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Methodenartikel

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

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DOI:

10.3791/59437

⸱

21. Mai 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Zusammenfassung

Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.

Einleitung

Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysieren 3 , 4. ROS spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Krankheitsresistenz, sowohl als sekundäre Botenstoffe zur Verbreitung von Immunsignalisierung als auch als direkte antimikrobielle Wirkstoffe5. Die erste Beobachtung eines immunentlösten oxidativen Bursts wurde mit Kartoffelknollen von cv. Rishiri nach Phytophthora infestans Inokulation6beschrieben. Die ROS-Produktion wurde in mehreren Pflanzenarten mit Blattscheiben7, Zellsuspensionskulturen8und Protoplasten6. Beschrieben hier ist eine einfache Methode für die Assaying Muster-ausgelöste ROS-Produktion in Blattscheiben von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Als Reaktion auf die MAMP-Wahrnehmung katalysieren aktivierte RBOH-Proteine die Produktion von Superoxid-Radikalen (O2-), Hydroxylradikalen (•OH) und Singlet-Sauerstoff (1O2 ), die in Wasserstoffperoxid umgewandelt werden (H2 O 2) im extrazellulären Raum9. H2O2 kann durch Luminol-basierte Chemilumineszenz in Gegenwart des Oxidationsmittels Meerrettichperoxidase (HRP)10quantifiziert werden. HRP oxidiertH2O2 und erzeugt ein Hydroxid-Ion (OH) und Sauerstoffgas (O2 ), die mit Luminol reagieren, um ein instabiles Zwischenprodukt zu erzeugen, das ein Photon von Licht10freisetzt. Photonenemission kann als relative Lichteinheiten (RLUs) mit einem Mikroplattenleser oder Imager quantifiziert werden, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen, die in den meisten molekularen Laboratorien zu Standardgeräten geworden sind. Durch die Messung des Lichts, das über ein 40-60-Minuten-Intervall erzeugt wird, kann ein transienter oxidativer Ausbruch bereits 2-5 Minuten nach der Behandlung des Entauslöserers erkannt werden, der bei 10-20 Minuten seinen Höhepunkt erreicht und nach 60 Minuten11auf basale Werte zurückkehrt. Das kumulative Licht, das in diesem Zeitverlauf erzeugt wird, kann als Maß für die Immunstärke verwendet werden, das der Aktivierung von RBOH-Proteinen12entspricht. Praktischerweise erfordert dieser Test keine spezielle Ausrüstung oder umständliche Probenvorbereitung.

Kurz nach dem MAMP-Nachweis gilt der oxidative Ausbruch als frühe Immunantwort, zusammen mit der MAPK-Aktivierung und der Ethylenproduktion5. Spätere Immunantworten sind Transkriptionsreprogrammierung, stomataler Verschluss und Calloseablagerung2,5. Eine längere Exposition gegenüber MAMPs aktiviert kontinuierlich energetisch-kostenintensive Immunsignale, was zur Hemmung des Pflanzenwachstums führt, was auf einen Kompromiss zwischen Entwicklung und Immunität13hindeutet. Musterausgelöste Sättlingswachstumshemmung (SGI) wird häufig zur Beurteilung der Immunleistung bei Arabidopsis verwendet und war integraler Bestandteil der Identifizierung mehrerer Schlüsselkomponenten der Immunsignalisierung, einschließlich PRRs14,15 ,16. Daher präsentiert dieses Papier zusätzlich einen Test für musterausgelöste SGI in Arabidopsis, wobei Sämlinge in Multi-Well-Platten angebaut werden, die Standardmedien oder Medien enthalten, die 8-12 Tage lang mit einem Immunenteliciter ergänzt und dann gewogen werden. mit einer analytischen Skala.

Um zu demonstrieren, wie ROS- und SGI-Assays zur Überwachung der PRR-vermittelten Signalisierung verwendet werden können, wurden drei Genotypen ausgewählt, die unterschiedliche Immunausgänge darstellen: (1) der wilde Typ Arabidopsis Beitritt Columbia (Col-0), (2) der dominant-negative Bak1-5 Mutant, bei dem der multifunktionale PRR-Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) bei der Immunsignalisierung17,18und (3) dem rezessiven cpk28-1 Mutanten, dem die CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) und zeigt erhöhte immunausgelöste Reaktionen19,20. ROS- und SGI-Assays werden als Reaktion auf ein synthetisch hergestelltes elf18-Peptid-Epitop des bakteriellen Dehnungsfaktors Tu (EF-Tu) vorgestellt, das in Arabidopsis vom PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15anerkannt wird. Diese Protokolle können mit anderen Immunentfernern wie dem bakteriellen Motilitätsprotein Flagellin14 oder endogenen Pflanzenelicitor-Proteinen (AtPeps)16verwendet werden, es sollte jedoch beachtet werden, dass die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen je nach Elicitor21. Zusammen können ROS- und SGI-Assays für die schnelle und quantitative Bewertung früher und später PRR-vermittelter Reaktionen verwendet werden.

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Protokoll

1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung

  1. Pflanzenwachstum und -wartung.
    1. Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.
      ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu dienen.
    2. Säen Sie Samen auf dem Boden und keimen unter Standard-Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 mE/m2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit).
    3. Nach ca. 7 Tagen verwenden Sie Zangen, um einzelne Sämlinge in neue Töpfe zu verpflanzen, die durch mindestens 4 cm voneinander getrennt sind, um eine vollständige Rosettenentwicklung zu ermöglichen. Transplantieren Sie 6-12 Sämlinge pro Genotyp und kehren Sie zu Standard-Kurztagesbedingungen zurück. Regelmäßig Wasser- und Düngepflanzen (1 g/L 20-20-20 Dünger alle 2 Wochen).
  2. Sammeln Sie Blattscheiben in 96-Well-Platten für die Erholung über Nacht.
    1. Nach 4-5 Wochen nach der Keimung (Abbildung 1A), verwenden Sie einen scharfen 4 mm Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Pflanze zu entfernen, die Mittelvene zu vermeiden und darauf zu achten, die Verwundung zu begrenzen (Abbildung 1B). Legen Sie Blattscheiben in eine unbenutzte 96-Well-Luminometerplatte, die 100 l ddH2O enthält, wobei die adaxiale Seite nach oben zeigt, um eine Austrocknung zu verhindern22 (Abbildung 1C). Wenn Sie mehrere Elicitoren bewerten, entfernen Sie 1 Blattscheibe aus dem gleichen Blatt für jede Elicitor-Behandlung.
      HINWEIS: Probenblätter, die vollständig erweitert sind, von der Spitze der Rosette an dritter bis fünfter Stelle und ungefähr die gleiche Größe und das gleiche Alter aufweisen, um die Variabilität zu begrenzen. Wenn möglich, schneiden Blattscheiben mit einer Rasierklinge vor der nächtlichen Erholung in die Hälfte, da dies die Oberfläche erhöht, die der Elicitorlösung ausgesetzt ist23.
    2. Erholen Sie sich über Nacht bei Raumtemperatur, um die Interferenz von ROS zu verhindern, die durch Wundung während der Blattscheibensammlung entsteht. Abdeckungsplatten mit Deckel, um Verdunstung zu verhindern.
  3. Führen Sie die Elicitor-Behandlung durch und messen Sie die ROS-Produktion.
    1. Programmieren Sie den Plattenleser vor dem Hinzufügen der Reaktionslösung, da dies die Zeit zwischen der ROS-Burst-Initiierung und den ersten aufgezeichneten Messungen reduziert. Verwenden Sie eine kommerzielle Software, die für den Plattenleser geeignet ist. In unserem Fall (siehe Inhaltsverzeichnis) klicken Sie auf Einstellungen, und wählen Sie die LUM96-Patrone und den kinetischen Lesetyp aus. Klicken Sie auf die Kategorie "Bereich lesen", und ziehen Sie, um eine Teilmenge der Bohrungen oder die gesamte zu lesende Platte auszuwählen. Legen Sie unter der Registerkarte PMT und Optics die Integrationszeit auf 1.000 ms fest. Legen Sie unter der Registerkarte Timing die Gesamtlaufzeit auf 40-60 min und das Intervall auf 2 min. fest.
    2. Entfernen Sie Wasser aus jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette.
      HINWEIS: Punktieren Sie keine Blattscheiben, da dies zu Wundbelastung führen und zu variableren ROS-Ausgängen führen kann.
    3. Bereiten Sie eine Reaktionslösung vor, die 100 'M Luminol, 10 'g/ml HRP und die gewünschte Konzentration von Elicitor (z. B. elf18 bei 1 nM, 10 nM, 100 nM oder 1.000 nM) in sterilem ddH2O mit 10 ml Lösung für eine 96-Well-Platte enthält.
      HINWEIS: Lyophilisierte Peptide in sterilenH2O in bindungsarmen Schläuchen auflösen, um einen 10 mM-Bestand herzustellen, in Flüssig N2zu blitzen und bei -80 °C aufzubewahren. Wenn Sie einsatzbereit sind, verdünnen Sie die Vorräte in sterilen H2O, um einen Arbeitsbestand von 100 m zu erzeugen und bei -20 °C aufzubewahren.
    4. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 100 l des Reaktionsgemisches an jeden Brunnen zu verteilen, wobei die Lösung allen Blattscheiben der gleichen Behandlung zur gleichen Zeit hinzugefügt wird22. Schließen Sie eine Kontrollreaktion (kein Elicitor) für jeden Genotyp ein, um die basalen ROS-Spiegel in Ermangelung einer Auslösung zu bewerten. Messen Sie sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum mit einem Mikroplattenleser.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Reaktionslösung bei schwachem Licht vor und wenden Sie sie auf, da Luminol und HRP lichtempfindliche Reagenzien sind. Reagenzien auf Eis oder bei -20°C aufbewahren, sofern nicht verwendet.
    5. Messen Sie die Lichtemission mit einer Integrationszeit von 1.000 ms in 2 minuten Intervallen über einen Zeitraum von 40-60 min in einem Mikroplattenleser, um den dynamischen oxidativen Burst zu erfassen (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Verwenden Sie eine längere Integrationszeit, um die Assayempfindlichkeit11zu verbessern und gleichzeitig sicherzustellen, dass alle Proben in einer 96-Well-Platte innerhalb eines Intervalls gemessen werden können.
  4. Dateninterpretation.
    1. Verwenden Sie für jeden Genotyp eine Tabellenkalkulationsanwendung, um die durchschnittliche Photonenanzahl und den Standardfehler zu jedem Zeitpunkt zu berechnen, und zeigen Sie die ROS-Produktion als Funktion der Zeit mithilfe eines Streudiagramms an.
      figure-protocol-1
      Wo t = jeder Zeitpunkt
    2. Alternativ können Sie die Photonenanzahl für jede Blattscheibe summieren und den Durchschnitt dieser Werte für jeden Genotyp mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder einer Box- und Schnurrhaardiagramm darstellen.
      figure-protocol-2

2. Seedling Growth Inhibition Assay

  1. Sterilisieren Sie Samen und säen Sie auf Murashige und Skoog (MS) Teller.
    1. Bereiten Sie sterile Halbstärke (0,5x) MS medium (2,16 g/L) mit 0,8% Agar [w/v] vor. Gießen Sie Medien in Platten (90 x 15 mm) in einer laminaren Durchflusshaube.
    2. Sterilisieren Sie ca. 100 Samen in einem Mikrozentrifugenrohr, indem Sie mit 1 ml 70% Ethanol für 2 min waschen und durch Aspiration entfernen. 1 ml 40% Bleichmittel hinzufügen und bei Raumtemperatur 1 ml 40% Bleichmittel und sanft eskhereintigen Gestein. Bleichmittel durch Aspiration entfernen und dreimal in 1 ml sterilem Wasser für 5 min waschen. Resuspend in 1 ml sterilen 0,1% Agar.
      HINWEIS: Alternativ verwenden Sie ein Chlorgassamen-Sterilisationsprotokoll24.
    3. Säen Sie ca. 100 Samen pro Genotyp auf MS-Agarplatten mit einer Pipette und versiegeln Sie mit Mikroporenband in einer laminaren Durchflusshaube.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Samen in unmittelbarer Nähe zu platzieren, da dies die Transplantation von Sämlingen später schwierig macht.
    4. Satifizieren Sie Samen, indem Sie Teller bei 4 °C (kein Licht) für 3-4 Tage, um die Keimung zu synchronisieren (Abbildung 2A).
  2. Transplantieren Sie Sämlinge in 48-Well-Platten, die Immun-Entsende-Peptide enthalten.
    1. Nach der Schichtung die Platten unter kurzen Tagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) für 3-4 Tage zum Licht bewegen, um eine Keimung zu ermöglichen.
    2. In einer laminaren Durchflusshaube Peptidverdünnungen (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM und 1.000 nM) in sterilen 0,5x MS-Flüssigkeitsmedien mit 1% Saccharose [w/v] zubereiten, wobei 25 ml MS für jede 48-Well-Platte verwendet werden. Bereiten Sie Platten vor, indem Sie 500 l MS flüssiges Medium oder MS-Medium mit Peptiden pro Brunnen pipetieren. Falls verfügbar, verwenden Sie einen Repeat Pipettor für die Plattenvorbereitung, um den Prozess zu beschleunigen.
      HINWEIS: Für jeden Genotyp, wachsen Sämlinge in MS ohne Elicitor, um inhärente Unterschiede im Sämlingwachstum zu berücksichtigen.
    3. Mit sterilen Zangen sorgfältig verpflanzn einen Sämling zu jedem Brunnen der gleichen Größe und Alter, um sicherzustellen, dass es keine Schäden an der Sämling oder Bruch der Wurzel und dass die Wurzel in medienversinken. Für jeden Genotyp mindestens 6-8 Sämlinge in jede Peptidverdünnung transplantieren (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Transplantieren Sie Sämlinge nach 4 Tagen nach der Keimung, da Kurzwurzeln leichter zu manipulieren sind und ältere Sämlinge weniger optimale Ergebnisse liefern können.
    4. Platten mit Mikroporenband versiegeln und unter normalen Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) wieder ans Licht rücken. Sämlinge 8-12 Tage wachsen lassen.
  3. Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung.
    1. Sämlinge vorsichtig von 48-Well-Platten entfernen und trocknen, indem Sie auf Papiertuch dabben. Gewichten Sie Sämlinge auf einer analytischen Skala und zeichnen Sie Werte auf. Verwenden Sie, falls verfügbar, eine analyseskala mit USB-Ausgang, um neue Gewichtungswerte in einer Kalkulationstabelle aufzuzeichnen. Bevor Sie Sämlinge wiegen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell darzustellen (Abbildung 2C).
    2. Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung von mit Elicitor behandelten Sämlingen im Vergleich zu Sämlingen, die nur in MS angebaut werden (Abbildung 2D), wie folgt:
      figure-protocol-3
    3. Zeichnen Sie Daten mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder mithilfe eines Box- und Whisker-Plots, um die interexperimentelle Varianz besser anzuzeigen.

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Ergebnisse

Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) von...

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Diskussion

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.

Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unterscheide...

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Danksagungen

Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20-20-20 DüngerPflanzenprod105291 g/l in Wasser mischen und alle 2 Wochen auf die Pflanzen auftragen, um ein optimales Wachstum zu erzielen.
4 mm Biopsie-StanzeMedical Mart232-33-34-PEs kann auch ein Korkbohrer-Set mit einer Auflagefläche von 0,125 cm^2 verwendet werden.
Sterile 48-Well-Platten mit DeckelSigma-AldrichCLS3548
Analysenwaage mit Draft SheidVWRVWR-225ACStandard-Analysewaage kann für Wachstumsinibitionsassays verwendet werden, eine direkte Computerausgabe ist jedoch optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Mehrkanalpipette (30-300 μl)Sartorius725240Jede Mehrkanalpipette kann verwendet werden, bei Bedarf auch eine einzelne Pipette.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Lagern Sie 10 mM Stammpeptid bei -80C in Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Nach dem Auftauen 100 μM Arbeitsmaterial bei -20 °C lagern.
PinzetteFisher Scientific22-327379
MeerrettichperoxidaseSigma-AldrichP6782In reinem Wasser auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.
LuminolSigma-AldrichA8511In DMSO auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.
Murisage und Skoog BasalsalzeCedarlane LabsMSP09-100LTbei 4C lagern.
ErdeSunGrow HorticultureSunshine Mix #1Für den Anbau von Arabidopsis können auch andere Bodenarten verwendet werden. Beim Befüllen der Töpfe mit Wasser mischen.
SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplatten-Reader mit LUM-ModulMolekulare GeräteMuss ein Angebot anfordernFür diese Assays kann jeder Platten-Reader verwendet werden, der Lumineszenz nachweisen kann.
SaccharoseSigma-AldrichS0389-1KGBei Raumtemperatur lagern.
96-Well-Platten aus weißem PolystyrolFisher Scientific07-200-589
Jede

Referenzen

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Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana
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