Methodenartikel

CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

7.6K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14. September 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

Zusammenfassung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere progressive Muskelerkrankung, die durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht wird, was letztlich zur Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen führt. Die regelmäßig interspaceed short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) Genbearbeitung hat das Potenzial, die Expression des Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Autologinduzierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Muskelvorläuferzellen (MPC) können den Stamm-/Vorläuferzellpool auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. In dieser Studie führen wir eine Kombination aus CRISPR/Cas9 und nicht integrierten iPSC-Technologien ein, um Muskelvorläufer mit wiedergewonnener Dystrophin-Proteinexpression zu erhalten. Kurz gesagt, verwenden wir einen nicht integrierenden Sendai-Vektor, um eine iPSC-Linie aus dermalen Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen zu erstellen. Wir verwenden dann die CRISPR/Cas9-Löschstrategie, um die Dystrophinexpression durch eine nicht-homologe Endverbindung des regerahmten Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Nach der PCR-Validierung der Exon23-Erschöpfung in drei Kolonien aus 94 ausgewählten iPSC-Kolonien differenzieren wir iPSC in MPC durch Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von MyoD, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielt. Unsere Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit der Verwendung der CRISPR/Cas9-Löschstrategie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleitetem MPC, die ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung zukünftiger Therapien zur Behandlung von DMD hat.

Einleitung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten Muskeldystrophien und zeichnet sich durch das Fehlen von Dystrophin aus, von dem 1 von etwa 5.000 neugeborenen Jungen weltweit betroffen ist1. Der Verlust der Dystrophin-Genfunktion führt zu strukturellen Muskeldefekten, die zu einer progressiven Myofiberdegeneration1,2führen. Das rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-vermittelte Gentherapiesystem wurde getestet, um die Dystrophinexpression wiederherzustellen und die Muskelfunktion zu verbessern, wie z. B. Genersatz mittels Mikrodystrophine (-Dys). Der rAAV-Ansatz erfordert jedoch wiederholte Injektionen, um die Expression des funktionellen Proteins3,4aufrechtzuerhalten. Daher brauchen wir eine Strategie, die eine effektive und dauerhafte Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression bei Patienten mit DMD bietet. Die Dmdmdx Maus, ein Mausmodell für DMD, hat eine Punktmutation in exon 23 des Dystrophin-Gens, die ein vorzeitiges Beendigungscodon einführt und zu einem nicht-funktionellen abgeschnittenen Protein führt, das nicht die C-terminale dystroglygische Bindungsdomäne enthält. Jüngste Studien haben den Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression durch genaue Genkorrektur oder mutierte Exon-Deletion bei kleinen und großen Tieren5,6,7gezeigt. Long et al.8 berichtete über die Methode zur Korrektur der Dystrophin-Genmutation in Dmdmdx Mauskeimbahn durch homology-directed repair (HDR) basierte CRISPR/Cas9 Genombearbeitung. El Refaey et al.9 berichteten, dass rAAV das mutierte Exon 23 bei dystrophischen Mäusen effizient verbrauchen konnte. In diesen Studien wurden gRNAs in den Introns 20 und 23 entwickelt, um doppelsträngige DNA-Brüche zu verursachen, die die Dystrophinexpression nach DNA-Reparatur über nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) teilweise wiederhergestellt haben. Noch spannender ist, dass Amoasii et al.10 kürzlich über die Wirksamkeit und Machbarkeit der rAAV-vermittelten CRISPR-Genbearbeitung bei der Wiederherstellung der Dystrophinexpression in Canine-Modellen berichtet haben, ein wesentlicher Schritt in der zukünftigen klinischen Anwendung.

DMD verursacht auch Stammzellstörungen11. Bei Muskelschäden füllen die muskuchen Muskelstammzellen nach der Muskeldifferenzierung sterbende Muskelzellen auf. Jedoch, die aufeinanderfolgenden Zyklen der Verletzung und Reparatur führen zu Verkürzung der Telomere in Muskelstammzellen12, und vorzeitige Erschöpfung der Stammzellbecken13,14. Daher kann eine Kombination aus autologer Stammzelltherapie mit Genombearbeitung zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression ein praktischer Ansatz zur Behandlung von DMD sein. Die CRISPR/Cas9-Technologie bietet die Möglichkeit, autologe genetisch korrigierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zur funktionellen Muskelregeneration zu erzeugen und weitere Komplikationen von DMD zu verhindern, ohne eine Immunabstoßung zu verursachen. IPSCs haben jedoch ein Risiko für eine Tumorbildung, die durch die Differenzierung von iPSC in myogene Vorläuferzellen gemildert werden könnte.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des nicht integrierenden Sendai-Virus zur Umprogrammierung dermaler Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen in iPSCs und dann die Dystrophinexpression durch CRISPR/Cas9-Genomlöschung. Nach der Validierung der Exon23-Deletion bei iPSC durch Genotypisierung differenzierten wir genomkorrigiertes iPSC in myogene Vorläufer (MPC) über MyoD-induzierte myogene Differenzierung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierbehandlungen und chirurgischen Eingriffe wurden durch ein Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Augusta genehmigt wurde. Mäuse wurden mit Standarddiät und Wasser ad libitum gefüttert.

1. Isolierung von primären Maus-Fibroblasten von erwachsenen Dmdmdx Mäusen

  1. Euthanisieren Erwachsene Dmdmdx Mäuse (männlich, 2 Monate alt) durch CO2 Erstickung und Thorakotomie nach IACUC genehmigt von Medical College of Georgia, Augusta University. Schneiden Sie den Schwanz mit einem sterilen Skalpell in einem sterilen Zustand unter der laminaren Haube. Den Schwanz mit 70% Ethanol für 5 min abspülen und dann mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in einer 6 cm Schale waschen.
  2. Schälen Sie die Schwanzhaut durch einen scharfen Schnitt von der Basis bis zur Schwanzspitze entlang der Schwanzhaut, und schälen Sie dann sanft die Schwanzhaut mit einer Pinzette ab. Die Haut mit einem sterilen Skalpell auf eine Größe von 1 mm3 zerkleinern und das gehackte Hautgewebe in Dulbeccos minimalem essentiellen Medium/Schinken F12 (DMEM/F12) mit 0,1% Kollagennase IV und 1 U/ml Dispase auf eine 6 cm große Schale bewegen.
  3. Das Hautgewebe in einer Kulturschale für 2 h bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator verdauen.
  4. Mantel einer 6-Well-Platte mit Fibronectin und 0,2% Gelatine (1 ml Fibronectin in 199 ml von 0,2% Gelatine; Materialtabelle) und bei 37 °C für 1 h inkubieren.
  5. Dissoziieren Sie das verdaute Hautgewebe mit einer 1 ml Pipettenspitze und übertragen Sie das Gewebe und den Überstand in ein steriles 15 ml konisches Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 217 x g für 3 min bei Raumtemperatur, den Überstand entsorgen und das Pellet in 1,5 ml Fibroblastenmedium(Materialtabelle)wieder aufsetzen.
  6. Kultur die Pellets einschließlich unvollständig verdautem Hautgewebe ab Schritt 1.5 auf der mit Fibronectin beschichteten 6-Well-Platte und 0,2% Gelatine ab Schritt 1,4 in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium 24 h nach der ersten Beschichtung, um nicht angefügte Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium alle 48 h.

2. Umprogrammierung von Maushaut-Fibroblasten in iPSCs

  1. Zwei Tage vor der Transduktion verdauen Maus dermale Fibroblasten aus Schritt 1.6 mit der Zellablösung (Materialtabelle) in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 5 min.
  2. Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min.
  3. Samenzellen mit einer Dichte von 1x2 x 105 Zellen pro Brunnen auf eine 6-Well-Platte und Kultur mit Fibroblastenmedium (Materialtabelle) in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2.
  4. Schätzen Sie am Tag der Transduktion (Tag 0) die Zellen und berechnen Sie das Volumen jedes Virus, das erforderlich ist, um die Zielvielzahl der Infektion (MOI) von 5, 5 und 3 (d.h. KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) gemäß dem handelsüblichen Handbuch zu erreichen.

figure-protocol-1

  1. Drei Sendai-Rohre in einem 37 °C-Wasserbad für 5 bis 10 s auftauen und die berechneten Volumina der drei Sendai-Röhren zu 1 ml Fibroblastenmedium(Materialtabelle)hinzufügen.
  2. Entfernen Sie das Fibroblastenmedium aus Schritt 2.3 und fügen Sie die Neuprogrammierungsvirusmischung in die Brunnen ein, die die Zellen enthalten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2.
  3. Ersetzen Sie das Medium nach der Transduktion durch frisches Fibroblastenmedium 24 h. Kultur die Zellen für eine Woche mit mittlerem Austausch jeden zweiten Tag.
  4. Ernten Sie infizierte Maus-Fibroblasten am Tag 7 nach der Transduktion mit 0,05% Trypsin/EDTA und legen Sie sie auf Gerichte, die zuvor mit Fibronectin und 0,2% Gelatine beschichtet waren.
  5. Kultur die infizierten Maus-Fibroblasten aus Schritt 2.6 mit komplettem mausembryonalen Stammzell (ES) Wachstumsmedium (Materialtabelle) in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 und täglich mittleres Wechselmedium.
  6. Beobachten Sie ab dem 8. Tag die Platte unter einem invertierten Mikroskop jeden zweiten Tag, um das Auftreten von Zellklumpen mit der Morphologie der Maus ES zu identifizieren.

3. Verwendung von alkalischer Phosphatase Lebendfleck und Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der Reprogrammierungseffizienz

  1. Entfernen Sie die Kulturmedien aus jedem Brunnen und spülen Sie mit DMEM/F-12 für 2 x 3 min.
  2. Tragen Sie 2 ml 1x 1x alkalische Phosphatase (AP) lebende Fleckenarbeitslösung (1:500 Verdünnung in DMEM/F-12) auf die anhaftenden Zellen auf und in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 30 min inkubieren.
  3. Aspirieren Sie den AP-Live-Färbung und waschen Sie zweimal mit PBS für jeweils 5 min.
  4. Verdauen Sie die Zellen mit der Zellablösung (Materialtabelle) in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 5 min. Führen Sie die Durchflusszytometrie durch, um die Reprogrammierungseffizienz zu bestimmen.

4. Auswahl und Ernte von ES-ähnlichen Zellen

  1. Untersuchen Sie die Kolonien ab Schritt 2.8 unter einem invertierten Mikroskop.
  2. Markieren Sie die Kolonien am boden der Schale mit einem selbstfänzigen Objektmarker.
  3. Tragen Sie gefettete Klonringe auf, um die markierten Zellkolonien abzudecken. Fügen Sie jedem Klonring bei 37 °C für 5 min 100 l 0,05 % Trypsin/EDTA hinzu und übertragen Sie dann die verdauten Zellen mit 100 L Pipettenspitzen auf 48-Well-Kulturplatten, die mES-Wachstumsmedium enthalten.
  4. Inkubieren Sie die Zellen in 48-Well-Kulturplatten in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2. Durchkommen Sie die Zellen auf 6 cm Schale, wenn sie 70% Zusammenfluss erreichen.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 mehrmals, bis einheitliche Wohnheim-förmige Klone erhalten sind.

5. Einfrieren von iPSCs zur Kryokonservierung

  1. Trennen Sie die ausgewählten iPSCs von Schritt 4.5 mit Trypsin, Versene und Kükenplasma (TVP; Materialtabelle) Lösung bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator für 30 min.
  2. Sammeln Sie die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
  3. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 2 ml Maus ES gefrorenes Medium (Tabelle der Materialien) wieder auf, um 1 ml pro Kryovial zu erhalten.
  4. Fügen Sie den Kryovials Zellen hinzu und frieren Sie mit einem Gefrierbehälter ein, der die kritische, wiederholte -1 °C/min Kühlrate liefert, die für die Kryokonservierung bei -80 °C über Nacht erforderlich ist.
  5. Gefrorene Fläschchen in einen flüssigen Stickstofftank übertragen.

6. Immunfluoreszenzfärbung für Stammzellmarker in iPSCs

  1. Saat-iPSCs von Schritt 5.1 mit mES-Medium zu einem 8-Well-Kammerschlitten, der mit Poly-D-Lysin/Laminin(Materialtabelle)mit entsprechender Dichte beschichtet ist, um zwischen 1 x 2 x 104 Zellen pro Bohrkörper zu erreichen und in einem 37 °C-Inkubator mit einem befeuchtete Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h.
  2. Tauchen Sie die Dias in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur ein, und tauchen Sie die Dias dann zweimal für 5 min ein.
  3. Inkubieren Sie Abschnitte mit einem Maus-IgG-blockierenden Reagenz (Materialtabelle) und 5% Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Verdünnen Sie die primären Antikörper in Proteinverdünnungsmittel (Maus-Anti-SSEA1, 1:100, Kaninchen-Anti-Nanog, 1:500; Kaninchen-Anti-POU-Klasse 5 Homöobox 1 [OCT4], 1:500; Kaninchen-Anti-SRY-Box 2 [SOX2], 1:500; Kaninchen-Anti-Lin-28 Homolog A [Lin28A], 1:400) (Tabelle Materialien). Antikörper auf die Zellen auftragen und bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer brüten.
  5. Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Dias 3x in PBS.
  6. Zweite Antikörper (Alexa488-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und Alexa555-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen, jeweils 1:400) in M.O.M.-Proteinverdünnung auf Dias auftragen und 45 min bei Raumtemperatur brüten.
  7. Waschen Sie die Dias 3x in PBS und montieren Sie Abschnitte mit Montagemedium mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  8. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.

7. Untersuchung der Pluripotenz von iPSCs in vivo

  1. Dissoziieren Sie die iPSCs von Schritt 5.1 in Einzelzellen mit TVP-Lösung in einem 37 °C-Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5%CO2 für 30 min.
  2. Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer und Zentrifuge bei 217 x g für 3 min.
  3. Den Überstand ansaugen und das Pellet mit mES-Medium in einem 1,5 ml sterilen Zentrifugenrohr in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/30 l für die Zelltransplantation wieder aufsetzen.
  4. Entfernen Sie Das Haar von beiden Hinterbeinen von immundefizienten Mäusen mit Haarclippern.
  5. Mäuse mit Ketamin (100 mg/kg) ansietheisieren und die Injektionsstelle mit 75% Alkohol reinigen.
  6. Intramuskulär in die Gastrocnemii mit einer 31 G-Nadel injizieren.
  7. Zwei Wochen nach der Injektion die Maus gastrocnemii ernten und in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) einbetten, einfrieren und in 5-m Abschnitte15,16schneiden.
  8. Befestigen Sie Abschnitte in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur, und waschen Sie dann die Dias zweimal in PBS für 5 min jedes Mal.
  9. Blockieren Sie die Zellen mit 5% Ziegenserumprotein verdünnbar für 1 h bei Raumtemperatur.
  10. Verdünnter Primärantikörper (Kaninchen anti-AFP, 1:50; Kaninchen anti-SMA, 1:50; Kaninchen-Anti-TH, 1:50) zu den Dias geben und bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer brüten.
  11. Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 3x (5 min/wash) in PBS, fügen Sie einen 1:400 verdünnten Alexa555-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper zu Dias hinzu und brüten 45 min bei Raumtemperatur.
  12. Schlitten 3x (5 min/Wash) in PBS waschen und Abschnitte mit Montagemedium mit DAPI montieren.

8. Bau von CRISPR/Cas9 lentiviralen Vektor, der auf Introns abzielt, die Dystrophin exon 23 flankieren

  1. Entwerfen Sie zwei Paare von gRNA-Oligos, die auf intron-flankiertes Dystrophin exon 23 über http://crispor.tefor.net/crispor.py abzielen.
    HINWEIS: Die entworfenen Paare sind wie folgt:
    i22Sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAAATCAA- 3'
    i22Anti-Sinn: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
    i23Sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
    i23Anti-Sinn: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
  2. Verdauen und dephosphorylieren 5 g lentivirales CRISPR-Plasmid (lenti-CRISPRv2-blast [ein Geschenk von Mohan Babu] und lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [ein Geschenk von Kristen Brennand]) (Materialtabelle) mit BsmB1/Esp3I für 30 min bei 37 °C. Für 5 g Plasmide, fügen Sie 3 l BsmB1-Restrict-Enzym, 3 l schnelle alkalische Phosphatase, 6 l 10x Enzym-Digest-Puffer und 0,6 l von 100 mM DTT in 60-L-Reaktion hinzu.
  3. Laden Sie die Reaktionen auf ein 0,8% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
  4. Reinigen Sie verdautes Plasmid in-Gel mit einem Gel-Extraktions-Kit (Tabelle der Materialien) und elute in 20 l von H2O.
  5. Phosphorylat und Anneal jedes Paar der gRNA-Oligonukleotide, die 1 l jedes Oligonukleotids bei 100 m, 1 l 10x T4-Ligationspuffer, 0,5 l T4-Polynukleotidkinase (PNK), 6,5 l ddH2O bei 37 °C für 30 min und dann 95 °C für 5 min und bis 25 °C bei 5 °C/min.
  6. Ligate eine 1:200 Verdünnung der geglühten gRNA-Oligonukleotide in die plentiCRISPR V2-Blast oder plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mischen Sie 50 ng BsmB1/Esp3I verdautVektoren mit 1 l verdünntem Oligo-Duplex und 5 l 2x Ligase-Puffer plus 1 l Ligase in einem 11-L-Reaktionssystem und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur.
  7. Führen Sie die Umwandlung mit 3 l Ligationsprodukt in 50 l kompetente Zellen(Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  8. Die transformierten, kompetenten Zellen in einer Agarplatte mit 100 g/ml Carbenicillin verteilen und bei 31,5 °C für 18 h inkubieren.
  9. Pflücken Sie Kolonien mit 10 l sterilen Pipettenspitzen und Kultur in 5 ml toller Brühe (Materialtabelle) mit 100 g/ml Carbenicillin bei 31,5 °C, 185 Umdrehungen pro Minute in einem Shaker-Inkubator für 21 h.
  10. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit den Mini-Prep- und Midi-Prep-Kits (Table of Materials).
  11. Überprüfen Sie die Mini-Prep-Plasmide durch Einschränkung der Verdauung. Für das 20-L-Reaktionssystem fügen Sie 1 g Plasmid-DNA, 2 l Verdauungsreaktionspuffer(Materialtabelle) und 1 l Restriktionsenzymgemisch (0,5 l KpnI-HF und 0,5 l AgeI-HF für plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l NotI-HF und 0,5 l EcoRI-HF für EcoRI-HF für plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Inkubieren Sie das Reaktionssystem für 1 h bei 37 °C.
  12. Laden Sie die Reaktionen auf ein 0,8% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
    HINWEIS: Die richtigen Bänder für plentiCRISPR V2-Blast-i22 sollten 622 bp und 12.2 kb sein, und die richtigen Bänder für plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 sollten 2,6 kb und 7,1 kb sein.

9. Lentivirale Vektorverpackung

  1. Kultur 7 x 105 293FT Zellen in 5 ml DMEM-Medien, die 10% fetales Rinderserum in einer 6 cm Schale über Nacht bei 37 °C, 5%CO2enthalten.
  2. Bereiten Sie einen Cocktail zu (1 g plentiCRISPR V2-Blast-i22 oder plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng psPAX2-Verpackungsplasmid, 250 ng pMD2.G Hüllhüllenplasmid und 5 l Transfektionsreagenz A [Materialtabelle] in 100 l reduziertem MeM-Medium).
  3. Bereiten Sie eine Mischung aus 5 l Transfektionsreagenz B (Materialtabelle) in 100 l reduziertem Serum MEM-Medien vor.
  4. Fügen Sie 100 l Transfektionsreagenz B-Gemisch zu Plasmid-Mischung aus Schritt 9.2 und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex (ab Schritt 9.4) tropfenweise zu den 293FT-Zellen hinzu. Über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
  6. Fügen Sie jedem Gericht am nächsten Tag virusproduction enhancer (500x)(Materialtabelle)hinzu und brüten 24 h bei 37 °C, 5% CO2.
  7. Sammeln Sie an den nächsten zwei Tagen Mittel aus Zellen, die Pipetten verwenden, und filtern Sie das Medium durch einen 0,45 m Filter, um die Zellen zu entfernen.

10. Konzentration und Reinigung von lentiviralen Vektoren

  1. Exzipitate lentiviralvektor im Medium Schritt 9.7 über Nacht bei 4 °C mit 5x Polyethylenglykol 4000 (PEG4000, 8,5% Endkonzentration) und 4 M NaCl (0,4 M Endkonzentration).
  2. Zentrifugieren Sie die viralen Medien, die die PEG4000-Lösung bei 2.095 x g und 4 °C enthalten, für 30 min, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
  3. Die Pellets mit 500 l Serum reduzierten MEM-Medien (Lentivirus-Titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1,56 x 108, lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1,3 x 108, lenti-CRISPR V2-Steuerung: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-Steuerung: 5,9 x 107 ). Bei -80 °C bis zur Verwendung lagern.

11. Löschen von exon 23 in Maus iPSCs mit zwei Führungs-RNAs (gRNAs) gekoppelt mit Cas9

  1. Die Maus-iPSCs ab Schritt 4.5 in einer 24-Well-Platte mit Fibronectin und Gelatine beschichtet.
  2. Nachdem die Zellen 50% Zusammenfluss erreicht haben, wechseln Sie zum frischen Kulturmedium (vollständiges embryonales Stammzellwachstumsmedium der Maus), das 8 g/ml Polybren enthält).
  3. Fügen Sie 100 l der lentiviralen Partikellösung aus Schritt 10.3 einschließlich lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 und Steuerung (leerer Vektor: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) zu Maus-iPSCs hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 37 °C mit 5%CO2.
  4. Wählen Sie stabil infizierte Zellen mit Medien aus, die 2,5 g/ml Blasticidin und 100 g/ml Hygromycin B enthalten, indem Sie die Minimale Konzentration von Blasticidin und Hygromycin B bestimmen, die erforderlich ist, um die nicht infizierte Zelle abzutöten.
    HINWEIS: Nicht infizierte Zellen würden durch Blasticidin und Hygromycin B getötet.
  5. Verdauen Sie die ausgewählten Maus-iPSCs mit 0,5 ml TVP-Lösung jeweils gut (24-Well-Platte) und brüten Zellen für 30 min bei 37 °C mit 5%CO2.
  6. Dissoziieren Sie die iPSCs in Einzelzellen durch Pipettieren, zählen Sie Zellen mit einer Zellzählkammer und verdünnen Sie dann etwa 150 verdaute Einzelzellen mit mES-Medium in 10 cm Schale für Kultur bei 37 °C mit 5%CO2.
  7. Nach etwa 10 Tagen wählen Sie einzelne Kolonien unter einem invertierten Mikroskop mit 10 l sterilen Pipettenspitzen (96 Kolonien müssen gepflückt werden).
  8. Übertragen Sie die gepflückten Kolonien in 50 l TVP-Lösung jeden Brunnen (96-Well-Platte, eine Kolonie jeder Brunnen), verdauen bei 37 °C für 30 min, und säen Sie dann die verdauten Zellen in zwei 96-Well-Kulturplatten, um Kultur zu halten (eine für Genotypisierung).
  9. Inkubieren Sie in einem CO2-Inkubator bei 37 °C bis 70% konfluent.

12. Identifizierung von iPSC-Kolonien mit exon23-Löschung

  1. Entfernen Sie das Medium in 96-Well-Platte, wenn die Zellkolonien 70% Zusammenfluss erreichen.
  2. Fügen Sie jedem Brunnen 25 L Lysereagenz(Materialtabelle) mit Proteinase-K-Lösung (1 ml Proteinase K in 100 ml Lysereagenz) hinzu und übertragen Sie das Lysat auf eine 96-Well-PCR-Platte.
  3. Versiegeln Sie die PCR-Platte und inkubieren Sie die Platten bei 55 °C für 30 min, und dann bei 95 °C für 45 min, um die Zellen zu lysieren und die Proteinase K zu denaturieren.
  4. PCR-Reaktion mit 2 l Lysat ab Schritt 12.3 durchführen. Für die 20-L-PCR-Reaktion 2 l Lysat, 10 l 2x DNA-Polymerase-Vormischung(Materialtabelle),7 l DNase-freies Wasser und 1 l DMD-Exon 23-Primer (Tabelle 1) hinzufügen.
  5. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die PCR-Reaktion: 98 °C für 1 min, 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 30 s und eine Endverlängerung bei 72 °C für 1 min.
  6. Laden Sie die PCR-Reaktion auf ein 2% Agarose-Gel. Führen Sie das Gel bei 100 bis 150 V für 30 min.
  7. Prüfen Sie das Gel unter UV-Licht (die Knockout-Effizienz ist 3/94).

13. Verwendung des Tet-on MyoD-Aktivierungssystems zur direkten Unterscheidung von iPSC in myogene Vorläuferzellen (MPC)

  1. Verpacken Sie die LV-TRE-VP64-Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2 und LV-TRE-VP16 Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2 (ein Geschenk von Charles Gersbach) (Materialtabelle) wie zuvor für lenti-CRISPRv2-blast und lenti-gRNA-iRFP670 Vektoren in Abschnitten beschrieben 9 und 10.
  2. Infizieren Sie Maus iPSC mit lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 oder lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2, wie zuvor für lenti-CRISPRv2-blast und lenti-gRNA-iRFP670 Vektoren in den Schritten 11.1-11.3 beschrieben.
  3. Wählen Sie nach drei Tagen der Infektion Zellen mit 1 g/ml Puromycin aus, um eine reine transduzierte Zellpopulation zu erhalten.
  4. Fügen Sie der MPC-Differenzierung 3 g/ml Doxycyclin in Kulturmedien (10% FBS DMEM) hinzu. Ersetzen Sie frisches Medium, das alle zwei Tage durch Doxycyclin ergänzt wird.

14. Quantitative Reverse-Transkription PCR zur Bewertung der dynamischen Muskeldifferenzierung und DMD-Exon-22-24-Expression

  1. Extrahieren Sie zelluläre RNA nach 0, 3, 6 und 10 Tage nach der Doxycyclin-Behandlung mit RNA-Isolationsreagenz, transkribieren Sie RNA in cDNA mit Hilfe des ersten StrangcDNA-Synthesekits (Table of Materials).
  2. Für das 20-L-qPCR-Reaktionssystem 1 l cDNA, 10 l PCR-Reaktionspuffer(Materialtabelle),8 l DNA H2O und 1 l Mischung aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Glyzeraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase [GAPDH], Skelettmuskel [ACTA1], OCT4 und DMD exon22, DMD exon23 und DMD exon24, siehe Tabelle 1).
  3. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die PCR-Reaktion: 50 °C für 2 min, 95 °C für 2 min, 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min, Schmelzkurve 65,0 °C bis 95,0 °C, Inkrement 0,5 °C.

15. Immunfluoreszenzfärbung von Myosin-Schwerketten 2 (MYH2) und Dystrophin-Proteinexpression

  1. Platte Doxycyclin-induzierte, lenti-TRE-MyoD modifizierte Zellen von Schritt 13.4 auf 8-Well-Kultur-Dias.
  2. Fix Zellen in 4% Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur, und dann waschen Sie die Dias zweimal in PBS für 5 min jedes Mal.
  3. Blockieren Sie die Zellen mit 5% Ziegenserumprotein verdünnbar für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Kaninchen-Antidystrophin-Antikörper (1:300) und Maus-Anti-MYH2-Antikörper (1:100) zu den Dias geben, bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
  5. Entsorgen Sie die primäre Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 3x (5 min/wash) in PBS, fügen Sie 1:400 verdünnte Alexa488-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper und Alexa555-konjugierte Ziege-Anti-Maus-Antikörper zu Dias hinzu und brüten für 45 min bei Raumtemperatur.
  6. Waschen Sie die Dias 3x (5 min/wash) in PBS, und montieren Sie Abschnitte mit Montagemedium, das DAPI enthält.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Etablierung von Dmdmdx Haut-Fibroblasten abgeleitet iPSC. Wir demonstrierten die Effizienz der Erzeugung von Maus-iPSCs von Dmdmdx-Mäusen abgeleiteten Haut-Fibroblasten mit den integrationsfreien Reprogrammierungsvektoren. Abbildung 1A zeigte, dass das Auftreten embryonaler Stammzellen (ESC)-ähnliche Kolonien drei Wochen nach der Infektion. Wir bewerten die Effizienz der iPSC-Induktion durch lebende alkalische Phosphatase (AP) Fleck;

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine destruktive und letztlich tödliche Erbkrankheit durch einen Mangel an Dystrophin gekennzeichnet, was zu progressiver Muskelatrophie1,2. Unsere Ergebnisse zeigen die wiederhergestellte Dystrophin-Genexpression in Dmdmdx iPSC-abgeleiteten myogenen Vorläuferzellen durch den Ansatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Exon23-Deletion. Dieser Ansatz hat drei Vorteile.

Zunächst haben wir iPSCs aus ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Tang und Weintraub wurden teilweise von NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chirurgische Instrumente
31-Gauge-NadelVerschiedenes 
Scharfer Schnittverschiedene 
Sterile SkalpelleVerschiedenes 
PinzetteVerschiedenes 
Fibroblastenmedium (für 100 mL des vollständigen Mediums)FirmenkatalognummerBand
2-Mercaptoethanol (55 mM)Gibco21-985-0230,1 mL
Antibiotikum Antimykotische Slution 100xCORNINGMT30004CI1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hohe GlukoseSIGMAD642987 mL
Fetal Rinderserum charakterisiertHyCloneSH30396.0310 mL
L-Glutamin LösungSIGMAG75131 mL
MEM Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100x) Gibco111400761 mL
TVP-Lösung (für 500 mL Komplettlösung)CompanyCatalog Number
Volume Chicken SerumGibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
Phosphatgepufferte Kochsalzlösungbis 500 mL
Trypsin (2,5%)Thermo150900465 mL
mES-Wachstumsmedium (für 500 mL Komplettlösung)FirmenkatalognummerBand
2-Mercaptoethanol (55 mM)Gibco21-985-0230,5 mL
Antibiotikum Antimykotische Slution 100xCORNINGMT30004CI5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hohe GlukoseSIGMAD6429408,5 mL
Fötales Rinderserum CharakterisiertHyCloneSH30396.0375 mL
L-GlutaminlösungSIGMAG75135 mL
Maus rekombinanter Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 μ L
MEK/GS3-Inhibitor-ErgänzungEMD Millipore CorpCS210510-500UL500 μ L
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x) Gibco111400765 mL
Die ES-Zellmedien sollten nicht länger als 4 Wochen und mit Inhibitoren nicht länger als 2 Wochen gelagert werden.
mES gefrorenes Medium (für 50 mL Komplettlösung)CompanyKatalognummerVolumen
Dimethylsulfoxid (DMSO)SIGMAD26505 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hoher GlukosegehaltSIGMAD642924,9 mL
Fötales Rinderserum, charakterisiertHyCloneSH30396.0325 mL
rekombinanter Maus-Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 μm; L
Name des Materials/der AusrüstungUnternehmenKatalognummerRRID
0,05 % Trypsin/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4 % ParaformaldehydThermo scientificJ19943-k2
Accutase-LösungSIGMAA6964Zellablösungslösung
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-AntikörperInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperInvitrogenA32732AB_2633281
Anti-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
Anti-Α-Glatt Muskelaktin (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
Anti-DystrophinThermoPA5-32388AB_2549858
Anti-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641SAB_10997528
Anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
Anti-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
Anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
Anti-Sox2abcamab97959AB_2341193
Anti-SSEA1 (MC480)CST4744sAB_1264258
Anti-TH (H-196)SANTA CRUZ sc-14007AB_671397
alkalische Phosphatase Lebendfärbung (500x)ThermoA14353
Blasticidin SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
CarbenicillinMillipore205805-250MG
Kollagenase IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
Competent CellsTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai ReprogrammierungskitThermoA16517
DirectPCR Lysereagenz (Zelle)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispase (1 U/ml)STEMCELL Technologies7923
DoxycyclinhydrochloridFisher BioReagenzienBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
Fibronektin RinderplasmaSIGMAF1141
 
QIAEX II Gel-Extraktionskit (500)		QIAGEN20051
Gelatine aus Schweinehaut, Typ ASIGMAG1890
HardSet Eindeckmedium mit DAPI-VektorH-1500
Hygromycin B (50 mg/ml)Invitrogen10687010
Ketamin HCL InjektionHENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfection KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene60625
LV-TRE-VP16 Maus MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
Maus auf Maus (M.O.M.) Basic KitVectorBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher31985070
Polyethylenglykol 4.000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  BioCoat Poly-D-Lysin/Laminin-KulturobjektträgerCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinase KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Puromycin-DihydrochloridMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Lentivirus TitrationskitabmLV900
Quick Ligation KitNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
RevertAid RT Reverse TranskriptionskitThermo scientificK1691
RNAzol RTMolecular Research Center, INCRN 190
T4 DNA-Ligase-ReaktionspufferNEBB0202S
T4 PolynukleotidkinaseNEBM0201S
Hervorragende Bouillon ModifizierteFisher BioReagenzienBP9729-600
ViralBoost Reagenz (500x)ALSTEMVB100

Referenzen

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

CRISPR Cas9 GenomeditierungWiederherstellung der Dystrophin ExpressionDuchenne Muskeldystrophienicht homologes End JoiningExon23 DeletionMyoD induzierte DifferenzierungSendai Vektor ReprogrammierungPCR ValidierungAgarose Gelelektrophorese

Verwandte Artikel