CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmd^mdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

Zusammenfassung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere progressive Muskelerkrankung, die durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht wird, was letztlich zur Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen führt. Die regelmäßig interspaceed short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) Genbearbeitung hat das Potenzial, die Expression des Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Autologinduzierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Muskelvorläuferzellen (MPC) können den Stamm-/Vorläuferzellpool auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. In dieser Studie führen wir eine Kombination aus CRISPR/Cas9 und nicht integrierten iPSC-Technologien ein, um Muskelvorläufer mit wiedergewonnener Dystrophin-Proteinexpression zu erhalten. Kurz gesagt, verwenden wir einen nicht integrierenden Sendai-Vektor, um eine iPSC-Linie aus dermalen Fibroblasten von Dmd^mdx-Mäusen zu erstellen. Wir verwenden dann die CRISPR/Cas9-Löschstrategie, um die Dystrophinexpression durch eine nicht-homologe Endverbindung des regerahmten Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Nach der PCR-Validierung der Exon23-Erschöpfung in drei Kolonien aus 94 ausgewählten iPSC-Kolonien differenzieren wir iPSC in MPC durch Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von MyoD, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielt. Unsere Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit der Verwendung der CRISPR/Cas9-Löschstrategie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleitetem MPC, die ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung zukünftiger Therapien zur Behandlung von DMD hat.

Einleitung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten Muskeldystrophien und zeichnet sich durch das Fehlen von Dystrophin aus, von dem 1 von etwa 5.000 neugeborenen Jungen weltweit betroffen ist¹. Der Verlust der Dystrophin-Genfunktion führt zu strukturellen Muskeldefekten, die zu einer progressiven Myofiberdegeneration^1,2führen. Das rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-vermittelte Gentherapiesystem wurde getestet, um die Dystrophinexpression wiederherzustellen und die Muskelfunktion zu verbessern, wie z. B. Genersatz mittels Mikrodystrophine (-Dys). Der rAAV-Ansatz erfordert je....

Protokoll

Alle Tierbehandlungen und chirurgischen Eingriffe wurden durch ein Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Augusta genehmigt wurde. Mäuse wurden mit Standarddiät und Wasser ad libitum gefüttert.

1. Isolierung von primären Maus-Fibroblasten von erwachsenen Dmd^mdx Mäusen

1. Euthanisieren Erwachsene Dmd^mdx Mäuse (männlich, 2 Monate alt) durch CO₂ Erstickung und Thorakotomie nach IACUC genehmigt von Medical College of Georgia, Augusta University. Schneiden Sie den Schwanz mit einem sterilen Skalpell in einem sterilen Zustand unter der laminaren H....

Ergebnisse

Etablierung von Dmd^mdx Haut-Fibroblasten abgeleitet iPSC. Wir demonstrierten die Effizienz der Erzeugung von Maus-iPSCs von Dmd^mdx-Mäusen abgeleiteten Haut-Fibroblasten mit den integrationsfreien Reprogrammierungsvektoren. Abbildung 1A zeigte, dass das Auftreten embryonaler Stammzellen (ESC)-ähnliche Kolonien drei Wochen nach der Infektion. Wir bewerten die Effizienz der iPSC-Induktion durch lebende alkalische Phosphatase (AP) Fleck;

Diskussion

Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine destruktive und letztlich tödliche Erbkrankheit durch einen Mangel an Dystrophin gekennzeichnet, was zu progressiver Muskelatrophie^1,2. Unsere Ergebnisse zeigen die wiederhergestellte Dystrophin-Genexpression in Dmd^mdx iPSC-abgeleiteten myogenen Vorläuferzellen durch den Ansatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Exon23-Deletion. Dieser Ansatz hat drei Vorteile.

Zunächst haben wir iPSCs aus .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chirurgische Instrumente
31-Gauge-Nadel	Verschiedenes
Scharfer Schnitt	verschiedene
Sterile Skalpelle	Verschiedenes
Pinzette	Verschiedenes
Fibroblastenmedium (für 100 mL des vollständigen Mediums)		Firmenkatalognummer	Band
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21-985-023	0,1 mL
Antibiotikum Antimykotische Slution 100x	CORNING	MT30004CI	1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hohe Glukose	SIGMA	D6429	87 mL
Fetal Rinderserum charakterisiert	HyClone	SH30396.03	10 mL
L-Glutamin Lösung	SIGMA	G7513	1 mL
MEM Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Gibco	11140076	1 mL
TVP-Lösung (für 500 mL Komplettlösung)	Company	Catalog Number
Volume Chicken Serum	Gibco	16110-082	5 mL
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	186 mg
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung			bis 500 mL
Trypsin (2,5%)	Thermo	15090046	5 mL
mES-Wachstumsmedium (für 500 mL Komplettlösung)		Firmenkatalognummer	Band
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21-985-023	0,5 mL
Antibiotikum Antimykotische Slution 100x	CORNING	MT30004CI	5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hohe Glukose	SIGMA	D6429	408,5 mL
Fötales Rinderserum Charakterisiert	HyClone	SH30396.03	75 mL
L-Glutaminlösung	SIGMA	G7513	5 mL
Maus rekombinanter Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,5 x 106 U/mL	EMD Millipore Corp	CS210511	500 μ L
MEK/GS3-Inhibitor-Ergänzung	EMD Millipore Corp	CS210510-500UL	500 μ L
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Gibco	11140076	5 mL
Die ES-Zellmedien sollten nicht länger als 4 Wochen und mit Inhibitoren nicht länger als 2 Wochen gelagert werden.
mES gefrorenes Medium (für 50 mL Komplettlösung)	Company	Katalognummer	Volumen
Dimethylsulfoxid (DMSO)	SIGMA	D2650	5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hoher Glukosegehalt	SIGMA	D6429	24,9 mL
Fötales Rinderserum, charakterisiert	HyClone	SH30396.03	25 mL
rekombinanter Maus-Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,5 x 106 U/mL	EMD Millipore Corp	CS210511	50 μm; L
Name des Materials/der Ausrüstung	Unternehmen	Katalognummer	RRID
0,05 % Trypsin/0,53 mM EDTA	CORNING	25-052-CI
4 % Paraformaldehyd	Thermo scientific	J19943-k2
Accutase-Lösung	SIGMA	A6964	Zellablösungslösung
AgeI-HF	NEB	R3552L
Alexa488-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper	Invitrogen	A32723	AB_2633275
Alexa488-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper	Invitrogen	A32731	AB_2633280
Alexa555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper	Invitrogen	A32732	AB_2633281
Anti-AFP	Thermo scientific	RB-365-A1	AB_59574
Anti-Α-Glatt Muskelaktin (D4K9N) XP	CST	19245S	AB_2734735
Anti-Dystrophin	Thermo	PA5-32388	AB_2549858
Anti-LIN28A (D1A1A) XP	CST	8641S	AB_10997528
Anti-MYH2	DSHB	mAb2F7	AB_1157865
Anti-Nanog-XP	CST	8822S	AB_11217637
Anti-Oct-4A (D6C8T)	CST	83932S	AB_2721046
Anti-Sox2	abcam	ab97959	AB_2341193
Anti-SSEA1 (MC480)	CST	4744s	AB_1264258
Anti-TH (H-196)	SANTA CRUZ	sc-14007	AB_671397
alkalische Phosphatase Lebendfärbung (500x)	Thermo	A14353
Blasticidin S	Sigma-Aldrich	203350
BsmBI/Esp3I	NEB	R0580L/R0734L
Carbenicillin	Millipore	205805-250MG
Kollagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
Competent Cells	TakaRa	636763
CutSmart	NEB	B7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogrammierungskit	Thermo	A16517
DirectPCR Lysereagenz (Zelle)	VIAGEN BIOTECH	302-C
Dispase (1 U/ml)	STEMCELL Technologies	7923
Doxycyclinhydrochlorid	Fisher BioReagenzien	BP26535
EcoRI-HF	NEB	R3101L
Fibronektin Rinderplasma	SIGMA	F1141
QIAEX II Gel-Extraktionskit (500)	QIAGEN	20051
Gelatine aus Schweinehaut, Typ A	SIGMA	G1890
HardSet Eindeckmedium mit DAPI-Vektor		H-1500
Hygromycin B (50 mg/ml)	Invitrogen	10687010
Ketamin HCL Injektion	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	45822
KpnI-HF	NEB	R3142L
lenti-CRISPRv2-blast	Addgene	83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670	Addgene	99377
Lipofectamin 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2	Addgene	60625
LV-TRE-VP16 Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2	Addgene	60626
Maus auf Maus (M.O.M.) Basic Kit	Vector	BMK-2202
NotI-HF	NEB	R3189L
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher	31985070
Polyethylenglykol 4.000	Alfa Aesar	AAA161510B
Polybrene	SIGMA	TR1003
Corning  BioCoat Poly-D-Lysin/Laminin-Kulturobjektträger	CORNING	CB354688
PowerUp SYBR Green Master Mix	ThermoFisher	A25742
PrimeSTAR Max Premix	TakaRa	R045
Proteinase K	VIAGEN BIOTECH	507-PKP
Puromycin-Dihydrochlorid	MP Biomedicals	ICN19453980
qPCR Lentivirus Titrationskit	abm	LV900
Quick Ligation Kit	NEB	M2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)	QIAGEN	12945
RevertAid RT Reverse Transkriptionskit	Thermo scientific	K1691
RNAzol RT	Molecular Research Center, INC	RN 190
T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer	NEB	B0202S
T4 Polynukleotidkinase	NEB	M0201S
Hervorragende Bouillon Modifizierte	Fisher BioReagenzien	BP9729-600
ViralBoost Reagenz (500x)	ALSTEM	VB100