Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

Zusammenfassung

Neuartige, immunstaining-kompatible Gewebeclearing-Techniken wie die ultimative 3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen ermöglichen die 3D-Visualisierung von Tollwutvirus-Hirninfektionen und ihrer komplexen zellulären Umgebung. Dicke, antikörperbeschriftete Hirngewebescheiben werden optisch transparent gemacht, um die Bildtiefe zu erhöhen und eine 3D-Analyse durch konfokale Laserscanmikroskopie zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die Visualisierung von Infektionsprozessen in Geweben und Organen durch Immunlabeling ist eine Schlüsselmethode in der modernen Infektionsbiologie. Die Fähigkeit, die Verteilung, den Tropismus und die Häufigkeit von Krankheitserregern innerhalb des Organgewebes zu beobachten und zu untersuchen, liefert entscheidende Daten über die Entwicklung und das Fortschreiten von Krankheiten. Mit herkömmlichen Mikroskopieverfahren ist die Immunkennzeichnung meist auf dünne Abschnitte beschränkt, die aus paraffineingebetteten oder gefrorenen Proben gewonnen werden. Die begrenzte 2D-Bildebene dieser dünnen Abschnitte kann jedoch zum Verlust wichtiger Informationen über die komplexe Struktur eines infizierten Organs und den zellulären Kontext der Infektion führen. Moderne mehrfarbige, immunstaining-kompatible Gewebeclearing-Techniken bieten jetzt eine relativ schnelle und kostengünstige Möglichkeit, hochvolumige 3D-Bildstapel von vireninfiziertem Organgewebe zu untersuchen. Durch die Exposition des Gewebes gegenüber organischen Lösungsmitteln wird es optisch transparent. Dies entspricht den Brechungsindizes der Stichprobe und führt schließlich zu einer signifikanten Reduzierung der Lichtstreuung. So können in Kombination mit langen freien Arbeitswegobjektiven große Gewebeabschnitte bis zu einer Größe von 1 mm durch die konventionelle konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) mit hoher Auflösung abgebildet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Anwendung von Tiefengewebe-Bildgebung nach Gewebeklärung, um die Verteilung von Tollwutviren in infizierten Gehirnen zu visualisieren, um Themen wie Viruspathogenese, Ausbreitung, Tropismus und Neuroinvasion zu untersuchen.

Einleitung

Herkömmliche Histologietechniken basieren meist auf dünnen Abschnitten von Organgeweben, die von Natur aus nur 2D-Einblicke in eine komplexe 3D-Umgebung liefern können. Obwohl grundsätzlich machbar, erfordert die 3D-Rekonstruktion aus seriellen dünner Abschnitte anspruchsvolle technische Rohrleitungen sowohl für das Schneiden als auch für die anschließende Silico-Ausrichtung der aufgenommenen Bilder¹. Darüber hinaus ist eine nahtlose Rekonstruktion von Z-Volumes nach dem Mikrotom-Schneiden von entscheidender Bedeutung, da sowohl mechanische als auch rechnerische Artefakte aufgrund einer suboptimalen Bildregistrierung bleiben können, die durch nicht überlappende Bildebenen, Färbungsvariationen und physikalische Zerstörung von Gewebe z.B. durch die Mikrotomklinge. Im Gegensatz dazu ermöglicht das reine optische Schneiden intakter dicker Gewebeproben die Erfassung überlappender Bildebenen (Oversampling) und erleichtert damit die 3D-Rekonstruktion. Dies wiederum ist sehr vorteilhaft für die Analyse von Infektionsprozessen in komplexen Zellpopulationen (z.B. neuronale Netzwerke im Kontext der umgebenden Glia- und Immunzellen). Zu den inhärenten Hindernissen dicker Gewebeabschnitte gehören jedoch Lichtstreuung und ein begrenztes Eindringen von Antikörpern in das Gewebe. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt und optimiert, um diese Probleme zu überwinden^2,3,^{4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Im Wesentlichen werden Zielgewebe durch Behandlung mit wässrigen^{2,3,4,5,6,7 optisch transparent gedreht ,8,9} oder organische lösemittelbasierte^10,11,12,13 Lösungen. Die Einführung von 3DISCO (3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen)^11,12 und seinem Nachfolger uDISCO (ultimative 3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen)¹³ bot ein relativ schnelles, einfaches und kostengünstiges Werkzeug mit hervorragende Clearing-Fähigkeiten. Die Hauptbestandteile des Clearingprotokolls sind die organischen Lösungsmittel tert-Butanol (TBA), Benzylalkohol (BA), Benzylbenzoat (BB) und Diphenylether (DPE). Die Entwicklung und Zugabe von iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)¹⁴, ein kompatibles Immunstaining-Protokoll, stellte einen weiteren Vorteil gegenüber bestehenden Methoden dar und ermöglichte die Tiefengewebekennzeichnung von Antigenen sowie die langfristige Lagerung von immunbefleckten Proben. So ermöglicht die Kombination von iDISCO¹⁴ und uDISCO¹³ die hochauflösende Bildgebung von antikörperbeschriftten Proteinen in großen Gewebeabschnitten (bis zu 1 mm) mit herkömmlichem CLSM.

Die Erhaltung der komplexen Struktur eines Organs in allen drei Dimensionen ist besonders wichtig für das Hirngewebe. Neuronen bestehen aus einer sehr heterogenen zellulären Subpopulation mit sehr unterschiedlichen 3D-Morphologien, die auf ihren Neuritenprojektionen basieren (rezensiert von Masland¹⁵). Darüber hinaus besteht das Gehirn aus einer Reihe von Kompartimenten und Unterabteilungen, die jeweils aus verschiedenen zellulären Subpopulationen und Verhältnissen davon bestehen, einschließlich Gliazellen und Neuronen (überprüft von Bartheld et al.¹⁶). Als neurotropes Virus infiziert das Tollwutvirus (RABV, überprüft von Fooks et al.¹⁷) in erster Linie Neuronen, indem es ihre Transportmaschinen nutzt, um in retrograde Richtung entlang von Axonen vom primären Infektionsort zum zentralnervösen System (ZNS) zu reisen. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1A) ermöglicht die immunstainierungsunterstützte Detektion und Visualisierung von RABV- und RABV-infizierten Zellen in großen, kohärenten Bildstapeln aus infiziertem Hirngewebe. Dies ermöglicht eine unvoreingenommene, hochauflösende 3D-Bewertung der Infektionsumgebung. Es gilt für Hirngewebe aus einer Vielzahl von Arten, kann unmittelbar nach der Fixierung oder nach der Langzeitlagerung von Proben in Paraformaldehyd (PFA) durchgeführt werden und ermöglicht die Lagerung und Reimaging von gefärbten und gereinigten Proben für Monate.

Protokoll

RABV-infiziertes, PFA-fixiertes archiviertes Hirnmaterial wurde verwendet. Die jeweiligen Tierversuchsstudien wurden von der zuständigen Tierpflege-, Einsatz- und Ethikkommission des Landesamtes für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei in Mecklenburg-Vorpommern (LALFF M-V) ausgewertet und mit Genehmigungen genehmigt. 7221.3-2.1-002/11 (Mäuse) und 7221.3-1-068/16 (Ferrets). Die allgemeine Pflege und die in den Tierversuchen verwendeten Methoden wurden nach den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

VORSICHT: Dieses Protokoll verwendet verschiedene toxische und/oder schädliche Substanzen, einschließlich PFA, Methanol (MeOH), Wasserstoffperoxid (H₂O2 ), Natriumazid (NaN₃), TBA, BA, BB und DPE. MeOH und TBA sind leicht entzündlich. Vermeiden Sie die Exposition, indem Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Labormantel, Handschuhe und Augenschutz) tragen und Experimente in einer Dunstabzugshaube durchführen. Sammeln Sie Abfälle getrennt in geeigneten Behältern und entsorgen Sie sie gemäß den örtlichen Vorschriften. Das Tollwutvirus wird als Biosicherheits-Level (BSL)-2-Erreger eingestuft und kann daher in der Regel unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden. Einige Aktivitäten, einschließlich Verfahren, die Aerosole erzeugen, mit hohen Viruskonzentrationen arbeiten oder mit neuartigen Lyssaviren arbeiten, können eine BSL-3-Klassifizierung erfordern. Die Präexpositionsprophylaxe wird für Hochrisikopersonal empfohlen, einschließlich Tierpfleger und Laborarbeiter^18,19. Beziehen Sie sich auf die Vorschriften der lokalen Behörden.

1. Fixierung von Hirngewebe und Schnitt

1. Fixieren Sie Hirnproben in einem geeigneten Volumen von 4% PFA in phosphatgepufferter Saline (PBS [pH 7.4]) für mindestens 48 h bei 4 °C (mit einem ungefähren Gewebe-zu-Fixativen Verhältnis von 1:10 [v/v]).
2. Waschen Sie die Gewebeproben 3x in PBS für mindestens 30 min jeder Wäsche und lagern Sie sie in 0,02% NaN₃/PBS bei 4 °C bis zur Verwendung.
3. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Vibratom in 1 mm dicke Abschnitte (Blattvorschubrate: 0,3–0,5 mm/s, Amplitude: 1 mm, Scheibendicke: 1.000 m).
4. Um die richtige Slice-Sequenz beizubehalten, bewahren Sie jeden Gewebeabschnitt separat in einem Brunnen einer Multiwell-Zellkulturplatte auf. Fügen Sie 0,02% NaN₃/PBS hinzu und lagern Sie die Gewebeabschnitte bei 4 °C bis zur Anwendung.

2. Probenvorbehandlung mit Methanol

HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Schwingung und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Die Probenvorbehandlung dient dem allgemeinen Zweck der Verbesserung der Antikörperdiffusion und der Verringerungder Gewebeautofluoreszenz durch Exposition gegenüber MeOH bzw. H2 O2 , bzw.¹⁴.

1. Bereiten Sie 20% (v/v), 40%, 60% und 80% MeOH-Lösungen in destilliertem Wasser vor. Zum Beispiel, für 20% MeOH, fügen Sie 10 ml von 100% MeOH zu 40 ml destilliertem Wasser in einem geeigneten verschließbaren Gefäß und mischen, indem Sie es invertieren.
2. Übertragen Sie die Proben auf halbwegs große Gefäße (z. B. 5 ml Reaktionsrohre). Achten Sie darauf, Materialien zu verwenden, die chemisch beständig gegen die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien sind. Beachten Sie beispielsweise, dass Polypropylen zwar geeignet ist, Polystyrol jedoch nicht geeignet ist.
   HINWEIS: Die Volumenspezifikationen in diesem Protokoll beziehen sich auf 5 ml Reaktionsrohre. Wenn ein anderes Gefäß verwendet wird, passen Sie die Volumina entsprechend an.
3. Inkubieren Sie die Proben in 4 ml jeder Konzentration der vorbereiteten Serie von MeOH-Lösungen in aufsteigender Reihenfolge für jeweils 1 h.
4. Inkubieren Sie die Proben 2x für je 1 h in rein (100%) MeOH.
5. Kühlen Sie die Proben auf 4 °C (z.B. in einem laborsicheren Kühlschrank).
6. Bereiten Sie Bleichlösung (5% H₂O2 in MeOH) vor, indem Sie z.B. eine 30% H2 O2-Lagerlösung bei 1:6 in rein (100%) verdünnen MeOH, und kühlen Sie es bei 4 °C.
7. Entfernen Sie die 100% MeOH aus den gekühlten Proben und fügen Sie 4 ml vorgekühlte Bleichlösung hinzu (5% H₂O2 in MeOH). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
8. Tauschen Sie die Bleichlösung gegen 4 ml 80% MeOH und inkubieren Sie für 1 h. Verwenden Sie die vorbereitete Reihe von MeOH-Lösungen in absteigender Reihenfolge für jeweils 1 h, bis die Proben für 1 h in 4 ml von 20% MeOH inkubiert wurden.
9. Waschen Sie die Proben 1x für 1 h mit 4 ml PBS.

3. Immunostaining

HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Schwingung und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Um mikrobielles Wachstum zu verhindern, fügen Sie NaN₃ zu einer Endkonzentration von 0,02% zu den Lösungen in diesem Abschnitt hinzu. Gewebeproben werden durch die Behandlung mit den nichtionischen Reinigungsmitteln Triton X-100 und Tween 20 weiter durchlässig. Normales Serum wird verwendet, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Glycin und Heparin werden hinzugefügt, um den Immunlabeling-Hintergrund¹⁴zu reduzieren.

1. Waschen Sie die Proben 2x für je 1 h in 4 ml 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Permeabilisieren Sie die Proben für 2 Tage bei 37 °C mit 4 ml 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M Glycin/PBS.
3. Blockieren Sie die unspezifische Bindung von Antikörpern, indem Sie die Proben 2 Tage lang bei 37 °C in 4 ml mit 0,2 % Triton X-100/10% DMSO/6% normales Serum/PBS inkubieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie normales Serum von derselben Spezies, in dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde, um ideale Blockierungsergebnisse zu erzielen.
4. Inkubieren Sie die Proben in 2 ml Primärantikörperlösung (3% normales Serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 mit Heparin] + Primärantikörper/Antikörper) 5 Tage bei 37 °C. Erfrischen Sie die primäre Antikörperlösung nach 2,5 Tagen.
   1. Für PTwH das Heparin-Natriumsalz in destilliertem Wasser zu einer 10 mg/ml-Stammlösung rekonstituieren (diese Lösung, aliquoted, bei 4 °C lagern). Fügen Sie die Lagerlösung auf 0,2% Tween 20/PBS zu einer Endkonzentration von 10 g/ml hinzu.
      HINWEIS: Die Auswahl der richtigen Antikörperverdünnung kann eine Optimierung erfordern. Im Allgemeinen sind Standard-Immunhistochemie-Konzentrationen ein guter Ausgangspunkt.
5. Waschen Sie die Proben für 1 Tag in 4 ml PTwH, tauschen Sie den Waschpuffer mindestens 4x–5x im Laufe des Tages und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht.
6. Inkubieren Sie die Proben in 2 ml sekundärer Antikörperlösung (3% normales Serum/PTwH + Sekundärantikörper/Antikörper) für 5 Tage bei 37 °C. Erfrischen Sie die sekundäre Antikörperlösung nach 2,5 Tagen.
   1. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper/Antikörper bei 1:500 in sekundärer Antikörperlösung (d. h. 4 l in 2 ml).
7. Waschen Sie die Proben für 1 Tag, wie in Schritt 3.5 beschrieben, so dass die letzte Wäsche über Nacht eingeschaltet.

4. Nukleare Färbung

HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Schwingung und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Wenn keine kerntechnische Färbung erforderlich ist oder die Anregungswellenlänge/Emissionsspektrum von TO-PRO-3 für die Anregung oder detektion eines anderen Fluorophors erforderlich ist, überspringen Sie diesen Schritt.

1. Den Nukleinsäurefleck TO-PRO-3 bei 1:1.000 in PTwH verdünnen und die Proben in 4 ml Kernfärbungslösung für 5 h inkubieren.
2. Waschen Sie die Proben für 1 Tag, wie in Schritt 3.5 beschrieben, so dass die letzte Wäsche über Nacht eingeschaltet.
   HINWEIS: Nach den Wässern können die Proben bis zur optischen Räumung bei 4 °C in PBS gelagert werden.

5. Geweberäumung

HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Schwingung und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Die Gewebeproben werden in einer abgestuften Reihe von TBA-Lösungen dehydriert. Da die Immunfärbung wässrige Lösungen erfordert, müssen alle Färbeverfahren vor der Geweberäumung abgeschlossen sein. Optische Clearance und Brechungsindex-Matching werden durch die Behandlung mit einer Mischung aus BA, BB und DPE erreicht. Die Clearing-Lösung wird mit DL-A-Tocopherol als Antioxidans¹³ergänzt.

1. Bereiten Sie 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% und 96% TBA-Lösungen in destilliertem Wasser vor. Zum Beispiel, für 30% TBA, fügen Sie 15 ml von 100% TBA zu 35 ml destilliertem Wasser in einem geeigneten verschließbaren Gefäß und mischen durch Inverting.
   HINWEIS: TBA hat einen Schmelzpunkt von 25–26 °C; daher neigt es dazu, bei Raumtemperatur fest zu sein. Um TBA-Lösungen vorzubereiten, erhitzen Sie die gut verschlossene Flasche bei 37 °C in einem Inkubator oder Wasserbad.
2. Dehydrieren Sie die Proben mit 4 ml jeder Konzentration der vorbereiteten Serie von TBA-Lösungen in aufsteigender Reihenfolge für jeweils 2 h. Lassen Sie die 96% TBA über Nacht.
3. Dehydrieren Sie die Proben weiter in rein (100%) TBA für 2 h.
4. Vorbereiten der Clearinglösung BABB-D15.
   HINWEIS: BABB-D15 ist eine Kombination aus BA und BB (BABB), die mit DPE im Verhältnis x:1 gemischt wird, wobei x im Namen der Lösung angegeben ist, in diesem Fall 15.
   1. Für BABB einteiliges BA mit zwei Teilen BB mischen.
   2. Mischen Sie BABB und DPE im Verhältnis 15:1.
   3. Fügen Sie 0,4 Vol% DL--Tocopherol (Vitamin E) hinzu.
      HINWEIS: Zum Beispiel für 20 ml BABB-D15 6,25 ml BA mit 12,5 ml BB mischen. Fügen Sie 1,25 ml DPE hinzu und ergänzen Sie es mit 0,08 ml DL-A-Tocopherol.
5. Löschen Sie die Proben in der Clearinglösung, bis sie optisch transparent sind (2-6 h).
6. Die Proben können bei 4 °C in BABB-D15, vor Licht geschützt, bis zur Montage und Bildgebung gelagert werden.

6. Probenmontage

1. Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die Bildkammer und den Deckel (Material: copolyester [CPE], Düse: 0,25 mm, Schichthöhe: 0,06 mm, Wandstärke: 0,88 mm, Wandanzahl: 4, Füllung: 100%, keine Tragstruktur; die entsprechende . Die STL-Datei finden Sie in den Ergänzenden Materialien dieses Protokolls).
2. Montieren Sie die Bildgebungskammer (Abbildung 2).
   1. Montieren Sie einen runden Abdecksch (Durchmesser: 30 mm) auf der Bildkammer mit RTV-1 (Einkomponenten Raum-Temperatur-vulkanisierender) Silikonkautschuk. Entfernen Sie den überschüssigen Silikonkautschuk mit einem wasserbenetzten Wattestäbchen und härten Sie ihn über Nacht aus.
   2. Montieren Sie einen runden Abdeckschlupf (Durchmesser: 22 mm) auf dem Deckel mit RTV-1 Silikonkautschuk. Entfernen Sie den überschüssigen Silikonkautschuk mit einem wasserbenetzten Wattestäbchen und härten Sie ihn über Nacht aus.
3. Legen Sie die Probe in eine Bildkammer, fügen Sie ein kleines Volumen BABB-D15 hinzu, und legen Sie den Deckel ein. Füllen Sie die Kammer mit BABB-D15 durch den Einlass, mit einer hypodermischen Nadel (27 G x 3/4 Zoll [0,40 mm x 20 mm]).
4. Stecken Sie den Einlass und versiegeln Sie die Bildkammer mit RTV-1 Silikonkautschuk. Über Nacht im Dunkeln heilen.

7. Bildgebung und Bildverarbeitung

1. Richten Sie die Bildaufnahme ein, indem Sie die jeweiligen Laserlinien entsprechend den verwendeten Fluorophoren auswählen. Passen Sie die Erfassungsbereiche jedes Detektors an, um Signalüberlappungen zwischen Kanälen zu verhindern.
   HINWEIS: Die Beispielreichweiten für Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 und TO-PRO-3 betragen 500–550 nm, 590–620 nm bzw. 645–700 nm.
2. Wählen Sie die Erfassungsparameter aus, definieren Sie den oberen und unteren Rand des Z-Stacks, und erfassen Sie den Image-Stack.
   HINWEIS: Beispielhafte Erfassungsparameter sind ein sequenzieller Scan mit einer Pixelgröße von 60-90 nm, einer Z-Schritt-Größe von 0,5 m, einem Liniendurchschnitt von 1, einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz und einer Lochgröße von 1 Airy-Einheit.
3. Verarbeiten Sie den Bildstapel mit einer geeigneten Bildanalysesoftware (z. B. Fidschi), um 3D-Projektionen zu generieren oder detaillierte Analysen durchzuführen.
   HINWEIS: Aufgrund der großen Größe der erworbenen Bilddateien ist in der Regel die Verwendung einer Arbeitsstation erforderlich.
   1. Öffnen Sie die Aufnahme- oder Bilddatei(en) in Fidschi (Datei | Öffnen | Dateien auswählen).
      1. Wenn Sie z. B. . LIF-Dateien, wählen Oder deaktivieren Sie die Gewünschten Optionen im Dialogfenster Bio-Formats. Stapel mit Hyperstackanzeigen . Abgesehen davon sind keine spezifischen Auswahlen oder Ticks erforderlich. Drücken Sie OK.
      2. Wenn die Datei mehrere Bildstapel enthält, wählen Sie die zu analysierenden aus und bestätigen Sie, indem Sie OKdrücken.
   2. Bleichkorrektur durchführen, indem das zusammengeführte Bild in einzelne Kanäle aufgeteilt wird (Bild | Farbe | Channels Tool, wählen Sie dann Mehr | Split-Kanäle). Wählen Sie für jeden Kanal die Bleichkorrektur aus (Bild | Anpassen | Bleichkorrektur) und wählen Sie Simple Ratio (Hintergrundintensität: 0,0).
      HINWEIS: In einigen Fällen, zum Beispiel, wenn es keinen linearen Zerfall des Signals oder das Signal ist zu schwach insgesamt, Simple Ratio kann fehlschlagen. Alternativ können Sie Exponential Fit ausprobieren oder die Bleichkorrektur überspringen.
   3. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal mit den Schiebereglern (Bild | Anpassen | Helligkeit | Kontrast).
   4. Zusammenführen der Kanäle (Bild | Farbe | Merge-Kanäle), erstellen Sie einen Verbund (Bild | Farbe | Channels Tool, wählen Sie dann Mehr | Erstellen Sie Composite, und konvertieren Sie es in das RGB-Format (Bild | Farbe | Channels Tool, wählen Sie dann Mehr | Konvertieren in RGB).
   5. Ändern Sie bei Bedarf die Größe des Bildstapels, um die Berechnungszeit und Dateigröße zu reduzieren(Bild | Anpassen | Größe, beide Optionen angekreuzt plus bilineare Interpolation).
   6. Generieren einer 3D-Projektion (Bild | Stapel | 3D-Projekt). Wählen Sie Hellester Punkt als Projektionsmethode aus, und legen Sie den Slice-Abstand so fest, dass er der Z-Schritt-Größe des erworbenen Bildstapels entspricht. Legen Sie für maximale Qualität das Drehwinkelinkrement auf 1 fest, und aktivieren Sie die Interpolation. Ändern Sie die Gesamtrotation, Transparenzschwellenwerte und Deckkraft nach Bedarf.
   7. Stellen Sie bei Bedarf den Kontrast und die Helligkeit wieder ein, indem Sie die 3D-Projektion wieder in das 8-Bit-Format konvertieren (Bild | Typ | 8-Bit). Verwenden Sie die entsprechenden Schieberegler (Bild | Anpassen | Helligkeit | Kontrast) und konvertieren Sie den Bildstapel wie in Schritt 7.3.4 beschrieben in das RGB-Format.
   8. Speichern Sie die 3D-Projektion als . TIF-Datei (Bilddateiformat) und . AVI-Datei (Videodateiformat).

Ergebnisse

Die Kombination von iDISCO¹⁴ und uDISCO¹³ in Verbindung mit hochauflösendem CLSM bietet tiefe Einblicke in die raumzeitliche Auflösung und Plastizität der RABV-Infektion von Hirngewebe und den umgebenden zellulären Kontext.

Mit Der Immunostainierung von RABV-Phosphoprotein (P) können komplexe Schichten infizierter neuronaler Zellen in dicken Abschnitten des Mausgehirns visualisiert werden (Abbildung 3). Anschließend ...

Diskussion

Das Wiederaufleben und die Weiterentwicklung von Gewebeclearing-Techniken in den letzten Jahren^{2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 ,}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Benzylalkohol	Alfa Aesar	41218	Clearing-Reagenz
Benzylbenzoat	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing-Reagenz
Dimethylsulfoxid	Carl Roth	4720.2	Verschiedene Puffer
Diphenylether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing-Reagenz
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidans
Eselserum	Bio-Rad	C06SBZ	Blockierungsreagenz
Glycin	Carl Roth	3908.2	Hintergrundreduktion
Ziegenserum	Merck	S26-100ML	Blockierungsreagenz
Heparin-Natriumsalz	Carl Roth	7692.1	Hintergrund Reduktion
Wasserstoffperoxidlösung (30 %)	Carl Roth	8070.2	Probenbleiche
Methanol	Carl Roth	4627.4	Probenvorbehandlung
Paraformaldehyd	Carl Roth	0335.3	Kristallines Pulver zur Herstellung einer Fixierlösung
Natriumazid	Carl Roth	K305.1	Verhinderung des mikrobiellen Wachstums in Stammlösungen
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Probendehydrierung für die Gewebereinigung
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nukleinsäurefärbung
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergens
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergens
Verschiedenes
5 mL Reaktion Röhrchen	Eppendorf	0030119401	Probenröhrchen
Deckglas, rund (Durchmesser: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Teil der Bildgebungskammer
Deckglas, rund (Durchmesser: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Teil der Bildgebungskammer
Injektionsnadel (27 G x ¾ ” [0,40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Befüllung der Bildgebungskammer mit Räumlösung
RTV-1 Silikonkautschuk	Wacker	Elastosil E43	Klebstoff für die Montage der Bildgebungskammer
Ultimaker CPE 2,85 mm transparentes	Ultimaker	8718836374869	Copolyester Filament für 3D-Drucker zum Drucken von Teilen der Bildgebungskammer
Technische Ausstattung und Software
3D-Drucker	Ultimaker	Ultimaker 2+	Druck der Bildgebungskammer
Automatisiertes Wasserimmersionssystem	Leica	15640019	Softwaregesteuerte Wasserpumpe
Tisch-Orbitalschüttler	Elmi	DOS-20M	Inkubation der Probe bei Raumtemperatur (~ 150 U/min)
Tisch-Orbitalschüttler, beheizt	New Brunswick Scientific	G24 Inkubation der Probe im Umweltschüttler	bei 37°; C (~ 150 rpm)
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverses konfokales Mikroskop für die Probenbildgebung
Fiji	NIH (ImageJ)	Open-Source-Software (v1.52h)	Bildverarbeitungspaket basierend auf ImageJ
Wasserimmersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample Slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
strong>Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospezifisches polyklonales Anti-RABV-N-Serum für Ziegen, hergestellt durch Immunisierung von Ziegen mit Baculovirus-exprimiertem und His-Tag-gereinigtem RABV-Nukleoprotein N Verdünnung: 1:400
Kaninchen-Anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyklonaler Antikörper (RRID:AB_10013382) Verdünnung: 1:100
Kaninchen-Anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyklonaler Antikörper (RRID:AB_776174) Verdünnung: 1:250
Kaninchen-Anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospezifisches polyklonales Kaninchen-Anti-RABV P Serum, hergestellt durch Kaninchenimmunisierung mit Baculovirus-exprimiertem und His-Tag-gereinigtem RABV-Phosphoprotein P (siehe Referenz 23: Orbanz et al., 2010) Verdünnung: 1:1.000
Sekundärantikörper
Esel-Anti-Ziegen-IgG	Thermo Fisher Scientific	Abhängigkeit von konjugierten Fluorophor	Hochgradig kreuzresorbiert Verdünnung: 1:500
Esel Anti-Maus IgG	Thermo Fisher Scientific	abhängig von konjugiertem Fluorophor	Hoch kreuzresorbiert Verdünnung: 1:500
Esel Anti-Kaninchen IgG	Thermo Fisher Scientific	abhängig von konjugiertem Fluorophor	Hochgradig kreuzresorbiert Verdünnung: 1:500
Ziege Anti-Maus IgG	Thermo Fisher Wissenschaftlich	abhängig von konjugiertem Fluorophor	Hochgradig kreuzabsorbiert Verdünnung: 1:500
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Thermo Fisher Scientific	abhängig von konjugiertem Fluorophor	Hochgradig kreuzresorbiert Verdünnung: 1:500