleitet von 564Igi Fach ¹². Wie aus Abbildung 1ersichtlich, gibt es nahezu vollständige Chimärismus in der B-Zell-Fach (99,9 % CD45.1-) und Dominanz der PA-GFP Knochenmark gewonnenen B Zellen (Q3), die eine Folge der schweren negativen Auswahl der B-Zellen 564Igi abgeleitet ist.

Ernte von Geweben, Verarbeitung und Fluss durchflusszytometrischen Bewertung

Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen Verfahren und Ergebnisse der Prothesentyp frisch isoliert, Lymphknoten und Milz Scheiben. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis für die in-vivo Kennzeichnung und Photoaktivierungen eines einzigen germinal Center Bereich in eine Scheibe explantierten Milz. Wie gesehen werden kann (Abb. 4A), die in-vivo Markierung mit CD169-PE hat robust bezeichnet die Randzone (rot, gekennzeichnet durch "MZ"). Die zweite Harmonik Signal zeigt sich in Kollagen-haltigen Strukturelemente und große Schiffe (blau), einschließlich der zentralen Arteriola der Periarteriolar lymphoide Hülle (PALS). Hoch Autofluorescent, aktivierte Makrophagen tingible Body germinal Center Aktivität (Pfeilspitzen) zugeordnet sind. Zusammengenommen, ermöglicht die Identifikation von der Randzone, PALS und tingible Body Makrophagen, Kennung für eine Region von Interesse, die wahrscheinlich einen einzigen germinal Center enthält. Die Region von Interesse ist photoaktiviert, wie in Abbildung 4 bdargestellt. Wie gezeigt, ist Photoaktivierungen microanatomically präzise⁹, einen definierten Bereich der Aktivierung nachgeben. Die vorgestellten Ergebnisse dienen zusätzlich als Bestätigung für eine hohe Dichte an PA-GFP + Lymphozyten in die rekonstituierte Chimären und Präsenz der spontanen germinal Zentren. Nachgeschaltete Durchfluss durchflusszytometrischen Evaluation weiter bestätigt normalisierte B Fach Zellzahlen (Abbildung 5), eine spontane germinal Center Bevölkerung (Abb. 5E) und das Vorhandensein einer Teilmenge von germinal Center B-Zellen, die gewesen sein photoaktiviert (Abbildung 5F).

So zeigt dieses Protokolls eine robuste Methode zur Erzeugung von gemischten Knochenmark Chimären mit spontanen autoreaktiven germinal-Zentren, die überwiegend aus Wildtyp abgeleitete B-Zellen tragen einen Photoactivatable Reporter bestehen. Dies ermöglicht wiederum nachgeschalteten Analysen der einzelnen germinal Zentren (grafische Übersicht in Abbildung 6).

Abbildung 1: Fließen durchflusszytometrischen Bewertung des Grades der Chimerism im Blut von 564Igi (CD45.1-PA - GFP-): PA-GLP (CD45.1, PA-GFP +) gemischt Chimären in letal bestrahlten CD45.1 Empfänger (CD45.1 +, PA - GFP-), 6 Wochen post Rekonstitution. A) Plot zeigt Anspritzung B220 + B-Zellen, Pre-gated auf Singulett Lymphozyten. ( B) Subgate vom Grundstück A, zeigt 9 11 + (Idiotyp) Frequenz innerhalb der B-Zell-Population. C) Plot der PA-GFP im Vergleich zu CD45.1, Pre-gated auf Singulett Lymphozyten. D) Handlung des PA-GFP im Vergleich zu CD45.1 in der B-Zell-Subgate vom Grundstück A. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Verfahren zur Ernte und Montage popliteal Lymphknoten für Bildgebung und Photoaktivierungen. A) einen Einschnitt ist unterhalb des Knies gemacht und bis das Hüftgelenk verlängert, und die Kanten sind an den Seiten, um die popliteal Fossa (Pfeilspitze) aussetzen eingefahren. B) die darüber liegende Fatpad ist geöffnet und die popliteal Lymphknoten ausgesetzt (Pfeilspitze). Die Fossa ist C) den popliteal Lymphknoten entnommen. D) das Verfahren wird für die kontralateralen Seite wiederholt und beide Knoten in eine doppelseitige Deckglas/Vakuum-Fettkammer gefüllt mit BM Puffer montiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Verfahren für die Ernte und die Milz für Bildgebung und Photoaktivierungen Montage. Ein) ein Schnitt ist bei der anterior medialen Zeile direkt unterhalb des Brustkorbs und erweitert um den Körper auf der hinteren Axillarlinie, und die Kanten werden zurückgezogen, um die Spitze der Milz (Pfeilspitze) verfügbar zu machen. B) die Milz ist eingefahren und herausgeschnitten und in dünnen (1-2 mm) Scheiben schneiden, die in eine doppelseitige Deckglas/Vakuum-Fettkammer gefüllt mit BM Puffer montiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Photoaktivierungen. ( A) zwei-Photon Schliffbild eines germinal Center in der Milz vor Photoaktivierungen. In-vivo Markierung mit Anti-CD169-PE erfolgte vor der Ernte der Milz, der Randzone zu kennzeichnen (rot, gekennzeichnet durch "MZ"). Die zweite Harmonik signal ergibt sich im Kollagen-haltigen Strukturen mit dem Integument und große Schiffe (blau) verbunden. Pfeilspitzen identifizieren hoch Autofluorescent, aktivierten tingible Body Makrophagen germinal Center Aktivität zugeordnet. Bildgebung erfolgte bei 940 nm Anregung. Der Maßstab in der linken oberen Ecke zeigt 200 µm. B) wie A, aber nach Photoaktivierungen bei 830 nm. Photoaktiviert Zellen sind nun sichtbar (grün) in einer definierten Region von Interesse begrenzt durch die Randzone und umfasst die zuvor identifizierten tingible Body Makrophagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Fließen durchflusszytometrischen Analyse von germinal Center B-Zellen photoaktiviert. A) Grundstück nach vorne im Vergleich zu streuen und Lymphozyten Seitentor. B) Fläche des vorderen Streuung als eine Funktion der forward Scatter Höhe innerhalb der Lymphozyten-Tor und daraus resultierende Singulett-Tor. C) Lebensfähigkeit färben Ausgrenzung Handlung innerhalb der Singulett-Tor und daraus resultierende live Zelle Tor. D) Herbeirufung der B220 + B-Zellen. E) Herbeirufung von germinal Center B-Zellen, als CD38lo GL7hi Zellen innerhalb der B220 + Tor identifiziert. F) Herbeirufung von photoaktiviert Zellen innerhalb der GC B-Zell-Population, als Teilmenge von Zellen, die zusammen mit dem Ausdruck nicht aktiviert und photoaktiviert PA-GLP identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: grafische Übersicht des Protokolls. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Gibt es eine große Anzahl von murinen Modellen von Autoimmunität, von denen viele mit spontanen germinal Center¹⁶präsentieren. Allerdings hegen viele der verfügbaren Modelle komplexe genetische Hintergründe oder Mutationen in den zentralen Aufsichtsbehörden Lymphozytenproliferation oder Aktivierung, wodurch sie schlecht geeignet, um Kreutzung mit Reporter Linien und Studium der normalen Lymphozyten Verhalten bei Autoimmunität beziehungsweise. Das vorliegende Modell ermöglicht dagegen einen "Plug & Play"-Ansatz für fundierte Analysen von autoreaktiven Wild-Typ abgeleitet germinal Center B Zellen mit jeder gewünschten Kombination von transgene, Durchbrüche und Reporter, im vorliegenden Fall vertreten durch Photoactivatable GFP. Mit in-vivo-Kennzeichnung-Strategien, können einzelne germinal Zentren in explantierten lymphatischen Geweben und ihre zellulären Bestandteile photoaktiviert mit einem zwei-Photonen-Mikroskop visualisiert werden. Photoaktiviert Lymphozyten aus einzelnen germinal Zentren kann dann analysiert oder sortierte Fluß Cytometrically, als Einzelzellen oder in loser Schüttung. Diese Zellen können nachträglich zusätzliche nachgeschaltete molekulare und funktionelle Analysen sollen neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Autoimmunität unterzogen werden.

Es gibt einige wichtige Schritte für eine erfolgreiche Leistung dieses Verfahrens. Wie die repräsentativen Ergebnisse der Bestrahlung (1.100 Rad) und Spender Knochenmark Rekonstitution erfolgreich ersetzen die Empfänger des Knochenmarks Fach nachgeben nahezu vollständigen Chimärismus in der B-Zell-Fach. Dies ist ein wichtiger Punkt, da verbleibende Empfänger abgeleitet B-Zellen eine Teilmenge der Bevölkerung germinal Center "dunkel" machen würde. Unabhängig von der Quelle zur Bestrahlung verwendet hat die Dosis/Timing der Bestrahlung optimiert, um maximale Bolusinjektion Effekt mit minimaler Sicherheiten Gewebeschädigung die Tiere weichen. Für Rekonstitution des Knochen-Crush-Protokolls und der Rekonstitution mit 20 Millionen insgesamt Spenderzellen robust liefern hohe Rekonstitution Grad gefunden. Steril und kalt/auf Eis für die Entnahme von Knochenmark sichert hohe Rentabilität des Spenders Knochenmark. Zur Erreichung der gewünschten Spender Knochenmark Verhältnisse unbedingt großen Sorgfalt walten lassen, wenn Aliquote der Zellen, für die Zählung selbst und beim Herausnehmen der Teilstichprobe des Knochenmarks für die Zählung zu zählen. Mischen und Co Pelletierung der Spender Zucchini statt Zentrifugieren und resuspending separat und dann mischen, dient dazu, jede Neigung im Spender-Verhältnisse nach der Zellzählung zu verhindern.

Die gemischte Knochenmark Chimäre Generation des Protokolls kann alleine stehen, und Generation von Chimären mit autoreaktiven germinal Zentren mit gewünschten Reporter, Transgen oder Knock-out-ermöglicht. Allerdings ist dies eine Einschränkung gewebeverträglichen Spender verwendet werden müssen. Der 564Igi Stamm ist auf C57Bl/6J Congenic Hintergrund, und infolgedessen der anderen Donor(s) und der Empfänger muss einen H-2 b Congenic Hintergrund (oder alternativ die 564Igi Belastung sollte die gewünschte Belastung und der autoimmunen Phänotyp backcrossed werden auf den neuen Hintergrund überprüft). Die Bestrahlung Verfahren neigt zu tolerogene Umwelt¹⁷begünstigen und Fehlanpassungen in einige kleinere Histocompatibility Antigene toleriert werden. Dieser Aspekt sollte jedoch gründlich berücksichtigt werden, insbesondere dann, wenn männliche und weibliche Spender oder Empfänger wegen des Potentials für weibliche Reaktivität mit männlich-eingeschränkten Y-Antigene zu mischen.

In ähnlicher Weise der Photoaktivierungen Aspekt des Protokolls kann alleine stehen, und in vielen verschiedenen Zusammenhängen verwendet werden. Die PA-GFP-Reporter ist jedoch derzeit nur verfügbar mit der UBC-Promotor, die in allen Zellen des hämatopoetischen Linie, aber nicht in Stromazellen Zellen aktiv ist. Wie in der Einleitung erwähnt, andere Photoactivatable, photoschaltbare oder Photoconvertible Reporter Stämme stehen zur Verfügung und können für PA-GFP, durch entsprechende Anpassung der experimentellen Bedingungen ersetzt werden.

Es ist wichtig, unbeabsichtigte Photoaktivierungen unerwünschte Bereiche zu vermeiden, durch die Aufrechterhaltung des Lasers deutlich über 900 nm beim abbilden, da dies Wellenlänge nicht Photoactivate PA-GFP. Für die Photoaktivierungen selbst bestimmte Einstellungen, wie z. B. Laser Power und Pixel Verweilzeit, werden die Tiefe in das Gewebe, das spezifische Gewebe verwendet und dem abbildenden System abhängen, und jede Anwendung muss auf die spezielle imaging-System verwendet optimiert werden. Sollte darauf geachtet werden nicht zu lichtbedingten Zellen, aber es ist zugleich wichtig, effiziente Photoaktivierungen in den Stapel zu erhalten, um eine ausreichende Darstellung der aktivierten Zellen für nachgelagerte Analysen zu erhalten. Germinal Center B Zellen bilden in der Regel überall von 0,5 % ~ 2 % der Milz oder kutane B Lymphknotenzellen können, und wie die repräsentativen Ergebnisse (Abbildung 5) entnehmen kann, photoaktiviert einzelnen germinal Center B-Zellen ~ 1 % der gesamten Bevölkerung in einer einzigen Milz Scheibe vorhanden. Erfolgreiche Analyse oder einer erheblichen Anzahl von Zellen sortieren erfordert daher eine große Anzahl von Ereignissen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antikörper, 9D11-A568	Eigens erzeugtes		9D11-Hybridom, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von MC Carroll, markiert mit Kit: Biotium 92255
Antikörper, 9D11-A647	Eigens erzeugtes		9D11-Hybridom, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von MC Carroll, markiert mit Kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antikörper, FITC Anti-Maus CD45.1	Biolegend	110705
Antikörper, Pacific Blue Anti-Maus/humanes GL7-Antigen (T- und B-Zell-Aktivierungsmarker)	Biolegend	144613
Antikörper, PE Anti-Maus CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
Antikörper, PE/Cy7 Anti-Maus CD38	Biolegend	102717
Antikörper, PerCP/Cy5.5 Anti-Maus/humanes CD45R/B220	Biolegend	103235
Kapillarröhrchen, Mylar-umwickeltes, heparinisiertes	Fisher Scientific	211766
Cell Sieb, 70 & micro; m	Falcon	352350
Konische Röhrchen, 50 mL	Falcon	352235
Deckglas, quadratisch, 22x22 mm, 0,13-0,17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1,084,180,250
Ethanol, 70%	VWR	8301.360
Fötales Rinderserum	Life Technologies 10270106
Durchflusszytometer, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Durchflusszytometer, LSRFortessa SORP	BD Biosciences-Sonderbestellung		Produkt mit 4 Lasern (405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm)
Fett, Hochvakuum, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hämozytometer, Burker-Tü rk	VWR	630-1544
Isofluran, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Lymphozyten-Trennmedium (Lympholyte-M Zelltrennmedien)	Cedarlane	CL5035
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL (Eppendorf)	Sarstedt	72.690.550
Mikroskop, Zwei-Photonen	Prairie Technologies (jetzt Bruker)	-	Sonderbestellung Ultima In Vivo Zwei-Photonen-Mikroskop
Mörtel m. Lippe, unglasiert, 75 ml	VWR	410-0110
NaHCO3	Merck	1063290500
Nadel, 18 Gauge	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87.769.290
PBS	Sigma	d8537
Stößelhomogenisator	VWR	47747-358
Stößel, unglasiert, 175 mm	VWR	410-0122
Pipette, serographisch, 10 ml	VWR	612-3700
Pipette, Transfer, Kunststoff	Sarstedt	861,172,001
Kunststoff-Paraffinfolie (Parafilm M)	Bemis	PM996
Platte, 96-well	Falcon	353910
Chirurgische Zange, Student Dumont #5 Pinzette	FST - Fine Science Tools	91150-20
Chirurgische Zange, Student Dumont #7 Pinzette	FST - Fine Science Tools	91197-00
Chirurgische Schere, Student Feinschere, gerade	FST - Fine Science Tools	91460-11
Spritze, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Spritze, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Spritze, 5 mL	Terumo	SS-05S1
Spritze, Insulin, 0,3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., enthält 200 mg Sulfadiazin und 40 mg Trimethoprim/ml	MSD Trypanblau-Lösung	431577
, 0,4	VWR	K940-100ML
Viabilitätsfarbstoff, eBioscience Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14