Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.
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Methodenartikel
Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.
Einleitung
Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion ex....
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Protokoll
1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung
- Pflanzenwachstum und -wartung.
- Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.
ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu dienen. - Säen Sie Samen auf dem Boden und keimen unter Standard-Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 mE/m2/s Lichtintensität u....
- Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.
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Ergebnisse
Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) von.......
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Diskussion
Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.
Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unterscheide.......
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Danksagungen
Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20-20-20 Dünger | Pflanzenprod | 10529 | 1 g/l in Wasser mischen und alle 2 Wochen auf die Pflanzen auftragen, um ein optimales Wachstum zu erzielen. |
| 4 mm Biopsie-Stanze | Medical Mart | 232-33-34-P | Es kann auch ein Korkbohrer-Set mit einer Auflagefläche von 0,125 cm^2 verwendet werden. |
| Sterile 48-Well-Platten mit Deckel | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analysenwaage mit Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Standard-Analysewaage kann für Wachstumsinibitionsassays verwendet werden, eine direkte Computerausgabe ist jedoch optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Mehrkanalpipette (30-300 μl) | Sartorius | 725240 | Jede Mehrkanalpipette kann verwendet werden, bei Bedarf auch eine einzelne Pipette. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Lagern Sie 10 mM Stammpeptid bei -80C in Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Nach dem Auftauen 100 μM Arbeitsmaterial bei -20 °C lagern. |
| Pinzette | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Meerrettichperoxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | In reinem Wasser auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | In DMSO auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern. |
| Murisage und Skoog Basalsalze | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | bei 4C lagern. |
| Erde | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Für den Anbau von Arabidopsis können auch andere Bodenarten verwendet werden. Beim Befüllen der Töpfe mit Wasser mischen. |
| SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplatten-Reader mit LUM-Modul | Molekulare Geräte | Muss ein Angebot anfordern | Für diese Assays kann jeder Platten-Reader verwendet werden, der Lumineszenz nachweisen kann. |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Bei Raumtemperatur lagern. |
| 96-Well-Platten aus weißem Polystyrol | Fisher Scientific | 07-200-589 |
Referenzen
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Per....
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Nachdrucke und Genehmigungen
