Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.
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Methodenartikel
Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Heute kann Stuhl-DNA mit mehreren Methoden isoliert und analysiert werden. Die langen DNA-Fragmente im Stuhl können durch einen qPCR-Assay nachgewiesen werden, der eine zuverlässige Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von präneoplastischen oder neoplastischen dickdarmen Läsionen bietet. Diese Methode, die fluoreszenzlange DNA (FL-DNA) genannt wird, ist ein schnelles, nicht-invasives Verfahren, das eine Verbesserung gegenüber dem primären Präventionssystem darstellt. Diese Methode basiert auf der Bewertung der Fäkal-DNA-Integrität durch quantitative Verstärkung spezifischer Ziele der genomischen DNA. Insbesondere die Auswertung von DNA-Fragmenten von mehr als 200 bp ermöglicht den Nachweis von Patienten mit kolorektalen Läsionen mit sehr hoher Spezifität. Dieses System und alle derzeit verfügbaren Stuhl-DNA-Tests stellen jedoch einige allgemeine Probleme dar, die angegangen werden müssen (z. B. die Häufigkeit, mit der Tests durchgeführt werden sollten, und eine optimale Anzahl von Stuhlproben, die zu jedem Zeitpunkt für jeden einzelnen Personen gesammelt werden). Der Hauptvorteil von FL-DNA ist jedoch die Möglichkeit, sie in Verbindung mit einem Test zu verwenden, der derzeit im CRC-Screening-Programm verwendet wird, dem immunchemischen fekten okkulten Bluttest (iFOBT). Tatsächlich können beide Tests an derselben Probe durchgeführt werden, wodurch die Kosten gesenkt und eine bessere Vorhersage des eventuellen Vorhandenseins von kolorektalen Läsionen erreicht werden kann.
Einleitung
Darmkrebs (CRC) leitet sich von einem mehrstufigen Prozess ab, bei dem sich gesundes Epithel langsam zu Adenomen oder Polypen entwickelt, die im Laufe der Zeit zu bösartigen Karzinomen übergehen1,2. Trotz der hohen Inzidenzrate des SCR wurde in den letzten zehn Jahren ein rückläufiger Trend beim Anteil der Todesfälle beobachtet3. Tatsächlich haben frühdiagnostische Instrumente, die in Screening-Programmen eingesetzt werden, zur Früherkennung und Entfernung von präneoplastischen Adenomen oder Polypen4geführt. Aufgrund der unterschiedlichen technischen Grenzen ist ....
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Protokoll
Die Patienten wurden zwischen 2013 und 2015 am Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) in Meldola (FC, Italien) rekrutiert. Die eingeschriebenen Patienten wurden in das Protokoll IRSTB002 aufgenommen, das von der Ethikkommission von IRST - IRCCS AVR genehmigt wurde (25/10/2012, ver. 1). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt.
1. DNA-Extraktion aus dem Stuhl
- Verwenden Sie ein Kit, um Stuhlproben vorzubereiten (siehe Materialtabelle). W....
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Ergebnisse
Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Der Workflow bietet zwei Steuerungsschritte und verschiedene Aktionen entsprechend diesen Schrittergebnissen. Erstens: Wenn eine Probe ungeeignete Kontrollen enthält, muss die Verstärkung wiederholt werden. Zweitens: Wenn die Verstärkung gehemmt wird, muss die Probe von Anfang an aufbereitet oder als nicht wertvoll eingestuft werden.
Abbildung 2 zeigt die Fluoreszenzkurven, die durch positive und ne.......
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Diskussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die DNA-Integritätsanalyse von Hockern, die durch manuelle und halbautomatische Ansätze extrahiert wurden, ein alternatives Werkzeug zur Früherkennung von kolorektalen Läsionen darstellen kann7,8,9,,10,11,12. Molekulare, nichtinvasive Screening-Tests wurden im Laufe der Jahre für den Nachwe.......
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Offenlegungen
Maura Menghi ist hauptamtliche Mitarbeiterin von Diatech Pharmacogenetics srl.
Danksagungen
Die Autoren haben keine Anerkennung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL und 2 mL Polypropylen-Twist-Lock-Röhrchen (DNase-, RNase-, DNA-, PCR-Inhibitor-frei) | Erforderliche Verbrauchsmaterialien für DNA-Extraktion und Real Time | ||
| PCR Absolutes Ethanol (Qualität des analytischen Grads) | Reagenz für DNA-Extraktion erforderlich | ||
| Tischzentrifuge | Maximale Geschwindigkeit von 20000 x g. Erforderliches Gerät für die DNA-Extraktion | ||
| EasyPGX Analysesoftware Version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysesoftware |
| EasyPGX Zentrifuge/Vortex 8-Well-Streifen | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Gerät empfohlen für den Real Time PCR Assay |
| EasyPGX qPCR Gerät 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Empfohlenes Gerät für den Real Time PCR Assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit erforderlich für den Real Time PCR Assay |
| Mikropipetten (Volumina von 1 bis 1.000 & Mikro; L) | Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und Real Time PCR benötigt | ||
| Puderfreie Einweghandschuhe | Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und Real Time PCR benötigt | ||
| werden QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit, empfohlen für die DNA-Extraktion und -Reinigung aus dem |
| Stuhl Sterile Filterspitzen DNase-, RNase-frei (Volumina von 1 bis 1.000 & Mikro; L) | Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und die Echtzeit-PCR erforderlich | ||
| Thermischer Block, z. B. EasyPGX Trockenblock | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Erforderliches Instrument für die DNA-Extraktion |
| Vortex, z. B. EasyPGX Zentrifuge/Vortex 1,5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Erforderliches Instrument für die DNA-Extraktion |
Referenzen
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
