Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung

Gentherapie moduliert spezifische Genexpression um ein therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Zahlreiche Werkzeuge für gen-Modulation entdeckt und untersucht, einschließlich der Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) mit Oligonukleotiden (z. B. kurze interferierende RNA (SiRNA)^1,2, MicroRNA (MiRNA)^3,4 ), DNA Plasmide^5,6, Nukleasen (z. B. Zinkfinger, TALENS)^7,8und CRISPR/Cas9 Systeme^9,10. Während jedes Werkzeug Wirkmechanismus unterscheidet, müssen alle Werkzeuge der Zelle Zytoplasma oder Nucleus aktiv sein erreichen. So, während diese Werkzeuge induzieren signifikanten Effekt Modulation der gen-Expression in vitro nachgewiesen haben, leidet die in-vivo Wirksamkeit extrazellulären und intrazellulären Hindernisse. Da die Werkzeuge der biologischen Ursprungs sind, gibt es viele Enzyme und Abfertigungssysteme in unserem Körper, die Fähigkeit zu degradieren oder fremde Moleküle¹¹zu entfernen. Auch in dem Fall, dass die Werkzeuge die Zielzelle erreichen leiden sie Endozytose; ein Modus der zelluläre Aufnahme, die kapselt und fallen die Werkzeuge im sauren Magen-wie Bläschen, die verschlechtern oder die Werkzeuge aus der Zelle zu vertreiben. In der Tat haben Studien gezeigt, dass Lipid Nanopartikel Endocytosed über Macropinocytosis, von denen etwa 70 % der SiRNA aus den Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aufnahme^12,13exocytosed sind. Der Großteil der verbleibenden SiRNA sind durch die lysosomalen Pathway abgebaut und letztlich erreichen nur 1-2 % der SiRNA, die zunächst die Zelle mit den Nanopartikeln betritt Endosomal Flucht potenziell RNAi^{13,14 unterziehen} .

Wir haben vor kurzem Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) entwickelt, die einen SiRNA-geladenen Kern bestehend aus porösem Silizium-Nanopartikeln und Fusogenic Lipid Schale¹⁵haben. Die F-pSiNPs präsentieren drei große Vorteile gegenüber anderen konventionellen Oligonukleotid-Delivery-Systeme: (1) ein Fusogenic Lipid Beschichtung, wodurch die Teilchen zu umgehen Endozytose und liefern die gesamte Nutzlast direkt in das Zytoplasma der Zelle (im Gegensatz zu den 1 %-2 % erzielt durch Endocytosed Partikel^13,14) (Abbildung 1). (2) hohe Masse geladen von SiRNA in der pSiNPs (> 20 Gew.-% im Vergleich zu 1-15 Gew.-% von herkömmlichen Systemen)¹⁵, die schnell im Zytoplasma verschlechtern (Sobald die Core-Partikel die Lipid-Beschichtung über Fusogenic Aufnahme Schuppen), lassen Sie die SiRNA; (3) gezielt Peptid Konjugation für selektive Homing, Zelltypen in-vivo gewünscht.

Die F-pSiNP-System hat bedeutende Gen-silencing Wirksamkeit gezeigt (> 95 % in-vitro-; > 80 % in-vivo) und anschließende therapeutische Wirkung in einem tödlichen Mausmodell der S. Aureus -Pneumonie; die Ergebnisse waren vorher¹⁵veröffentlicht. Allerdings erfordert die komplexe Struktur des F-pSiNP Systems Feingefühl und fein abgestimmte Optimierung, homogen und beständig Nanopartikel zu generieren. So soll der Zweck dieser Arbeit eine gründliche Protokoll sowie Optimierung von Strategien für die Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von F-pSiNPs in gezielte Bereitstellung von SiRNAs für potente Gen-Silencing-Effekt verwendet werden.

1. Zusammenfassung der poröse Silizium-Nanopartikeln (pSINPs)

Achtung: Seien Sie immer vorsichtig, beim Arbeiten mit Fluorwasserstoffsäure (HF). Folgen Sie alle Reiseführer in Sicherheit nach seiner Sicherheitsdatenblatt (SDB) zu, behandeln Sie keine HF-haltigen Chemikalien in einer Dampfhaube und tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA, doppelte Handschuhe mit Butyl Handschuhe auf der Außenseite, Butyl-Schürze mit Laborkittel unter Gesicht Schild mit Schutzbrille unter). Alle Universitäten und Forschungs- und Entwicklungslabors erfordern spezifische Schulungen zu HF-Sicherheit vor dem Gebrauch. Versuchen Sie nicht, mit HF ohne Pre-Approval von Ihrem lokalen Labor Sicherheitskoordinator zu arbeiten, da zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen, die hier nicht beschrieben erforderlich sind.

1. Vorbereitung der Radierung Lösungen
   1. Um die 3:1 HF-Lösung für Radierung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.4), füllen Sie eine Plastik machen Schloss Zylinder mit wässrigen 48 % HF 30 mL und 10 mL absolutes Ethanol (EtOH). Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
   2. Zu einem 01:29 Schloss HF-Lösung für Lift-Off (verwendet in Schritt 1.5), füllen Sie eine Plastik Zylinder mit 1 mL wässrige 48 % HF und 29 mL absolutes Ethanol. Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
   3. Machen die 1 M KOH-Lösung in 10 % EtOH für überschüssige pSi Auflösung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.5).
2. Einrichten der Etch-Zelle
   1. In einer Teflon Ätzen Zelle mit 8,6 cm² Ätzen gut (Bereich ergibt sich durch die Messung des Durchmessers der Siliziumoberfläche für Radierung innerhalb des o-Rings und Berechnung der Fläche a = πr²), legen Sie in absteigender Reihenfolge (Abbildung 2a): (1) die Teflon Zelle oben; (2) ein o-Ring; (3) ein Viertel Stück der Einkristall (1 0 0) - orientierten p ++ - Typ Silizium-Wafer Vierteln (mit einem Diamantschleifer); (4) Alu-Folie; und (5) die Teflon-Zelle mit Schrauben festgezogen sanft auslaufen zu verhindern.
   2. Füllen Sie den Brunnen mit EtOH. Nehmen Sie ein Tuch und legen Sie in den Spalt zwischen Teflon Zelle oben und unten. Wenn das Tuch trocken nach dem entfernen ist, ist die Ätzen Zelle versiegelt. Wenn nass, die Zelle ist undicht, und ziehen Sie weiter die Schrauben bis versiegelt.
3. Elektropolieren der Silizium-wafer
   1. Bringen Sie die montierte Etch-Zelle in einer Dampfhaube.
   2. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 3:1-HF-Lösung.
   3. Verbinden Sie die Plusleitung mit Aluminiumfolie (Elektrode) aus der Zelle Ätzen und verbinden Sie das negative Kabel der Platin Spule (Gegenelektrode) eingebettet in der 3:1 HF-Lösung der nächsten Zelle Etch für den Schaltkreis (Abb. 2 b).
   4. Führen Sie eine konstanten Strom bei 50 mA cm^-2 für 60 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
   5. Auflösen entfernt die geätzte Schicht füllen Sie die nun langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
   6. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
4. Elektrochemisch Ätzen poröse Schichten in Silizium-wafer
   1. Führen Sie einen Wechselstrom einer quadratischen Wellenform mit niedrigeren Current density von 50 mA/cm² für 0,6 s und hohe Stromdichte von 400 mA/cm² für 0,36 s für 500 Zyklen wiederholt.
   2. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
5. Heben Sie die poröse Schicht aus dem Siliziumwafer
   1. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 01:29 HF-Lösung.
   2. Führen Sie eine konstante von 3,7 mA/cm² für 250 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen. Die pSi-Schicht möglicherweise sichtbare Wellen angibt Loslösung von kristallinen Silizium-Wafer. Vorsichtig waschen Sie, die 01:29 HF-Lösung und spülen Sie mit EtOH dreimal, dann mit Wasser dreimal.
   3. Mit einer Pipettenspitze, fest den Umfang der pSi-Ebene für die vollständige Ablösung zu knacken. Mit EtOH, Ätzen Sie sammeln die pSi-Fragmente (Chips) aus Teflon Zelle in ein mit einem Gewicht von Boot. Übertragen Sie die Chips auf eine Glasflasche. Die pSi-Chips können für mehr als 6 Monaten für die Lagerung bei Raumtemperatur in EtOH gehalten werden.
   4. Lösen sich entfernt alle verbleibenden poröse Silizium auf dem Wafer durch Ausfüllen des Brunnens langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
   5. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,5, bis die gesamte Waferdicke geätzt wurden.
6. Beschallen poröse Schichten für Nanopartikel Bildung
   1. Das Lösungsmittel der Glasfläschchen mit pSi-Chips von EtOH zu 2 mL VE-Wasser zu ersetzen.
   2. Fest schließen Sie den Deckel und Dichtung mit Parafilm.
   3. Ort das Glas in einem Sonikator Bad Fläschchen und ausgesetzt, so dass das Volumen der pSi-Chips unter der Oberfläche vollständig eingetaucht sind.
   4. Für 12 h bei 35 kHz und HF-Leistung 48W beschallen. Um erhebliche Wasserverlust bei Beschallung zu vermeiden, legen Sie eine volumetrische Flasche gefüllt mit Wasser, invertiert, so dass die Öffnung des Kolbens die Oberfläche des Wasserbades berührt.
   5. Legen Sie die Glasflasche auf eine Ebene Fläche für 1 h erlauben größere Partikel auf dem Boden zu begleichen. Den Überstand mit einer Pipette zu sammeln; die Suspension enthält unter 100 nm pSiNPs.

2. Vorbereitung des Fusogenic-Lipid-film

1. Vorbereitung der Lipid-Stammlösungen
   1. Machen Sie unter einem Abzug 10 mg/mL Bestände von Lipiden durch feuchtigkeitsspendende DMPC, DSPE-PEG-MAL und DOTAP Lipide in Chloroform. Diese Stammlösungen können bis zu 6 Monaten unter engen Parafilm Siegel bei-20 ° C aufbewahrt werden.
2. Die Fusogenic-Lipid-Film zu machen
   Hinweis: Die Fusogenic Zusammensetzung der Lipide, DMPC, DSPE-PEG und DOTAP, das molare Verhältnis von 76.2:3.8:20 und 96.2:3.8:0, bzw. erfolgt auf.
   1. Mischen Sie in eine Glasflasche 72,55 μL DMPC, 15,16 μL der DSPE-PEG und 19.63 μL des DOTAP durch pipettieren.
   2. Optional: Für fluoreszierende Kennzeichnung der Lipid-Beschichtung, zusätzlich schreibe 20 µL DiI in einer Konzentration von 1 mg/mL EtOH aufgelöst.
   3. Legen Sie das Fläschchen in einer Abzugshaube mit einer losen Kappe zu Chloroform über Nacht verdunsten zu lassen. Der getrocknete Film wird eine trübe schwer gelartige Substanz an der Unterseite der Flasche sein.

(3) be- und Abdichtung von SiRNA in pSiNPs

1. Vorbereitung von Kalzium-Chlorid Lager laden
   1. Auflösen von 1,11 g CaCl₂ in 10 mL RNAse-freies Wasser, eine 2 M CaCl₂ -Lösung zu machen.
   2. Zentrifugieren Sie die Lösung bei > 10.000 x g für 1 min zum begleichen der Aggregate und den Überstand mit einer Pipette zu sammeln. Alternativ filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-filter
2. Vorbereitung der SiRNA Lager laden
   1. Hydrat oder die SiRNA bis 150 µM in RNAse-freies Wasser zu verdünnen. Diese Stammlösung möglicherweise regelmÄÑig und für mindestens 30 Tage bei-20 ° C eingefroren aufbewahrt, angesichts der Tatsache, dass es nicht häufigen Frost-Tau-Wechseln unterzogen.
3. Laden die SiRNA in pSiNPs mit Calciumchlorid
   1. Bereiten Sie eine eisgekühlten Beschallung Bad.
   2. Weniger als 15 min Ultraschall, sanft Pipette 150 µL von SiRNA und 700 µL 2 M CaCl₂ in 150 µL des pSiNP. Achten Sie darauf, den Deckel des Microcentrifuge Schlauch für Gaserzeugung offen lassen.
   3. Entfernen Sie die Röhrchen mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs aus der Sonikator.

(4) Beschichtung SiRNA beladenen pSiNPs mit Fusogenic Lipide

1. Vorbereitung der Liposomen-Extrusion-Kit
   1. Füllen Sie einen großen Becher mit VE-Wasser. Einweichen 1 Polycarbonat Membran (200 nm Poren), und 4 Filter unterstützt durch auf Wasseroberfläche schwimmt. Montieren Sie das Liposomen-Extrusion-Kit, indem Sie nach Anweisungen des Herstellers
2. Feuchtigkeitsspendende Lipid-Film mit SiRNA geladen pSiNps
   1. Die getrockneten Lipid-Film in der Glasflasche mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs gewonnenen Schritt 3.3.3 Hydrat. Pipette bis alle Lipide Film haben vom Boden des Röhrchens gehoben und in eine trübe homogene Lösung gemischt haben.
   2. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in der Glasflasche, und legen Sie das Fläschchen auf einer Heizplatte, die Partikel auf 40 ° C (oder hoch genug über die Lipide Phase Umwandlungstemperatur weiterhin die Lipide in der mehr fluidische Flüssigkristall-Phase) zu heizen zwar magnetisch Rühren die Lösung für 20 Minuten.
3. Extrudieren der Lipid-beschichtete pSiNPs für Steuerung
   1. Aspirieren Sie 1 mL der Lipid-beschichtete pSiNP-SiRNA-Lösung in der Extrusion Spritze. Legen Sie eine leere Spritze auf der einen Seite des Extruders und die gefüllte Spritze am anderen Ende.
   2. Beginnen Sie Extrusion, indem der Kolben langsam auf die Partikel aus einer Spritze durch die Polycarbonat-Membran und ineinander zu schieben. Wiederholen Sie 20 Mal. Wenn der Kolben klemmt, können der Filter und die Membrane verstopft werden. Zerlegen des Extruders und ersetzen Sie die Membrane und Filter unterstützt. Wenn das Problem weiterhin besteht, verdünnen Sie die Partikel bis Verstopfung überschaubar ist.
   3. Sammeln Sie die extrudierten Partikel zu einem Microcentrifuge Schlauch.

(5) Konjugation von targeting Peptide

1. Konjugation targeting Peptid Lipid-Beschichtung
   1. Bereiten Sie die Peptid-Aktie mit einer 1 mg/mL Peptid-Konzentration in RNAse-freies Wasser.
   2. Im Microcentrifuge Schlauch mit Fusogenic hinzufügen Lipid-beschichteten pSiNPs, 100 µL 1 mg/mL Peptid Lager und Pipettieren sanft. Halten Sie das Rohr statische bei Raumtemperatur für 20 min (Alternativ > 2 h bei 4 ° C).
   3. Um überschüssige Peptid oder SiRNA und anderen Hilfsstoffen zu entfernen, waschen Sie in einem 30 kDa zentrifugale Filter von Spinnen bei 5.000 X g bei 25 ° C für 1 h Zentrifuge noch zweimal mit 1 mL PBS unter die gleiche Einstellung.
   4. Aufschwemmen der endgültigen Peptid konjugiert Fusogenic Lipid-beschichtete pSiNPs mit PBS-Puffer auf die gewünschte Konzentration. Die Partikel können jetzt regelmÄÑig und gefrorenen bei-80 ° C für die Lagerung von mindestens 30 Tage sein.

Eine gelungene Synthese aus Fusogenic pSiNPs sollte eine homogene, etwas undurchsichtige Lösung (Abbildung 3a) produzieren. Versagen, das Verhältnis und die Konzentration von pSiNPs zu optimieren: SiRNA: CaCl2 Aggregation nach dem Laden (Abb. 3 b) führen kann. Wie die Partikel durch 200 nm Membranen extrudiert werden, sollte die hydrodynamische Durchmesser von der Fusogenic pSiNPs DLS gemessen ca. 200 nm, und die durchschnittliche Zeta-Potential ca. + 7 mV wie in Abbildung 4dargestellt. Nach Oberflächenmodifikation mit targeting Peptide, der Gesamtdurchmesser sollte erhöht werden, um unter 230 nm und die durchschnittliche Zeta-Potential sank hinunter -3,4 mV15. Große Abweichungen von der Extrusion Größe ist bezeichnend für fehlgeschlagene Extrusion (dPartikel >> dExtrusion), oder Fehler beim Laden (dPartikel << dExtrusion). Aggregationen möglicherweise auch mit DLS quantifiziert werden. Darüber hinaus müssen die eingefrorenen aliquoten aufgetaut werden, nur einmal, als wiederholte Frost-Tau-Zyklen stören die Lipidmembran und intraparticular Fusion und Aggregation (Abbildung 4). Wie Abbildung 4a zeigt, kann Fusogenic pSiNPs für 30 Tage gespeichert und aufgetaut, ohne dass es zu strukturelle Veränderungen. Jedoch wiederholt Frost-Tau-Zyklen von einem einzigen aliquoten verursachen schwere Aggregation (d >> 1.000 nm) und innerhalb von 4 Tagen des täglichen Zyklus (Abbildung 4 b), so ist es ratsam, dass die Partikel regelmÄÑig, Einweg-Bände werden.

Fusion kann bestätigt werden, durch Kennzeichnung der Fusogenic Lipide mit lipophilen DiI (Schritt 2.2.2), und beobachten die in-vitro-Lokalisierung mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Abbildung 1 d zeigt erfolgreiche Fusion, wo die Fusogenic pSiNP Lipide die DiI auf der Plasmamembran übertragen und sind unabhängig von Lysosomen lokalisiert. Erfolglose Fusion wird die DiI Lokalisierung innerhalb der Zelle Zytoplasma und NS1 mit Lysosomen (Abbildung 1 c) zeigen.

Abbildung 1: Fusogenic poröses Silizium Nanopartikel System (F-pSiNP). (ein) Schaltplan zeigt endocytic Aufnahme von konventionellen Nanopartikel und anschließende Endosomal Einklemmung. (b) Schaltplan zeigt Fusogenic Aufnahme der F-pSiNPs und der cytosolischen Nachlieferung der SiRNA-Nutzlast. (c) konfokale mikroskopische Bild eines CAOV-3-Zelle, die Endocytosed nicht Fusogenic pSiNPs hat, die mit DiI lipophile Farbstoff geladen wurden. CAOV-3 Zellen wurden gezüchtet um 80 % Zusammenfluss in einem 6-Platte, mit 10 µL von Nanopartikeln behandelt und bei 37 ° C in 5 % CO2 für 15 min inkubiert. Die Zellen wurden in 1 % Paraformaldehyd auf Objektträgern mit DAPI montiert werden fixiert, getrocknet und gehalten in der Dunkelheit bis konfokalen Mikroskopie untersucht. (D) konfokale mikroskopische Bild einer CAOV-3-Zelle, die Fusogenic pSiNPs aufgenommen hat, die mit DiI lipophile Farbstoff geladen wurden. Zellen wurden mit LysoTracker Green für 1 h bei 37 ° C in 5 % CO2 nach Herstellerangaben bereits gefärbt. Die Zellen wurden dann PBS dreimal gewaschen und mit 10 μL der DiI-geladenen Teilchen für 15 min behandelt wurden. Die Zellen wurden mit PBS dreimal gewaschen, um alle Partikel zu entfernen, die nicht aufgegriffen wurden, und die Brunnen waren gefüllt mit 1 mL PBS und sofort für das live Cell Imaging von konfokalen Mikroskopie genommen; DAPI steht für nukleare Fleck und Lysosomen für lysosomale Färbung von LysoTracker Green; Maßstabsleiste stellt 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Etch Zelle Setup. (ein) Schaltplan zeigt Ätzen Zellbestandteile und Montageauftrag; und (b) Darstellung der Setup für elektrochemische Ätzen von Silizium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Foto des Endprodukts F-pSiNP. (ein) erfolgreiche Synthese zeigt homogene und trübe Lösung; (b) erfolglos Synthese zeigt Aggregation der Partikel (gelb). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: wiederholte Frost-Tau-Zyklus von Fusogenic pSiNPs verursachen Aggregation. (ein) durchschnittliche Größe und Zeta-Potential von Fusogenic pSiNPs bleibt für 30 Tage stabil, wenn aufgetaut, sobald nach dem Einfrieren; (b) durchschnittliche Größe und Zeta-Potential von Fusogenic pSiNPs zeigt Zeichen der Aggregation und Verlust der strukturellen Integrität innerhalb von 4 Tagen nach täglich Frost-Tau-Zyklen durchlaufen. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (n = 5). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Diagramm der poröse Silizium-Nanopartikel-Synthese. Schaltplan zeigt elektrochemische Ätzen von Silizium-Wafer (Schritt 1.4), Lift-off der porösen Schicht (Schritt 1.5), Beschallung der porösen Schicht in Partikel und Sammlung von porösem Silizium-Nanopartikeln (Schritt 1.6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

MJS ist eine wissenschaftliche Gründer der Spinnaker Biosciences, Inc., und verfügt über eine Kapitalbeteiligung an der Gesellschaft.  Dieser Zuschuss für Interessenkonflikt Management basierend auf den gesamten Umfang des Projekts und der potenzielle Nutzen für Spinnaker Biosciences, Inc., identifiziert wurde zwar die Forschungsergebnisse, die in dieser besonderen Veröffentlichung enthaltenen nicht unbedingt beziehen sich auf die Interessen der Spinnaker Biosciences, Inc. Die Bedingungen dieser Vereinbarung haben überprüft und genehmigt von der University of California, San Diego gemäß ihrer Interessenkonflikt Politik wurde. Andere Autoren haben nichts preisgeben.