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Verbesserte Tollwutüberwachung mit einem direkten schnellen immunhistochemischen Test

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DOI:

10.3791/59416

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30. April 2019

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1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der direkte schnelle immunhistochemische Test (DRIT) bietet eine anerkannte Alternative zur direkten fluoreszierenden Antikörper-Diagnose (World Organization for Animal Health and World Health Organization(Who). Dieser Test ermöglicht feldbasierte Anwendungen, die bei Hirnabdrücken mit Hilfe der Lichtmikroskopie in ca. 1 h durchgeführt werden können.

Zusammenfassung

Laborbasierte Überwachung ist integraler Bestandteil der Tollwutprävention, -bekämpfung und -bewirtschaftung. Obwohl das DFA der Goldstandard für die Tollwutdiagnose ist, müssen zusätzliche Diagnoseverfahren validiert werden, um die Tollwutüberwachung zu verbessern, insbesondere in Entwicklungsländern. Hier stellen wir ein Standardprotokoll für das DRIT als alternative, labor- oder feldbasierte Testoption vor, die Lichtmikroskopie im Vergleich zum DFA verwendet. Berührungsabdrücke von Hirngewebe, das von verdächtigen Tieren gesammelt wurde, werden in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Das DRIT verwendet tollwutvirusspezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper (konjugiert zu Biotin), ein Streptavidin-Peroxidase-Enzym und einen Chromogen-Reporter (wie Acetyl 3-Amino-9-Ethylcarbazol), um virale Einschlüsse in infiziertem Gewebe zu erkennen. In ca. 1 h kann eine Hirngewebeprobe vom DRIT getestet und interpretiert werden. Die Bewertung verdächtiger Tierhirne, die aus einer Vielzahl von Arten in Nordamerika, Asien, Afrika und Europa getestet wurden, hat gezeigt, dass die DRIT mit den Ergebnissen im Vergleich zu DFA an 100 % heranrückt. Seit 2005 hat das Programm Wildlife Services (USDA WS) des US-Landwirtschaftsministeriums umfangreiche verstärkte Tollwutüberwachungsmaßnahmen durchgeführt, bei denen das DRIT >94.000 Proben aus Wildtieren in strategischen Tollwut-Managementgebieten getestet wurde. . Das DRIT bietet ein leistungsfähiges, wirtschaftliches Werkzeug für die Tollwutdiagnose, das von Laboratoren und Feldbiologen genutzt werden kann, um aktuelle Tollwutüberwachungs-, Präventions- und Kontrollprogramme weltweit zu verbessern.

Einleitung

Während das DFA der am weitesten verbreitete Test für routinemäßige Tollwutdiagnose1ist, können die Kosten für den Kauf und die Wartung eines Fluoreszenzmikroskops auf Entwicklungsländer 2,3,4 und für breite, groß angelegte erweiterte Tollwut-Überwachungsprogramme3,4. Darüber hinaus erfordert das DFA die Fähigkeit, Proben während der Fixierung zu kühlen und Proben über der Umgebungstemperatur während der Antikörper-Antigen-Reaktionen zu inkubieren, was in Ländern ohne geeignete Infrastruktur eine erhebliche Hürde darstellen kann. Teilweise aufgrund der Einschränkungen, die mit modernen DFA-Tests verbunden sind, ist die globale Auswirkung von Tollwut seit langem unterschätzt5.

In dieser Hinsicht müssen zusätzliche Diagnosetechniken validiert werden, um die Tollwutüberwachung weltweit zu verbessern, insbesondere in Entwicklungsländern. Das hier vorgestellte DRIT-Protokoll bietet eine Labor- oder feldgestützte Testalternative zum DFA, die Lichtmikroskopie verwendet und während des Tests6keine Kühlung oder Laborinkubation erfordert. Die DRIT und DIE DFA ähneln sich insofern, als beide Techniken Berührungsabdrücke von Gehirnproben verwenden, die von potenziell rabiaten Tieren gesammelt wurden. Im ersten Schritt des DRIT wird formalin jedoch als historisches Fixativ für Proben verwendet, das das Tollwutvirus inaktiviert. Dies bietet eine wesentliche Verbesserung der Biosicherheit gegenüber dem Aceton, das zur Fixierung von Proben im DFA-Protokoll3verwendet wird, was nicht nur im Labor wichtig ist, sondern vielleicht noch mehr in feldbasierten oder dezentralen Laborumgebungen. Bis heute zeigt das DRIT Empfindlichkeit und Spezifität gleich dfA2,7,8,9.

Seit 2005 hat das USDA WS-Programm in Nordamerika umfangreiche verstärkte Tollwutüberwachungsbemühungen durchgeführt, indem das DRIT als Teil eines umfassenden Programms zur Bewirtschaftung von Tollwut in der Tierwelt verwendet wird10. Verbesserte Tollwut-Überwachung wird als Ergänzung zu expositionsbasierten öffentlichen Gesundheitsüberwachung verwendet und testet in erster Linie Wildtiere meso-carnivore Arten, einschließlich Waschbären (Procyon Lotor), gestreifte Skunks (Mephitis mephitis), grau Füchse ( Urocyon cinereoargenteus), Rotfüchse (Vulpes vulpes) und Kojoten (Canis latrans), die nicht an einer Exposition von Menschen oder Haustieren beteiligt waren. Tierkörper, die in Tests verwendet wurden, wurden der USDA WS durch verstärkte Tollwutüberwachungsbemühungen vorgelegt und umfassten Tollwutvektorarten, die: krank oder seltsam wirken; tot aufgefunden, auf der Straße getötet oder lästig; und nicht mit einer Exposition von Menschen oder Haustieren in Verbindung gebracht werden. Das DRIT bietet einen Tollwutdiagnostiktest an, der von ausgebildeten Feldbiologen mit wenig oder gar keiner Laborerfahrung eingesetzt werden kann, um die Tollwutüberwachung zu verbessern und die finanzielle Belastung und Arbeitsbelastung von Diagnoselaboratorien für die öffentliche Gesundheit zu verringern10. Die grundlegende DRIT-Schulung für USDA WS-Außendienstmitarbeiter dauert in der Regel 1,5 bis 2 Tage, was ca. 4 h Unterricht im Klassenzimmer umfasst, der die Grundprinzipien der Biosicherheit, Methoden für die Probenentnahme und die DRIT-Prozesse sowie >8 h von umfasst. Laborzeit bei der Durchführung des Tests. Über die Centers for Disease Control and Prevention (CDC), LYSSA LLC und das Wistar Institute wurden den USDA WS und Programmkoordinatoren Schulungsmöglichkeiten zur Verfügung gestellt.

In strategischen Managementbereichen hat USDA WS über 94.000 Wildtierproben mit dem DRIT getestet und mehr als 1.850 tollwütigen Proben entdeckt, die wahrscheinlich unentdeckt geblieben wären, die sich nur auf Expositionstests auf der Grundlage von Tests der öffentlichen Gesundheit von verdächtigen Tieren beruhe. Verbesserte Tollwutüberwachungsdaten, die von DRIT-Ergebnissen bereitgestellt werden, sind entscheidend für eine vollständigere zeitliche und räumliche Darstellung von Tollwut auf der Landschaft zur Unterstützung oraler Tollwut-Impfprogramme für Wildtiere in den USA10, 11. In ähnlicher Weise haben die kanadischen Wildtierbehörden DRIT in groß angelegte Maßnahmen zur Überwachung von Tollwut in großem Stil in Verbindung mit ihren Programmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit mit Erfolgintegriert 8. Sowohl USDA WS als auch kanadische DRIT-Überwachungsprogramme haben nationale Referenzlaboratorien verwendet, um Tollwut durch DFA zu bestätigen und virale Variantentypisierung nach Bedarfdurchzuführen 8. Darüber hinaus senden USDA WS-Feldbiologen 10 % der negativen Proben zur DFA-Bestätigung an Referenzlaboratorien und nehmen seit 2008 an halbjährlichen DRIT-Kompetenztests teil, die vom Wisconsin State Laboratory of Hygiene als Teil der Standard-Laboratoriumfürarbeitung durchgeführt wurden. Qualitätssicherungsmaßnahmen.

Ziel dieser Methode ist es, einen alternativen Ansatz für Tollwutdiagnostiktests anzubieten, der in dezentralen Laboratorien, im Feld oder in Bereichen ohne routinemäßigen Zugang zur Elektronenmikroskopie durchgeführt werden kann.

Protokoll

Jede Person, die Tollwut-Diagnosetests durchführt, sollte eine Standard-Vorbelichtungs-Tollwut-Impfserie erhalten und sich einer regelmäßigen serologischen Antikörperbewertung unterziehen, wobei bei Bedarf Booster-Impfungen erforderlich sind. Nicht immunisierte Personen sollten nicht in Laboratorien oder Bereiche gelangen, in denen solche Arbeiten durchgeführt werden. Alle Manipulationen von Geweben und Dias sollten durchgeführt werden, um keine Flüssigkeiten zu aerosolisieren oder Partikel in der Luft zu produzieren. Rauchhauben sind nicht erforderlich, aber wenn möglich, können sie zusätzlichen Schutz vor Gerüchen, Ektoparasiten und Knochenfragmenten bieten. Mindestschutzausrüstung, einschließlich Handschuhen und Augenschutz, sollte während der Probenentnahme und -prüfung jederzeit getragen werden.

1. Brainstem Kollektion

  1. Sammeln Sie Hirnstammzellenproben entweder sofort nach der Schlachtkörperentnahme oder stellen Sie sicher, dass Die Kadaver bis zu späteren Tests in Tiefkühltruhen aufbewahrt werden. Wenn Tierkadaver eingefroren sind, tauen Sie bei Umgebungstemperatur vor der Brainstem-Sammlung für eine einfache Sammlung. Unter bestimmten Umständen werden Proben direkt von einem gefrorenen Tier entnommen.
  2. Bei Tieren, die frisch gesammelt oder auf Umgebungstemperatur aufgetaut wurden, positionieren Sie die Tiersuppe auf einer ebenen Oberfläche, wobei die Halswirbelsäule leicht in Richtung des Prüfers gedreht ist. Palpate, um das Atlanto-Occipitalgelenk auf dem seitlichen Aspekt der Halswirbelsäule zu identifizieren.
    1. Für Schlachtkörper, die noch vollständig eingefroren sind, positionieren Sie die Tiersuppe wie oben beschrieben, wenn praktisch. Verwenden Sie Sägen, Messer, Knochenscheren oder ähnliches, um den Kopf vollständig vom Körper zu trennen.
      HINWEIS: Alle Geräte, die nicht einmal verwendet werden, sollten zwischen den Proben gründlich gereinigt werden.
  3. Mit einem Skalpellklinge, machen Sie einen Schnitt auf der Ebene der atlanto-okzipitalen Gelenk am ventralen Aspekt, schneiden Durch alle Schichten von Muskel und Weichgewebe, einschließlich der Luftröhre und Speiseröhre. Fahren Sie fort, bis sie den vorderen Aspekt der Halswirbelsäulenwirbel anrücken. Für gefrorenes Gewebe, verwenden Sie eine Skalpellklinge, um alle verbleibenden Schichten von Muskel- und Weichgewebe zu entfernen, um das Foramen magnum freizulegen.
  4. Bewegen Sie den Kopf des Tieres in die Endbereichsverlängerung, bis der Hirnstamm sichtbar ist. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um alle sichtbaren Hirnstamm/Zentralnervensystem (ZNS) Gewebe für die Probenahme zu entfernen. Verwenden Sie für eine gefrorene Probe eine Skalpellklinge, um so viel des gefrorenen Hirnstamms/CNS-Gewebes wie möglich aus dem Schädel zu entfernen.
  5. Die Hirnstammproben in einen unzerbrechlichen Behälter (z.B. Metallsalbe Zinn, Kryo-Vial usw.) legen und entsprechend beschriften.
  6. Stellen Sie sicher, dass die Hirnstammproben unmittelbar nach der Entnahme über den DRIT-Test getestet, gekühlt (4 °C) für bis zu 24 h vor dem Test oder gefroren (-20 °C) bis zum Zeitpunkt der Prüfung, wenn die Prüfung mehr als 24 h nach der Probenentnahme stattfinden wird.

2. Herstellung von Materialien für DRIT

  1. Einrichtung von 10 Gleitfärbeschalen (Abbildung 1)
    HINWEIS: Die Färbeschalen sind tief genug, um ein vollständiges Eintauchen des Schlittens zu ermöglichen (Durchmesser 96 mm, Höhe 72 mm, Tiefe 42 mm, Volumen 250 ml). 6
    1. Füllen Sie Schale 1 mit 10% Phosphat gepuffert formalin. Formalin nach 2 Testläufen oder wöchentlich ersetzen.
    2. Füllen Sie die Gerichte 2, 4 und 5 mit Phosphat gepufferter Saline mit 1% Tween-80 (TPBS). Ersetzen Sie dies vor jedem Test durch frische TPBS.
    3. Füllen Sie die Schale 3 mit 3% Wasserstoffperoxid. Wasserstoffperoxid vor jedem Test ersetzen.
    4. Füllen Sie die Gerichte 6, 8, 9 und 10 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser. Ersetzen Sie Wasser vor jedem Test.
    5. Füllschale 7 mit Gills Hämatoxylin-Formulierung #2 im Verhältnis 1:1 in destilliertem Wasser verdünnt6. Hematoxylin nach 2 Testläufen oder wöchentlich ersetzen.
      HINWEIS: Gemäß dem ursprünglichen DRIT-Protokoll, das vom CDC12entwickelt wurde, kann ein 1:2-Verhältnis von Gills Hämatoxylin zu Wasser verwendet werden, wenn die Gegenfärbung zu dunkel ist.
  2. Herstellung von Amino-Ethylcarbazol (AEC) Stofflösung
    1. Mit einer Glaspipette 5 ml N,N-Dimethylformamid in einen Glasbehälter geben.
    2. Fügen Sie eine 20 mg Tablette 3-Amino-9-Ethylcarbazol und schütteln, bis vollständig gelöst. Beschriften Sie das Glas mit "AEC-Bestand" und dem Datum, an dem der Bestand hergestellt wurde.
      HINWEIS: Die AEC-Lagerlösung kann unter Kühlung (4 °C) gelagert und 1-2 Monate lang verwendet werden.
  3. Vorbereitung der AEC-Arbeitsverdünnung
    1. Fügen Sie 7 ml Acetatpuffer zu einem 15 ml Zentrifugenrohr hinzu.
    2. Mit einer Glaspipette 0,5 ml der AEC-Lagerlösung in das Zentrifugenrohr geben.
    3. 0,075 ml 3% Wasserstoffperoxid in die Röhre geben.
    4. Filtern Sie die Lösung mit einer 10 ml Spritze mit einem 0,45 m Spritzenfilter.
      HINWEIS: Die AEC-Arbeitsverdünnung sollte kurz vor jedem DRIT-Test erstellt werden, da sie nur für 2-3 h stabil ist.

3. Direkter Rapid Immunohistochemistry Test

  1. Etiketten Glasmikroskop-Dias mit einer eindeutigen Nummer für jede Probe mit einem abschmierenden, wasserdichten, dauerhaften Tintenmarker.
    1. Mit einer Skalpellklinge, entfernen Sie das Hirnstamm aus dem Behälter und legen Sie auf Papiertuch. Spülen Sie vorsichtig jeden Überschuss an Flüssigkeit, Blut oder Fell mit einem zweiten Papiertuch weg, um nur das Hirnstammgewebe zu offenbaren13. Bei Bedarf abschnitt das Hirnstammgewebe, um einen Querschnitt zu offenbaren.
    2. Berühren Sie das Mikroskop sehr sanft auf den Querschnitt des Hirnstammgewebes. Berühren Sie die Folie zum Hirnstamm an mehreren Punkten ohne seitliche Bewegung, damit mehrere Bereiche des Hirnstamms auf Folie13übertragen werden können. Stellen Sie sicher, dass nur 1 oder 2 Zellschichten mit einer sanften Berührung vom Hirngewebe auf das Dia übertragen werden. Es wird kein Montagemittel benötigt, um das Hirnstammgewebe an den Dias zu befestigen. Beziehen Sie in jedem DRIT-Lauf sowohl eine positive als auch eine negative Kontrolle ein.
  2. Lassen Sie die Dias ca. 5 min bei Raumtemperatur lufttrocknen.
  3. Tauchen Sie die Dias in 10% gepuffertes Formalin für 10 min (Schale 1).
  4. Entfernen Sie die Dias von Formalin und Dip-Spülung in einer Lösung von TPBS (Schale 2).
  5. Tauchen Sie die Dias in 3% Wasserstoffperoxid für 10 min (Schale 3).
  6. Entfernen Sie die Dias aus dem Wasserstoffperoxid und tauchen Sie in frischem TPBS (Schale 4) ab. Nach dem Entfernen überschüssiger Wasserstoffperoxid, legen Sie die Dias in frische TPBS (Schale 5) und arbeiten Sie mit einer Folie nach der anderen, während die anderen Dias in TPBS eingetaucht bleiben.
  7. Nehmen Sie die Dias von TPBS (Schale 5) nacheinander, schütteln Sie ab und bloten Sie überschüssigen Puffer, und legen Sie auf einem befeuchteten Papiertuch auf laborbank, als Grundlage einer "Feuchtigkeitskammer". Mit einer Pipette, lassen Sie genug primäre Anti-Tollwut-Virus-Antikörper auf jeder Folie, um das ZNS-Gewebe zu decken. Inkubieren Sie die Dias für 10 min in der Feuchtigkeitskammer (d.h. die Abdeckung von Dias mit Brunnenplatten oder einer anderen einfachen Abdeckung, während sie auf dem befeuchteten Papiertuch liegen) bei Raumtemperatur (Abbildung2).
  8. Entfernen Sie die Dias aus der Feuchtigkeitskammer, schütteln und bloten Sie überschüssiges Konjugat, und tauchen Sie die Dias in TPBS (wiederverwenden Sie die gleichen TPBS in Schale 5).
  9. Arbeiten Sie mit einer Folie nach der anderen, während andere in TPBS eingetaucht bleiben – verwenden Sie eine Pipette, um genügend Streptavidin-Peroxidase-Komplex fallen zu lassen, um das ZNS-Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie in der Feuchtigkeitskammer für 10 min bei Raumtemperatur.
  10. Entfernen Sie die Dias aus der Feuchtigkeitskammer, schütteln und bloten Sie überschüssigen Komplex, und tauchen Sie die Dias in TPBS (Schale 5).
  11. Arbeiten Sie mit einer Folie nach der anderen, schütteln Sie ab und blot überschüssigepuffer, während andere in TPBS eingetaucht bleiben — verwenden Sie eine Pipette, um genug AEC fallen zu lassen (Vorbereitung wird oben erklärt und sollte unmittelbar vor der Verwendung durchgeführt werden), um das ZNS-Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie in der Feuchtigkeitskammer für 10 min bei Raumtemperatur.
  12. Tauchen Sie die Dias in destilliertem Wasser (Schale 6).
  13. Die Dias in den Gegenfleck von Gills Hematoxylin (verdünnt 1:1 mit destilliertem Wasser) für 2 min (Schale 7) legen.
  14. Sofort alle Dias in destilliertem Wasser (Schale 8) abspülen. Zweimal zweimal mit frischem Wasser wiederholen (Gerichte 9 und 10).
  15. Arbeiten Sie mit einer Rutsche nach der anderen, während andere in destilliertes Wasser (Schale 10) eingetaucht bleiben — schütteln und abloten überschüssiges Wasser und verwenden Sie ein wasserlösliches Montagemedium, um einen Deckelschlupf zu befestigen.
  16. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv, um die Dias und ein 40-faches Objektiv zu betrachten, wenn eine genauere Inspektion erforderlich ist.

Ergebnisse

Positive Ergebnisse des DRIT zeigen rote intrazytoplasmatische virale Einschlüsse, die in Form und Größe variieren können (Abbildung 3) innerhalb des Zytoplasmas bläulicher Zellkörper. Die Einschlüsse wirken glatt mit sehr hellen Rändern und einem weniger intensiv gefärbten Zentralen Bereich. Intensität und Antigenverteilung werden aufgezeichnet, wenn Einschlüsse erkannt werden. Die Intensität wird von +4 auf +1 stuft. Der Positivkontrollschlitten sollte eine intensive, grelle Magenta-Brillanz aufweisen, die als +4-Intensität bezeichnet wird. Ein leichter Farbverlust kann insbesondere dann auftreten, wenn die Probenhandhabung nicht optimal war (d. h. das Probengewebe hat sich leicht zersetzt) und diese sollten mit +3 bewertet werden. Auffällig stumpfe Flecken werden als +2 bis +1 eingestuft, gelten nicht als diagnostisch für Tollwutvirusinfektionen und werden als unbestimmt bezeichnet.

Darüber hinaus wird die Antigenverteilung von +4 auf +1 abgestuft, wobei +4 die Antigenverteilung darstellt, die aus einer Fülle von großen und kleinen Einschlüssen mit unterschiedlicher Größe und Form besteht und in jedem Feld (oder fast jedem Sichtfeld) innerhalb des ZNS-Gewebes vorhanden ist. Touch-Eindruck. Die Positivkontrolle hat in der Regel eine +4 Antigenverteilung. Eine Antigenverteilung von +3 würde zugewiesen, wenn es Einschlüsse in einer Vielzahl von Größen in den meisten, aber nicht in allen Sichtfeldern gibt. Wenn Einschlüsse in 10%-50% der Mikroskopfelder gefunden werden, wird eine +2 Antigenverteilung zugewiesen. Wenn Einschlüsse in <10% der Mikroskopfelder gefunden werden, wird eine +1 Antigenverteilung zugewiesen.

Die meisten ZNS-Gewebe mit Tollwut-Virus vorhanden zeigen typische virale Einschlüsse als +3 oder +4 Intensität und Antigenverteilung bewertet. Wenn die Ergebnisse eine Intensität von +2 oder +1 oder eine Antigenverteilung von +2 oder +1 angeben, wird die Probe als "unbestimmt" deklariert und Wiederholungstests sind gerechtfertigt. Wenn dieselbe Probe ein unbestimmtes Testergebnis hat, sollte die Probe an ein Referenzlabor für DFA oder verwandte Bestätigungstests geschickt werden.

Eine Testprobe mit dem DRIT gilt als negativ für Tollwutvirus-Antigene, nachdem das Dia, das das ZNS-Gewebe enthält, mit einer Vergrößerung von 200X oder mehr gescannt wurde und keine typischen Viruseinschlüsse festgestellt werden (Abbildung 4). Negative Proben zeigen bläuliche Zellkörper mit wenig oder gar keiner unspezifischen Färbung.

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Abbildung 1: Einrichtung von 10 Gleitfärbeschalen mit Reagenzien zum Testen. Die Gerichte sind mit Reagenznamen gekennzeichnet, in der Reihenfolge, die benötigt wird, um dem Protokoll zu folgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Einfache Feuchtigkeitskammer mit einem nassen Papiertuch und Zellkulturplatten.  Eine einfache Feuchtigkeitskammer mit einem nassen Papiertuch und Zellkulturplatten ermöglicht eine feldbasierte Anwendung.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentative Dias von Tollwut-positiven viralen Einschlüssen mit +4 Intensität und +4 Antigenverteilung. (A und B) zeigen positive Tollwut-Viruseinschlüsse bei 200-facher Vergrößerung. (C und D) zeigen positive Tollwut virale Einschlüsse bei 400-facher Vergrößerung. Skalenbalken = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Repräsentative Dias von negativen Proben ohne Tollwut virale Einschlüsse. (A und B) zeigen Proben negativ für Tollwut virale Einschlüsse bei 200x Vergrößerung. (C und D) zeigen Proben negativ für Tollwut virale Einschlüsse bei 400-facher Vergrößerung. Skalenbalken = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Fotos von DRIT-Prüfeinrichtungen, die von USDA WS verwendet werden. (A) Mobile Prüfanlage in einem geschlossenen Anhänger für den Transport. (B) Freizeitfahrzeug für DRIT-Prüfungen nachgerüstet. (C) DRIT-Prüfeinrichtung in Verbindung mit Universitätslabor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das DRIT ist eine flexible Methode zur feldbasierten Überwachung zum Nachweis des Vorhandenseins von Tollwutviren, die in dezentralen Laborbereichen eingesetzt werden können. Während es möglich ist, den gesamten Test in einer feldbasierten Umgebung durchzuführen, z. B. an der Heckklappe eines LKWs, ist es ideal, einen kleinen Raum für DRIT aufgrund von Chemikalien-, Ausrüstungs- und Versorgungsproblemen zu haben. Darüber hinaus muss die Einhaltung aller geltenden Bundes-, Landes- und Kommunalgesetze sowie Vorschriften für den chemischen Einsatz und die Entsorgung berücksichtigt werden. Derzeit verfügt USDA WS über 15 DRIT-Einrichtungen, um Proben aus 17 Bundesstaaten zu testen. Die USDA WS DRIT-Einrichtungen werden in Zusammenarbeit mit Universitanten und staatlichen Laboratorien für das öffentliche Gesundheitswesen, in ausgewiesenen Räumen in größeren Einrichtungen und in geschlossenen Anhängern, die nachgerüstet und umgebaut wurden, um als mobile Prüfgeräte in der Im Falle einer Notfallreaktion auf Ausbrüche, bei der verbesserte Tollwutüberwachungstests mit sofortiger Durchlaufzeit von entscheidender Bedeutung sind (Abbildung 5).

Während der Test erfolgreich mit Hirnstammmaterial von variabler Qualität war, ist frisches Hirnstammgewebe ohne Gewebezersetzung optimal. Wenn Zersetzung, Austrocknung oder Verflüssigung auftritt, nimmt die Probenqualität ab, und der Test kann eine unspezifischere Färbung erkennen, die die Ergebnisse verwirren kann. Diese Beobachtung ist ähnlich zwischen DFA und DRIT2. Brainstem/CNS sollte so schnell wie möglich gesammelt und dann bis zum Test gefroren (-20 °C) gelagert werden.

In der Regel verarbeiten die meisten USDA WS-Einrichtungen während einer DRIT-Sitzung 12 bis 24 Folien gleichzeitig, einschließlich einer positiven und einer negativen Kontrolle, die über DFA bestätigt wurden. Positive und negative Kontrollen stellen einen Bezugspunkt für jeden DRIT-Lauf bereit, um sicherzustellen, dass der Test erfolgreich war, und um zu bestätigen, ob auf den Testfolien Interpretationsfragen auftreten. Wenn eine Probe nicht als eindeutig positives oder negatives Ergebnis bestimmt wird, wird sie als unbestimmt gekennzeichnet und ein zweites Mal von DRIT getestet. Wenn diese Probe nach zwei DRIT-Tests nicht eindeutig positiv oder negativ ist, wird sie an ein Referenzlabor für DFA- oder verwandte Tests gesendet.

Wie bei jedem diagnostischen Test ist "Trouble-Shooting" bei unerwarteten Befunden nützlich. Wenn z. B. ein DRIT-Lauf erfolglos ist (d. h., die Positivkontrolle weist keine +3 oder +4-Färbungsintensität und Antigenverteilung auf), stellen Sie sicher, dass alle Chemikalien und Reagenzien nicht abgelaufen sind. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung einer neu geöffneten Flasche Wasserstoffperoxid mindestens einmal pro Woche hilfreich ist, um unspezifische Färbung durch Oxidation des Hirngewebes zu verhindern. Darüber hinaus empfehlen wir, den Acetatpuffer mindestens einmal jährlich mindestens einmal zu ersetzen, unabhängig vom markierten Ablaufdatum.

Es gibt eine Reihe von Vorteilen des DRIT gegenüber DFA, darunter niedrigere Kosten, die Möglichkeit, den Test außerhalb eines zentralen Labors durchzuführen, die Notwendigkeit nur der Lichtmikroskopie anstelle eines Fluoreszenzmikroskops und der relativ einfache Schulungsprozess für Personen, die den Test verwalten und lesen2,3,4. Diese Vorteile, gepaart mit der Empfindlichkeit und Spezifität des DRIT, die mit DFA2,7,8,9 vergleichbar sind, haben bereits bewiesen, dass der Test als wichtiges Werkzeug in großem Maßstab dient verbesserte Tollwut-Überwachungsprogramme8,10 in Nordamerika. Darüber hinaus hat das DRIT das Potenzial, eine verstärkte Überwachung und schnellere Tests in Entwicklungsländern oder anderen Gebieten mit begrenzten Ressourcen zu ermöglichen, insbesondere nach den jüngsten OIE/WHO-Leitlinien als empfohlener Test.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir würdigen alle Mitarbeiter von USDA Wildlife Services, die derzeit oder zuvor verbesserte Tollwut-Überwachungsproben gesammelt haben und das DRIT für die Tollwutdiagnose durchgeführt haben. Ebenso würdigen wir die vielen Kooperationspartner, die uns bei der Sammlung "Enhanced Tolles Surveillance" unterstützen. Wir danken auch den Centers for Disease Control and Prevention und dem Wistar Institute für den Zugang zu kritischen Reagenzien, die für die Durchführung des DRIT erforderlich sind, und für die Bereitstellung von Schulungsmöglichkeiten. Darüber hinaus schätzen wir die Bestätigungsdiagnostik und technische Unterstützung durch die Centers for Disease Control and Prevention und das Wadsworth Center mit dem New York State Department of Health. Die Verwendung kommerzieller Produkte dient nur zu Vergleichszwecken und stellt keine Billigung dar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC-Tabletten; 50 Stück)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)A6926
Acetat-Puffer, 0,1 M, 5,2 pH, 32 ozPoly Scientific R& D Corp. (https://www.polyrnd.com/)s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, unsteril #10, 40 pro PackungPatterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)PN110Ergänzende Ausrüstung für Berührungsabdrücke von Proben; Auch erhältlich über Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Einwegspritze ohne Nadel, 10 ccFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-823-2ABD Herstellernummer 309604
Binokulares Lichtmikroskop mit Seidentopf-Kopf oder gleichwertigMehrere Anbieter
Blau Rechteck UN-bewertet Entsorgung Behälter, 5GBerlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01BLUZusatzausrüstung für die Lagerung/Entsorgung chemischer Abfälle (Kiemenhämatoxylin und AEC-Lösung)
Corning Quadratisches und rechteckiges Deckglas, 24x60Fisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)12-553-465Corning Herstellernummer 2975246
Corning Universal Fit Pipettenspitzen: Racked, unsteril (1-200ul)Fisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)07-200-300Corning Herstellernummer 4863
Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen, PolypropylenFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-959-70CCorning Herstellernummer 352097
Falcon 96-Well-Assay-Platten (Deckel von Gewebekulturplatten)Fisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)08-772-5Corning Herstellernummer 353910
Fisher Brand 25-mm-Spritzenvorsatzfilter, Nylon, 0,45 μ m, SterilFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hämatoxylin-Fleck (Gill-2), 4LFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Behälter für scharfe/spitze Gegenstände, 5 qtFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-827-122Ergänzende Ausrüstung für die richtige BSL-2 Laboreinrichtung
Fluor-Gel mit Tris-Puffer (Gel/Mount Media), 20 mLVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)102092-122Fluor-Gel-Ersatz für BioMeda™ Gel-Mount, Elektronenmikroskopie Sciences
Formalin, gepuffert, 10%, 4LFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SF100-4Erhältlich jeweils oder im Koffer von 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μ LDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF9930E
Hy-Klon-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, 1x Lösung, 1 l (PBS)Fisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SH30256LSAlternatives Trockenpulverprodukt kann verwendet werden
Wasserstoffperoxid, 3%Mehrere AnbieterJede kommerziell erhältliche Quelle, wie z. B. Apotheken- oder Handelsmarken usw.
Linsenmikroskop Objektiv 20x und 40xMehrere Anbieter
Lysol IC Quarternary Desinfektionsreiniger, 1GDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF8481Ergänzende Materialien für die richtige BSL-2 Labordesinfektion
Einweg-Skalpell der Marke Miltex Größe 22 (alternative Größe zu MiniScalpel)AMD Next (www.amdnext.com)999112314Ergänzende Ausrüstung für Probenabdrücke; Alternative Größe zu Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamid, Braunglasverpackung, 500 mLFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)D119-500
Peroxidase markiertes Streptavidin, 50 mLSeraCare (https://www.seracare.com/)5550-0001KPL Immunoassay und Kits Referenznummer 71-00-38
Phosphatgepuffertes Kochsalzpulver (Alternative zu Fisher flüssig PBS)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P3813Muss in 1 l destilliertem Wasser zubereitet werden; Erhältlich in Mengen von 1, 10 und 50 Packungen
Primärer Antikörper: Polyklonales Anti-Nukleoprotein oder Cocktail aus biotinylierten Anti-Lyssavirus-AntikörpernBei 4 μg lagern; C
PYREX Serologische Einwegpipetten, Glas, steril, verstopft, Corning, 1,0 mLVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)7078D-1VWR Herstellernummer 89091-220
PYREX serologische Einwegpipetten, Glas, steril, verstopft, Corning, 10,0 mLVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)7078D-10VWR Herstellernummer 89091-106
PYREX serologische Einwegpipetten, Glas, steril, verstopft, Corning, 5,0 mLVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)7078D-5VWR Herstellernummer 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hämatoxylin-Fleck Nr. 2, 1PT (alternativ zu oben)Fisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)22-050-201Thermo Scientific Herstellernummer 72504
Objektträgerhalter, 24-fachVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)25608-868Sakura® Finetek Lieferantennummer 4465; Erhältlich bei mehreren Anbietern
Probendosen, 1/2 ozVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)101412-452Ergänzende Ausrüstung für die Lagerung von Hirngewebeproben
Taylor 2-Event Digital Timer/ClockMehrere AnbieterErgänzende Ausrüstung
Tissue-Tek Slide Staining KitVWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)25608-902Sakura® Finetek Lieferantennummer 4551; Erhältlich über mehrere Anbieter
TWEEN 80, Polyethylenglykol, 500 mLSigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P1754Auch in den Volumina 25 mL, 1 L und 1 G
erhältlich VWR FLIP Pipettenfüller (0,05-100 mL)VWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)53497-055
VWR Soft Nitril Untersuchungshandschuhe, L (100 pro Packung)VWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)89038-272Ergänzende Ausrüstung für geeignetes
PSA-Wasser, entionisiert (20 L)VWR, Teil von Avantor (https://vwr.com)10806-022
Wheaton Klarglas-Probenfläschchen, 8 mLFisher Scientific (Teil von Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)06-408CDWK Life Sciences Herstellernummer 224884
weiß beschichtete Doppelglas-Objektträger, 14 mmTekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)2-140
Weißer rechteckiger Entsorgungsbehälter mit UN-Rate, 5GBerlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01WHTErgänzende Ausrüstung für die Lagerung/Entsorgung chemischer Abfälle (Formalin)

Referenzen

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