Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.
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Methodenartikel
Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein wesentlicher Aspekt der Immunantwort auf bakterielle Besiedlung des Gastgebers ist Phagozytose. Ein Opsonophagocytic-Tötung-Assay (OPKA) ist ein experimentelles Verfahren, in dem phagocytic Zellen mit bakteriellen Einheiten Co kultiviert sind. Die Immunzellen werden phagozytieren und töten die Bakterienkulturen in einer Ergänzung-abhängigen Weise. Die Effizienz der immun-vermittelte Zelle Tötung ist eine Reihe von Faktoren abhängig und kann verwendet werden, um festzustellen, wie die verschiedenen bakteriellen Kulturen zu vergleichen, in Bezug auf Widerstand zum Zelltod führt. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von potenziellen immun-basierten Therapeutika gegen bestimmte Bakterienstämme und/oder Serotypen beurteilt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine vereinfachte OPKA, die grundlegende Kulturbedingungen und Zelle zählen, um bakterielle Zellviabilität nach Kokultur mit Behandlung und HL-60 Immunzellen bestimmen verwendet. Diese Methode wurde erfolgreich mit einer Reihe von verschiedenen Pneumokokken-Serotypen, Kapsel und Acapsular Stämme und andere Bakterienarten genutzt. Die Vorteile dieses OPKA-Protokolls sind seine Einfachheit, Vielseitigkeit, (da dieser Test auf Antikörper Behandlungen wie Opsonins nicht beschränkt), und Minimierung von Zeit und Reagenzien zu grundlegenden experimentelle Gruppen zu beurteilen.
Einleitung
Die Opsonophagocytic töten Assay (OPKA) ist ein wichtiges Werkzeug für spätere Änderungen der Immunantwort und Funktion Änderungen in bakteriellen Struktur oder Funktion verlinken. Als solche häufig dient es als eine ergänzende Assay immun-basierte Wirksamkeit von Antikörper-Therapien, Impfstoffkandidaten, Enzym-Optimierung zu bestimmen. In-vivo-Tests sind notwendig, um effektive Räumung oder Schutz in eine bakterielle Infektion-Modell zu bestimmen, kann die OPKA verwendet werden, um immun Beitrag zur bakteriellen Zelltod zu den grundlegende Komponenten bewerten: Bakterien, Immunzellen, und experimentelle Behandlungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die OPKAs geändert und für eine Vielzahl von Bakterien und Serotypen, darunter Streptococcus Pneumoniae1, Staphylococcus Aureus2, Pseudomonas Aeruginosa3verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese optimierten Assays verwendet werden, um verschiedene experimentelle Behandlungen, einschließlich der Möglichkeit eines Enzyms, das Bakterium zugänglicher zu ergänzen-vermittelten immunen Zellen4 und Antikörper-Behandlungen zur Verbesserung machen bewerten Opsonization5. Klassisch, OPKA Assay erfolgreich eingesetzt in der Grundlagenforschung und klinische Forschung Einstellungen als ein aussagekräftiger Indikator für Schutz induziert durch Erreger-spezifischen Antikörper6,7,8,9 .
Verschiedene Arten von Immunzellen können zur Beurteilung der Opsonophagocytic töten verwendet werden. Eine häufig verwendete phagocytic Bevölkerung ist der HL-60 menschlichen leukämischen Zell-Linie. Diese Zelllinie kann als inaktivierte Promyelocytes in Kultur gehalten werden; jedoch können sie in verschiedene aktivierte Zustände über verschiedene Drogen Behandlungen10,11unterschieden werden. Behandlung von HL60 mit N, N-Dimethylformamid unterscheidet die Zellinie in aktivierten Neutrophilen mit starken phagocytic Aktivität11. Während HL-60 Zellen optimiert wurden und werden häufig für die Phagozytose Assays10verwendet, können andere primäre polymorphkernigen Leukozyten als immun Arm der Experiment-12verwendet werden.
Darüber hinaus können diese Assays vereinfachte13 oder14 betrachten mehrere Antibiotika-resistente Bakterienstämme der zu prüfenden gemultiplext. Die Multiplex-Methode worden eher möglich durch die Entwicklung von Software erzielt, die effizient bakterielle Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Spot auf einem Agar-Platte15zählen kann. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode mit ein Bakterienstamm, HL-60-Zellen, Baby-Kaninchen-Ergänzung und Blutagar Platten. Mit dieser Methode können mehrere Behandlungen schnell beurteilt werden, um spezifische Forschung Fragen auf wie der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektion moduliert werden kann.
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Protokoll
(1) Kultur, Differenzierung und Validierung von HL-60 Zellen
- HL-60 Zellkulturmedien bestehend aus 500 mL RPMI mit L-Glutamin und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum vorzubereiten. Fügen Sie keine Antibiotika, da dies die Differenzierung der HL-60 Zellen beeinflussen kann.
- Für die Vermehrung/Wartung von HL-60 Zellen entlüftet Kultur 5 x 106 Zellen in HL-60 Zellkulturmedien 75 cm2 10 mL Fläschchen bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Passage Zellen alle 3−4 Tage, optimale Zelle Konzentrationen beizubehalten.
Hinweis: Die Zellkonzentration sollte 5 x 106/mL nicht überschreiten. - Generieren Sie arbeiten Bestände von HL-60 Zellen durch Aliquotierung ca. 1 x 106 Zellen/mL in HL60 Kulturmedien mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in 1 mL Kryo Röhrchen.
Hinweis: Funktionierende Aktien können bei-80 ° c gelagert werden Der Meister Bestand sollte bei-120 ° c gelagert werden - Differenzieren Sie HL-60 Zellen durch Kultivierung 1,5 x 107 Zellen in 15 mL HL-60 Zellkulturmedien mit 0,6 % N, N-Dimethylformamid (DMF) bei 37 ° C und 5 % CO2 in steriler Filter-capped 75 cm2 Flaschen für 3 Tage vor OPKA.
- Überprüfen Sie, ob die HL-60-Zellen erfolgreich differenziert haben und eignen sich für den Einsatz in der OPKA-Test testen Lebensfähigkeit und Zelle Oberflächenmarker nach etablierten Flow Cytometry Protokolle16,17, 18,19. Ernten Sie nach Differenzierung HL-60 Zellen und Flecken Sie ca. 1 x 104 Zellen mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern/Flecken für CD71, CD35, annexin V und Propidium Jodid.
Hinweis: Differenzierte Zellen sollte ≥65 % lebensfähig, ≥55 % CD35+, und ≤20 % CD71+ durch bestimmt gegründet Validierung Protokolle14 (Abbildung 1).
2. Vorbereitung des OPKA Puffer und Reagenzien
- Bereiten Sie 50 mL sterile Opsonization Puffer B (OBB vor) durch Mischen 42,5 mL sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg+ 2, 5 mL des Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und 2,5 mL 0,1 % sterile Gelatine. Shop bei 4 ° C.
- Erhalten Sie Baby Kaninchen ergänzen und speichern bei-80 ° C.
- Zu erhalten Sie, oder bereiten Sie Bakterienkultur Platten (d. h. 15 x 100 mm2 5 % Schafe Blutagar Platten).
3. Vorbereitung der bakteriellen Lager Proben
- Erhalten Sie einen Vorrat an der bakteriellen Angabe getestet werden.
Hinweis: Für dieses Protokoll, Serotyp 3 Streptococcus Pneumoniae (WU2, großzügig zur Verfügung gestellt von Dr. Moon Nahm) verwendet wird. - Wachsen Sie die bakterielle Belastung in einer entsprechenden Brühe (d. h. Todd Hewitt Brühe + 0,5 % Hefeextrakt für diese Sorte WU2) für ca. 2−4 h bei 37 ° C.
Hinweis: Die Extinktion bei 600 nm (OD600) der Kultur sollte zwischen 0,6 und 0,8. - Pellet-die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 2 min und Aufschwemmen der Zellen in 10−30 mL 15 % Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquoten die Bakterienkultur (500 µL pro aliquoten) in sterilen 1,5 mL Zentrifuge Tuben und Speicher bei-80 ° C.
- Eine Durchstechflasche bakterielle bestand in einem 37 ° C Wasserbad aufzutauen. Pellet-die Bakterienzellen und in 500 µL OBB unter sterilen Bedingungen aufzuwirbeln.
- Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen der bakteriellen Aktien OBB (d. h. 10 µL keine Verdünnung, 10 µL 01:10, 10 µL 1: 100, etc.). Führen Sie OPKA Assay (Abschnitte 4 – 6, einschließlich HL-60/Ergänzung Kokultur), wie beschrieben unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen von der unbehandelten bakteriellen bestand. Kultur die Platten über Nacht bei 30 ° C (CO2).
Hinweis: Die Temperatur von 30 ° C ist spezifisch für WU2 Überwucherung zu verhindern; andere Stämme/Serotypen kann optimal bei 37 ° c wachsen. - Zählen der Kolonien für jede Verwässerung des unbehandelten bakteriellen Lager zusammen mit HL-60 Zellen und Ergänzung kultiviert. Bestimmen Sie, welche Verdünnung der Bakterien die optimale Anzahl von zählbaren Kolonien (etwa 80−120 KBE für unbehandelte Bakterien zusammen mit HL-60 Zellen kultiviert) ergibt. Beachten Sie diese Verdünnung für zukünftige OPKAs mit dieser bakteriellen bestand.
4. bakterielle Behandlung und Kultur
- Tauen Sie eine Tube bakterielle Lager in Schritt 3.3 vorbereitet. Pellet-Bakterien (6.000 X g für 2 min) und Zelle Pellet in OBB bei optimalen Verdünnung gemäß Schritt 3.6 aufzuwirbeln.
- Pipette 10 µL resuspendierte bakterielle Verdünnung pro Bohrloch in einer Kultur Rundboden 96-Well Zellplatte.
- Geben Sie 20 µL des entsprechenden Antikörper oder medikamentöse Behandlung in jeder experimentellen in zweifacher Ausfertigung.
Hinweis: In diesem Protokoll wird ein Serotyp-spezifische Antikörper in Mäusen erzeugt als Behandlung X und ein Glykosid Hydrolase Enzym bekannt zu die Serotyp 3 Polysaccharid-Kapsel zu erniedrigen ist als Therapie Y (Abbildung 2)4,20hinzugefügt. Verwenden Sie für Kontroll-Vertiefungen 1 x PBS oder OBB, abhängig von der Puffer für die Behandlung Brunnen verwendet. - Schütteln Sie Probenteller mit ca. 90 u/min für 1 h bei Raumtemperatur. Passen Sie diese abhängig von der optimalen Temperatur oder schütteln Bedingungen der Behandlungen getestet.
5. HL-60 Co Bakterienkultur
- Bereiten Sie HL-60 Zellen durch die HL-60 differenzierte Zellen, die mit DMF behandelt werden drei Tage vor (siehe Punkt 1.4) in 15 mL konische Röhrchen Ernte vor. Pellet-Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand zu verwerfen und mit mindestens 10 mL 1 X PBS waschen.
- Pellet-die gewaschenen Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in OBB (beginnen Sie mit 1 mL OBB und für eine Endkonzentration von 1 x 107/mL nach Zellzählung anpassen).
- Fügen Sie Baby-Kaninchen-Ergänzung (steril, unverdünnt Baby-Kaninchen-Serum, Alter 3−4 Wochen) zu einem Endvolumen von 1:5.
Hinweis: Die Endkonzentration der HL-60-Ergänzung Mischung sollte 1 x 107/mL. Wenn Ergänzung Abhängigkeit zu testen, kann eine zweite Lösung mit aktiven HL-60-Zellen mit Hitze-inaktivierten Ergänzung verwendet werden (Ergänzung durch Inkubation in einem Wasserbad bei inaktiviert werden kann > 55 ° C für mindestens 30 min). - Nach 1 h Bakterienkultur komplett (4.4) ist, teilen Sie jede Probe (d. h. 10 µL jeder 30 µL Probe in zwei neue Brunnen) in doppelte Brunnen für zwei Gruppen (z. B. Nutzung nur 20 µL der ursprünglichen 30 µL Kokultur Pipettieren Fehler ausmachen) : ein Satz wird Co kultiviert mit HL-60-Ergänzung und eine beinhaltet nur Bakterien. Fügen Sie 50 µL der HL-60-Ergänzung Mischung (aus Schritt 5.3) auf die einzelnen experimentellen Wells (Delegierte + HL-60); Fügen Sie 50 µL OBB allein in die Vertiefungen der Bakterien nur (Delegierte -HL-60).
Hinweis: In diesem Beispiel werden ca. 800 bakterielle KBE für die anfängliche Kokultur mit 5 x 10550 µL HL-60 Zellen verwendet. Diese Multiplizität der Infektion zu hoch oder zu niedrig, wie letzte Kolonie Zahlen angegeben, passen Sie die bakterielle Anfangsverdünnung im Gegensatz zu den HL-60-Zellzahl. - Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 1 h (CO2).
6. Probieren Sie Beschichtung und Inkubation über Nacht
- Verdünnen Sie jeweils gut 1:5 mit OBB, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 µL hat.
- Pipette 50 µL jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer Bakterienkultur Platte, ausreichend Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Für 15 x 100 mm Runde2 Agarplatten, Pipettieren ca. 4 Proben auf einer Platte.
- Decken und Proben für ca. 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Invertieren Sie Platten und Kultur über Nacht bei 30 ° C (CO2). Alternativ Kultur Platten in anaeroben Gläsern zu testen, ob anoxische Bedingungen das bakterielle Wachstum beeinflussen oder zu kontrollieren für Morphologie.
- Zählen Sie nach Übernachtung Kultur die Kolonien in jeder bestimmten Musterbereich. Analysieren von Daten durch den Vergleich der Anzahl von lebenden Zellen in jedem Satz an den entsprechenden Regler und/oder Proben, die nicht HL-60 Co Zellkultur erhalten (indikativ für 100 % Zelle überleben, 0 % Zelle Tötung).
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Ergebnisse
Validierung von HL-60 Differenzierung sollte vor Beginn der OPKA durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden mit Durchflusszytometrie um zu bestimmen, die extrazellulären Ausdruck von CD11b, CD35, CD71 und annexin V (Abbildung 1). Propidium Jodid kann auch als Lebensfähigkeit Marker verwendet werden. Nach der Behandlung mit DMF für 3 Tage, Ausdruck der CD35 erhöht werden sollte (≥55 % aller Zellen) und Ausdruck der CD71 verringert werden sollte (≤20 % aller Zellen). Der Prozentsatz von an...
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Diskussion
OPKAs dienen die entscheidende Rolle bei der Beurteilung der Antikörper-vermittelten Immunantwort induziert durch Impfungen6,8. Die Hauptbedeutung dieser vereinfachten OPKA ist die Anpassungsfähigkeit der Bedingungen getestet werden (d. h., Antikörper, Enzym-Behandlungen). In diesem Sinne während dieser Assay verwendet werden kann, um den Beitrag von Opsonins (z.B. Antikörper) in Phagozytose, testen sie auch lässt sich beurteilen, Wege zur Überwindung von Virulen...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) für seine unschätzbare Hilfe bei der Gründung OPKA Tests in unserem Labor. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant 1R01AI123383-01A1, FYA unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Annexin V (APC-konjugiert) | BioLegend | 640919 | |
| Anti-CD35, menschlich (PE-konjugiert) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, menschlich (PE-konjugiert) | BioLegend | 334105 | |
| zu verwendender Bakterienstamm (z. B. Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| Blut-Agar-Platten | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Klon-Serum | HyClone | SH30080.03 | |
| Glycerin | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 Zellen | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotyp-Kontrolle (PE-konjugiert) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-Dimethylformamid (DMF) | Fisher Chemikalie | UN2265 | |
| Propidiumiodid | Sigma | P4864 | |
| RPMI Medien mit L-Glutamin | Corning | 10-040-CV |
Referenzen
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