Summary
हम प्रोटोकॉल प्रस्तुत माउस दिल विकास की जांच करने के लिए माउस भ्रूण पर पूरे माउंट epiफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग वेंट्रिकुलर विशिष्ट MLC-2v से विच्छेदित-tdtomato रिपोर्टर दस्तक चूहों में । इस विधि हमें सीधे श्रम-गहन ऊतक-रसायन तरीकों के बिना माउस दिल के विकास के दौरान वेंट्रिकुलर गठन के प्रत्येक चरण कल्पना करने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को माउस भ्रूण और दिल के विकास के दौरान भ्रूणीय माउस वेंट्रिकुलर कक्षों के दृश्य के विच्छेदन के लिए एक विधि का वर्णन है वेंट्रिकुलर विशिष्ट प्रतिदीप्त रिपोर्टर दस्तक-चूहों में (एमएलसी-2v-Tdटमाटर चूहों) का उपयोग कर । दिल के विकास के एक रैखिक दिल ट्यूब गठन शामिल है, दिल लूपिंग ट्यूब, और चार चैंबर septation. ये जटिल प्रक्रम सभी कशेरुकी प्राणियों में अत्यधिक संरक्षित होते हैं । माउस भ्रूणीय दिल व्यापक रूप से दिल विकास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, उनके अत्यंत छोटे आकार के कारण, विदारक माउस भ्रूणीय दिल तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, कार्डिएक चैंबर गठन के दृश्य अक्सर स्वस्थानी संकरण में की जरूरत है, बीटा-galactosidase धुंधला LacZ रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर, या विच्छेदन भ्रूणीय दिलों की immunostaining. यहां, हम वर्णन कैसे माउस भ्रूणीय दिल काटना करने के लिए और सीधे MLC-2v-tdTomato पूरे माउंट epiफ्लोरोसेंट microscopy का उपयोग चूहों के वेंट्रिकुलर चैंबर गठन कल्पना । इस विधि के साथ, यह सीधे दिल ट्यूब गठन और पाशन, और माउस भ्रूण के आगे प्रयोगात्मक हेरफेर के बिना चार चैंबर गठन की जांच करने के लिए संभव है । हालांकि एमएलसी-2v-tdTomato रिपोर्टर दस्तक में माउस लाइन एक उदाहरण के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल अंय दिल विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
हृदय विकास के दौरान चैंबर गठन एक जटिल कई आकृति विज्ञान विशिष्ट भ्रूणीय चरणों1,2के माध्यम से संक्रमण प्रक्रिया है । हृदय प्रजनक जनसंख्या कोशिकाओं के वर्धमान आकार एक रैखिक हृदय ट्यूब रूपों और फिर दीर्घीकरण से होकर गुजरता है और विकासशील दिल के सर्पिल आकार बनाने के लिए पाशन । इसकी सेप्टन प्रक्रिया के बाद विकासशील हृदय चतुर्भासी हृदय में परिवर्तित हो जाता है । इनमें से किसी भी प्रक्रिया के बाधित होने से विकासात्मक हृदय दोष का परिणाम होता है । इस प्रकार, यह हृदय विकास के दौरान चैंबर गठन अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. दिल के विकास पर कई पिछले अध्ययनों के बावजूद, इस जटिल प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ सीमित रहता है ।
स्वस्थानी संकरण, immunohistoरसायनरसायन, और बीटा-galactosidase धुंधला LacZ रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर किया गया है व्यापक रूप से हृदय विशिष्ट या चैंबर विशिष्ट संरचनात्मक जीन लेबल द्वारा माउस दिल के विकास के दौरान चैंबर गठन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है या प्रोटीन (जैसे, एनपीपीए, तख्तापलट-tfii, Irx4, एमएलसी -2 ए और एमएलसी-2v)3,4,5,6,7,8,9,10। हालांकि, इन प्रयोगों माउस भ्रूण का उपयोग महत्वपूर्ण समय और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, क्योंकि कई विभिन्न प्रयोगात्मक कदम क्रमिक रूप से किया जा करने के लिए11. यहां, हम एक साधारण पूरे माउंट epiफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करने के लिए विकासशील निलय एमएलसी से विच्छेदित-2v-tdtomato रिपोर्टर दस्तक12चूहों में की कल्पना करने के लिए । इस विधि का लाभ पहले प्रयुक्त पद्धतियों की तुलना में जटिल प्रयोगात्मक चरणों से बचने के लिए है जो अक्सर प्रयोगात्मक रूपांतरों बना सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कैसे माउस भ्रूण और दिल के विकास के टुकड़े टुकड़े करने के लिए और थकाऊ ऊतक-रसायन प्रयोगों के बिना माउस कार्डिएक चैंबर विकास के प्रत्येक चरण की जांच करने के लिए है । यह विधि आसानी से हृदय के विकास का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है विभिन्न अन्य ट्रांसजेनिक माउस लाइनों जल्दी कार्डियक मार्कर लेबलिंग (जैसे, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: रोजा मीट्रिक टन /mG14, Nkx2-5Cre: रोजा मीट्रिक/मिलीग्राम14, Hcn4-egfp15, Isl1Cre: रोजा मीट्रिक टन/
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं Vanderbilt विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति की मंजूरी के साथ प्रदर्शन किया गया ।
1. माउस भ्रूण संग्रह और विच्छेदन
- मेट 8-10 सप्ताह पुरानी महिला एमएलसी-2v-Tdटमॅटो+/ -चूहों 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष एमएलसी के साथ-2v-tdटमॅटो +/ -एमएमएलसी-2V-tdटमॅटो +/+, एमएलसी- 2v-tdटमॅटो +/
- हर सुबह योनि प्लग के लिए बांधों की जांच करें । योनि प्लग का पता लगाने के दिन पर दोपहर ई 0.5 के रूप में माना जाता है ।
नोट: एक योनि प्लग का पता लगाने के लिए योनि परीक्षा सुबह में प्रदर्शन किया जाना चाहिए (यौन गतिविधि के बाद 8-24 एच के भीतर), के बाद से एक योनि प्लग दिन भर में खो जा सकता है । - (उदाहरण के लिए, e 8.5, E 10.5 और E 12.5) के बाद coitum के विभिंन दिनों में गर्भवती बांधों euthanize सह2 सांस लेना और ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा पीछा ।
- चूहों लापरवाह रखना और विच्छेदन के दौरान माउस बाल संदूषण से बचने के लिए चूहों के पेट पर ७०% इथेनॉल स्प्रे ।
- तीव्र शल्य चिकित्सा कैंची और एक फोर्सेप का उपयोग कर त्वचा और पेट की दीवार दोनों के चीरा द्वारा उदर गुहा खोलें ।
- उदर गुहा के पृष्ठीय भाग में द्विपक्षीय गर्भाशय सींग का पता लगाएँ ।
- तेजी से शल्य चिकित्सा कैंची और एक फोर्सेप का उपयोग कर दोनों पक्षों पर अंडवाहिनी के ऊपर ध्यान से काटने से पूरे गर्भाशय को अलग करें ।
- बर्फ के साथ एक 10 सेमी पेट्री पकवान में पूरे विच्छेदित गर्भाशय प्लेस pbs और सावधानी से गर्भाशय सींग के साथ एक एमनियोटिक थैली अलग तेज शल्य चिकित्सा कैंची और एक फोर्सेप का उपयोग कर ।
- प्रत्येक भ्रूण को एक स्थानांतरण पिपेट के उपयोग से आइस-कोल्ड पीबीएस से भरे 6 कूप प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करना ।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक एमनियोटिक थैली खोलने के लिए और एक अच्छी तरह से बर्फ की ठंडी pbs के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक व्यक्ति में तेज शल्य चिकित्सा कैंची और एक फोर्सेप का उपयोग गर्भनाल को काटने से प्रत्येक भ्रूण का पर्दाफाश ।
- तेज शल्य चिकित्सा कैंची और एक फोर्सेप का उपयोग कर भ्रूण को नुकसान पहुंचाए बिना जितना संभव हो अतिरिक्त भ्रूणीय ऊतकों को छांटें ।
नोट: संपूर्ण माउस भ्रूण के पूरे माउंट epiफ्लोरोसेंट इमेजिंग आमतौर पर नीचे वर्णित के रूप में विकासशील दिल विदारक से पहले किया जाता है । - तेजी से शल्य चिकित्सा कैंची और एक और एक फोर्सेप का उपयोग कर भ्रूण सिर कट और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए बफर के १०० μl के साथ एक (25 मिमी naoh और ०.२ mM edta) को epiफ्लोरोसेंट इमेजिंग के परिणामों के साथ सहसंबंधित जीनोटाइपिंग के लिए ।
- ठीक संदंश का उपयोग कर भ्रूण की छाती खोलें, तेज शल्य चिकित्सा कैंची और संदंश का उपयोग कर फेफड़ों और वाहिकान्यास से दूर दिल को हटा दें, और एक स्थानांतरण पिपेट के साथ pbs के साथ एक 12 कूप प्लेट की एक अच्छी तरह से विच्छेदित भ्रूणीय दिल हस्तांतरण । सभी विच्छेदन प्रक्रियाओं एक फाइबर ऑप्टिक माइक्रोस्कोप प्रकाशक के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पूरा कर रहे हैं ।
नोट: यह तकनीकी रूप से मुश्किल था ई 8.0 या ई 8.5 पर माउस भ्रूणीय दिल काटना, क्योंकि उनके बहुत छोटे आकार और नाजुक संरचना की । प्रारंभिक भ्रूणीय दिल (यानी 8.0 और E 8.5) पूरे भ्रूण के भीतर बिना विच्छेदन के जांच की जा सकती है ।
2. पूरे माउंट epifluorescence इमेजिंग
- एक epiफ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के तहत माउस भ्रूणीय दिल के साथ 12 अच्छी तरह से थाली प्लेस ।
- एक epiफ्लोरोसेंट विदारक सूक्ष्मदर्शी ठीक forceps का उपयोग कर के तहत, भ्रूण दिल ऐसी स्थिति है कि विकासशील निलय परीक्षक के पास स्थित हैं ।
- उज्ज्वल क्षेत्र मोड में एक 063 x उद्देश्य (3.15 x और 189 एक्स के बीच रेंज ज़ूम) का उपयोग कर छवि का ध्यान केंद्रित समायोजित करें ।
- उज्ज्वल क्षेत्र जोखिम ले लो और कई छवियों पर कब्जा । छवियों को आम तौर पर एक दूसरे के प्रदर्शन से प्राप्त किया गया । हालांकि, एक्सपोज़र बार रोशनी और कैमरा specificationss के आधार पर भिंन हो सकते है और प्रत्येक सेटअप के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता है ।
- एक फाइबर ऑप्टिक माइक्रोस्कोप प्रकाशक बंद करें, और लाल प्रतिदीप्ति के लिए फ़िल्टर सेट (Ex545 nm/Em ६०५ एनएम) tdTomato अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए ।
- यदि आवश्यक हो तो छवि का ध्यान केंद्रित फिर से समायोजित करें ।
- चमक और इसके विपरीत समायोजित करें, लाल फ्लोरोसेंट जोखिम ले, और कई छवियों पर कब्जा ।
नोट: निंनलिखित छवि सेटिंग आमतौर पर प्रयोग किया जाता था: 1 एस जोखिम समय, 2x लाभ, १.० संतृप्ति, और १.० गामा सुधार । इष्टतम सेटिंग को प्रत्येक प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता है । एक बार इष्टतम सेटिंग का निर्धारण किया जाता है, एक ही सेटिंग एक पूरे प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है ।
3. जेनोटाइपिंग
- चरण १.१२ से 1 h के लिए १०० ° c पर नमूने उबाल लें ।
- ११,३६० x gपर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, supernatant के 20 μl के साथ एक नए १.५ मिलीलीटर ट्यूब में बफर बी के 20 μl (४० मिमी Tris एचसीएल, पीएच ५.५) और उंहें मिश्रण ।
- एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में चरण ३.२ से मिश्रित supernatant के ४.५ μl ले लो, यह विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमरों के प्रत्येक के ०.५ μl के साथ गठबंधन (10 μm), पूर्व मिश्रित पोलीमरेज़ और रिएक्शन बफर (2x) के 10 μl ( सामग्री की तालिकादेखें), और फिर एक कुल वी करने के लिए पानी जोड़ें 20 μL के olume । प्राइमर दृश्यों के रूप में नीचे हैं ।
F1:5 '-TACCCACGGAGAGAAGGACT-3 '
R1:5 '-TGGACTTCTTGGAACTCTGT-3 '
F2:5 '-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3 '
R2:5 '-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3 ' - निम्न पीसीआर प्रोग्राम (तालिका 1 और तालिका 2) के साथ एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) चलाएँ ।
- 1% पर पीसीआर नमूने और डीएनए सीढ़ी भागो १४० वी में एगरोस जेल 1x TAE में (Tris-एसीटेट-EDTA) बफर (४० मिमी Tris-एसीटेट और 1 मिमी EDTA) 25 मिनट के लिए । पीसीआर बैंड के आकार का अनुमान लगाने के लिए १०० बीपी डीएनए की सीढ़ी का इस्तेमाल करें ।
- डीएनए बैंड की पहचान और यूवी लाइट चालू करने के लिए एक यूवी ट्रांसप्रकाशक पर डीएनए जेल रखें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हृदय विकास के दौरान MLC-2v को वेंट्रिकुलर चैंबर स्पेसिफिकेशन17के लिए सबसे जल्द मार्कर माना जाता है । के रूप में चित्रा 1में चित्रित, हम बाहर एमएलसी-2v-tdtomato रिपोर्टर दस्तक से चूहे पूरे भ्रूण और भ्रूण दिल विच्छेदित और एमएलसी-2v-हृदय विकास के दौरान tdtomato रिपोर्टर अभिव्यक्ति की जांच की । एमएलसी-2v-tdtomato में रिपोर्टर दस्तक-चूहों में, संवैधानात्मक tdटमाटर अभिव्यक्ति विकासशील दिल में एपिफ्लोरेसेंस पूरे माउंट इमेजिंग के माध्यम से कल्पना है के रूप में ई 8.012 में जल्दी (चित्रा 2) । ई 8.0 पर रैखिक हृदय नली में Tdटमाटटमाटर की अपेक्षाकृत कमजोर अभिव्यक्ति ई 8.5 पर मजबूत हो जाता है । ई 10.5 पर, एमएलसी-2v-tdtomato रिपोर्टर अभिव्यक्ति एक पूरे माउस भ्रूण से विच्छेदित looped दिल के वेंट्रिकुलर हिस्से में प्रदर्शन किया गया था, जबकि यह प्रवाह पथ, बहिर्वाह पथ या भविष्य atria में नहीं दिखाया गया था । ई 12.5-e 13.5 में, एमएलसी के विच्छेदित दिल की पूरी माउंट epiफ्लोरोसेंट इमेजिंग-2v-tdटमाटर दस्तक रिपोर्टर माउस भ्रूण में पता चला कि tdटमाटर रिपोर्टर विशेष रूप से चार के निलय में व्यक्त किया है-chambered दिल । इसी प्रकार वेंट्रिकुलर विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न के एमएलसी-2v-tdtomato रिपोर्टर ई 16.5 में विच्छेदित माउस भ्रूण में दिखाया गया था । इस विधि का उपयोग कर, हम आसानी से नीचे माउस दिल के विकास के दौरान वेंट्रिकुलर चैंबर गठन ट्रैक कर सकते हैं ।
माउस भ्रूण की पूरी माउंट epiफ्लोरोसेंट इमेजिंग के बाद या दिल विकसित विच्छेदित, हम भूतलक्षी प्रभाव से भ्रूण के जीनोटाइप माउस भ्रूण के सिर का उपयोग कर की पुष्टि की । चित्र3ए में दर्शाए अनुसार प्राइमर्स के दो सेटों का उपयोग करके हमने पीसीआर जीनोटाइपिंग का प्रदर्शन किया । जंगली प्रकार विकल्पी ले जाने भ्रूण एक ३८३ बीपी पीसीआर उत्पाद F1 और R1 प्राइमर सेट का उपयोग कर दिखाया । टीटमैटो नॉक-इन ऐलील को ले जाने वाले भ्रूणों ने ४९७ bp पीसीआर उत्पाद को F2 और R2 प्राइमर सेट का उपयोग करके दिखाया (चित्र 3b) । विषम युग्मज भ्रूणों को ३८३ बीपी तथा ४८७ बीपी बैंड दोनों का प्रदर्शन करते हुए परिभाषित किया गया था, जबकि जंगली प्रकार या समयुग्मज जीनोटाइप क्रमशः एकल ३८३ बीपी या ४९७ बीपी बैंड का प्रदर्शन कर निर्धारित किया गया था ।
चित्रा 1 । पूरे माउंट epiफ्लोरोसेंट के लिए पदश: प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा भ्रूणीय MLC-2v-tdटमटरू रिपोर्टर माउस दिल। इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 । प्रतिनिधि पूरे भ्रूण की epiफ्लोरोसेंट छवियों और विकासशील दिल MLC-2v-tdtomato रिपोर्टर दस्तक-चूहों में से विच्छेदित । विभिंन भ्रूणीय अवस्थाओं में संपूर्ण भ्रूणों और विच्छेदार हृदयों का अधिदीप्त प्रतिबिंबन, हृदय के विकास के निलय में Tdटमाटो की विशिष्ट अभिव्यक्ति को दर्शाता है । (क) ई 8 में संपूर्ण भ्रूण, (इ) संपूर्ण भ्रूण ई-8.5 पर, (ग) संपूर्ण भ्रूण ई-10.5 पर, (घ) संपूर्ण भ्रूण e 10-5 पर, (ड) संपूर्ण भ्रूण e 13.5 पर, (च) ई 16.5 पर संपूर्ण भ्रूण, ( छ) ई 9.0 पर भ्रूणीय हृदय, (ज ) E 10.5 पर भ्रूणीय दिल, (I) e 13.5 पर भ्रूणीय दिल, और (J) e 16.5 पर भ्रूण दिल । A, atrium; V, वेंट्रिकल; IFT, अंतर्वाह पथ; बहुधा, पथ बहिर्वाह । स्केल बार (A\u2012f) = 1 मिमी; स्केल बार (G-J) = ५०० μm । इस आंकड़े को संदर्भ #12 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 । एमएलसी के genotyping-2v-tdTomato रिपोर्टर दस्तक भ्रूणों में । (क) जेनोटाइपिंग प्राइमर डिजाइन का चित्रण । (ख) F1 और R1 प्राइमर्स (बाएँ) और F2 और R2 प्राइमर्स (दाएँ) का उपयोग कर प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग परिणाम. +/+: homozygous, +/-: विषम युग्मज,-/-: जंगली प्रकार । Exon: एक जीन का एक हिस्सा है कि प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक जानकारी शामिल है; Ires: आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट; FRT: flippase पुनः संयोजक-पुनर्संयोजन लक्ष्य । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
| चरण | Temp ° c | समय | नोट |
| 1 | ९४ | 3 मिनट | |
| 2 | ९४ | 30 एस | |
| 3 | ६० | ३५ एस | |
| 4 | ७२ | ३५ एस | |
| 5 | ३८ चक्र के लिए 2-4 चरणों को दोहराएं | ||
| 6 | ७२ | 5 मिनट | |
| 7 | 10 | पकड़ |
तालिका 1: पीसीआर F1 और R1 प्राइमरों का उपयोग कार्यक्रम
| चरण | Temp ° c | समय | नोट |
| 1 | ९४ | 3 मिनट | |
| 2 | ९४ | 30 एस | |
| 3 | ६१.७ | ३५ एस | |
| 4 | ७२ | ३५ एस | |
| 5 | ३८ चक्र के लिए 2-4 चरणों को दोहराएं | ||
| 6 | ७२ | 5 मिनट | |
| 7 | 10 | पकड़ |
तालिका 2: F2 और R2 प्राइमर्स का उपयोग करके पीसीआर कार्यक्रम
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित विधि वेंट्रिकुलर चैंबर के विकास की जांच करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, परिश्रम-गहन प्रयोगों के बिना निलय या हृदय-विशिष्ट संरचनात्मक जीन या प्रोटीन लेबल करने के लिए. इस प्रकार, इस विधि तकनीकी variabilities है कि अक्सर इम्यूनोदाग दिल वर्गों में पाया गया कम ।
चूहों के भ्रूणीय युग और भ्रूणीय हृदयों के विच्छेदन के सटीक अनुमान सहित इस पद्धति को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं । हम व्यावहारिक रूप से मादा चूहों में योनि प्लग की पहचान करके चूहों की भ्रूणीय आयु का अनुमान लगाते हैं । हालांकि, एक योनि प्लग की उपस्थिति जरूरी गर्भावस्था संकेत नहीं करता है । यह केवल यह इंगित करता है कि लगभग 8 से 24 घंटे की अवधि में संभोग हुआ । यहां तक कि अगर योनि प्लग पाया जाता है, यह अक्सर यह निर्धारित करने के लिए मुश्किल है कि चूहों वास्तव में गर्भवती हैं या नहीं जब तक 10-11 दिन महिला चूहों के पेट की जांच के बाद coitum. नर और मादा चूहों के कई जोड़ों का प्रजनन माउस भ्रूणों की प्रत्याशित आयु प्राप्त करने के लिए एक सुरक्षित प्रजनन कार्यनीति है । उनके संरचनाओं के लिए महत्वपूर्ण क्षति के बिना माउस दिल को विकसित करने के लिए सही चित्र 1में सचित्र के रूप में माउस भ्रूणोद्भव के दौरान कार्डिएक चैंबर के विकास की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सावधान विच्छेदन और प्रत्येक भ्रूणीय चरण में विकास के हृदय शारीरिक रचना को समझने से पहले विच्छेदन के लिए सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के लिए आवश्यक हैं ।
चूंकि एमएलसी-2v-tdTomato रिपोर्टर अभिव्यक्ति पहली बार ई 8.0 पर मनाया जाता है, यह पहले भ्रूणीय हृदय नली या हृदय अर्धचंद्राकार चरण12की जांच करने के लिए संभव नहीं है । विभिन्न रिपोर्टर माउस लाइनों पहले कार्डियक मार्कर लेबलिंग (जैसे Mesp1Cre: Rosa26EYFP13,Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: रोजा मीट्रिक टन/ , Isl1Cre: रोजा मीट्रिक/एमजी14, और Nkx 2.5 Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-gfp16 चूहों) इस आलेख में वर्णित विधि का उपयोग कर चैंबर विकास के पहले चरणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को NIH R03 HL140264 (वाई जे द्वारा समर्थित किया गया । N) और गिलाद विज्ञान अनुसंधान विद्वान कार्यक्रम (Y.-J. एन) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
