Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese

Summary

Der hier vorgestellte Multi-Locus Variable-number Tandem-Repeat Analysis (MLVA)-Assay ermöglicht eine kostengünstige, robuste und tragbare hochauflösende Genotypisierung des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri. Ausgehend von reinen Kulturen verwendet der Assay Multiplex-PCR- und Kapillarelektrophorese, um zehn Loci MLVA-Profile für nachgelagerte Anwendungen zu erstellen.

Abstract

Yersinia ruckeri ist ein wichtiger Erreger von Zuchtsalmoniden weltweit, aber einfache Werkzeuge, die für epizootiologische Untersuchungen (Infektionsverfolgung, etc.) dieses Bakteriums geeignet sind, haben gefehlt. Ein Multi-Locus-System zur Variablenzahl (MLVA) wurde daher als leicht zugängliches und eindeutiges Werkzeug zur hochauflösenden Genotypisierung von wiedergewonnenen Isolaten entwickelt. Für den hier vorgestellten MLVA-Assay wird DNA aus kultivierten Y. ruckeri Proben extrahiert, indem Bakterienzellen in Wasser gekocht werden, gefolgt von der Verwendung von Überstand als Vorlage für PCR. Primer-Paare, die auf zehn Variable-Number Tandem-Repeat (VNTR) loci abzielen, die im gesamten Y. ruckeri-Genom durchsetzt sind, sind gleichmäßig auf zwei fünfplexe PCR-Reaktionen verteilt, die unter identischen Zyklusbedingungen laufen. Vorwärtsprimer sind mit einem der drei fluoreszierenden Farbstoffe gekennzeichnet. Nach Amplicon-Bestätigung durch Gelelektrophorese werden PCR-Produkte verdünnt und einer kapillaren Elektrophorese unterzogen. Aus den resultierenden Elektropherogrammprofilen werden Spitzen, die die einzelnen VNTR-Loci darstellen, größenmäßig bezeichnet und zur Berechnung der VNTR-Wiederholungszahlen in Silico verwendet. Daraus resultierende zehnstellige MLVA-Profile werden dann verwendet, um minimale Spannbäume zu generieren, die eine epizootiologische Auswertung durch Clusteranalyse ermöglichen. Die hochportablen Ausgabedaten in Form von numerischen MLVA-Profilen können schnell über Labore hinweg verglichen und in einen raumzeitlichen Kontext gestellt werden. Das gesamte Verfahren von der Kulturkolonie bis zur epizootiologischen Bewertung kann für bis zu 48 Y. ruckeri Isolate innerhalb eines einzigen Arbeitstages abgeschlossen werden.

Introduction

Yersinia ruckeri, ein gramnegatives Bakterium und Mitglied der Familie der Yersiniaceae, verursacht Yersiniose bei Zuchtlachsfischen weltweit¹. Es wird leicht von infizierten Fischen durch Anbau auf vielen Arten von Agar-Medien diagnostiziert, aber bis vor kurzem war wenig über die Populationsstruktur und Epizootiologie von Y. ruckeri auf der ganzen Welt und in verschiedenen Lebensräumen (Wirtsarten, etc.) bekannt. Bestehende Serotypisierungssysteme für Y. ruckeri sind inkonsistent, haben keine gegenseitige Kompatibilität und bieten eine geringe epidemiologische Auflösung. Einige molekulare Studien am Bakterium wurden durchgeführt, wobei Techniken wie Multilocus-Sequenztypisierung (MLST), Gepulste Gelelektrophorese (PFGE) oder Ganzgenomsequenzanalyse (WGS)^{2,3,4 ,5}. MLST bietet jedoch keine ausreichend hohe Auflösung für die routinemäßige Infektionsverfolgung, während PFGE arbeitslastig ist und Ergebnisse liefert, die nicht ohne weiteres über Labors hinweg tragbar sind. Während die WGS-Analyse eine nahezu endgültige Lösung bringen würde, würde die Einrichtung und Durchführung solcher Analysen technische und bioinformatische Fähigkeiten voraussetzungen, die noch auf eine relativ kleine Anzahl von Laboratorien beschränkt bleiben.

Die Multi-Locus-Variablen-Zahlen-Tandem-Wiederholungsanalyse (MLVA) stellt ein einfaches und leicht zugängliches molekulares Typisierungswerkzeug dar, das in einigen Fällen eine genetische Lösung bietet, die fast der der WGS-Analyse^6,7entspricht. Die Technik basiert auf der Wiederholungszahlvariation in ausgewählten VNTR-Loci (Variable Number Tandem-Repeat), was zu Ausgabedaten führt, die stark transportabel sind, wodurch der Vergleich von profilierten Isolaten mit Online-Datenbanken und über Labors hinweg einfach ist. Obwohl MLST nach wie vor der Goldstandard für die epidemiologische Typisierung vieler bakterieller Krankheitserreger ist, identifizieren immer mehr Studien eine signifikant höhere diskriminierende Leistung von MLVA^8,9,10. Mehrere Protokolle wurden auch veröffentlicht, die auf fischpathogene Bakterien abzielen, wie Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida und Renibacterium salmoninarum^{11,12, 13}.

Das hier vorgestellte MLVA-Protokoll von ten loci, das vor kurzem die Grundlage für eine umfangreiche Y. ruckeri Populationsstudie¹⁴bildete, beinhaltet die Extraktion von DNA aus agar-kultivierten Kolonien, Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese (CE), gefolgt von downstream in Silico-Anwendungen. Für jedes untersuchte Isolat werden zwei Multiplex-PCRs, die beide fünf fluoreszierend markierte Primerpaare (6FAM, NED oder VIC) enthalten, jeweils für einzelne VNTR-Regionen parallel unter identischen Bedingungen ausgeführt. Nach der Überprüfung von PCR-Amplicons durch Gelelektrophorese (GE) werden PCR-Produkte vor der CE-Analyse verdünnt, und Spitzen, die die jeweiligen VNTR-Loci darstellen, werden aus den resultierenden Elektropherogramm-Dateien größenmäßig bezeichnet. Zusammen mit ortsspezifischen Formeln, die kleinere, sequenzspezifische Abweichungen in CE-Migrationsmustern berücksichtigen, werden dann VNTR CE-Größenaufrufe zur Berechnung von VNTR-Wiederholungszahlen verwendet, die in zehnstellige MLVA-Profile verkettet sind. Diese werden als Eingabe für epizootiologische Auswertungen verwendet (z. B. durch Clusteranalyse in MST-Diagrammen (Minimum Spanning Tree).

Protocol

VORSICHT: Für das gesamte Protokoll ist es ratsam, alle Nasslabor-Verfahren steril mit Laborlacken, Einweghandschuhen und sterilen Reagenzien und Geräten durchzuführen. Es ist auch ratsam, PCR-Reaktionen in einem separaten Raum (Pre-PCR) vorzubereiten, der nicht für die PCR-Verstärkung und/oder handhabung von PCR-Produkten (Post-PCR) verwendet wird. Bewahren Sie alle Reagenzien gemäß der vom Hersteller empfohlenen Aufbewahren auf. Weitere Informationen zu den verwendeten Reagenzien, Geräten und Software finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Bakterielle Kultivierung und Extraktion genomischer DNA

1. Säen Sie Y. ruckeri reine Kulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ (die Autoren verwendeten 5% Rinderblut-Agar) und inkubieren bei 22 °C für 1-2 Tage, oder 15 °C für 3-4 Tage.
2. Von jeder Agarplatte eine einzelne repräsentative Kolonie mit einer Impfschleife pflücken und in 1,5 ml Zentrifugenrohre übertragen, die 50 l ultragereinigtes Wasser enthalten. Kurz aufsetzen, wirbeln und 7 min auf einem Heizblock bei 100 °C inkubieren.
3. Zentrifugieren Sie bei 16 000 x g für 3 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand vorsichtig in ein leeres 1,5 ml Zentrifugenrohr zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie den Überstand als Vorlagen-DNA verwenden oder bei -20 °C speichern, bis dieser Zeitpunkt.

2. Multiplex PCR-Setup und Cycling-Bedingungen

HINWEIS: Jede Multiplex-PCR-Reaktion (zwei pro Y. Ruckeri-Isolat) sollte 12,5 L des 2x Multiplex PCR Plus Master-Mix, 0,1 bis 0,2 m jedes geeigneten Primer-Paares (Tabelle1) und 3 l Vorlagen-DNA enthalten, angepasst auf ein endliegendes Reaktionsvolumen von 25 RNase-freies Wasser. Ziel ist es, die Lichteinwirkung der fluoreszierend gekennzeichneten Vorwärtsprimer auf ein Minimum zu beschränken (z. B. durch Umwickeln der Lagerrohre in Aluminiumfolie).

1. Für jeden der beiden Multiplex-PCR-Assays (Tabelle 1) bereiten Sie Mastermischungen wie oben beschrieben (ohne Vorlagen-DNA) entsprechend der Anzahl der Proben plus einer positiven und einer negativen Kontrolle vor. Lassen Sie außerdem ein Überschussvolumen von 10 % zu. Vortex mischt sich der vorbereitete Master sanft bei niedriger Geschwindigkeit.
2. Verteilen Sie 22 L jedes Master-Mix separat in einzelne Brunnen auf PCR-Streifen oder Platten, je nach Anzahl der Proben, und fügen Sie jedem Bohrkörper 3 L Schablone hinzu (für positive bzw. negative Kontrollen verwenden Sie DNA aus einem verifizierten Y. ruckeri und ultrarifiziertem Wasser). Kurz versiegeln und zentrifugieren.
3. Führen Sie alle Proben auf einem PCR-Thermocycler mit folgendem Programm aus: (i) 5 min bei 95 °C (ii) 30 Zyklen von 0,5 min bei 95 °C, 1,5 min bei 60 °C und 1 min bei 72 °C und (iii) 60 min bei 68 °C, gefolgt von einer Abkühlung auf 4 °C auf unbestimmte Zeit. Das Programm wird in weniger als 3 h abgeschlossen.

3. PCR Amplicon Bestätigung durch Gelelektrophorese

1. Nach den Empfehlungen des Herstellers, bereiten Sie ein Volumen von 1,5% (w/v) Agarose Gel in 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) Puffer geeignet für die Anzahl der PCR-Reaktionen getestet werden. Vor dem Gießen 5 l fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff pro 50 l Gellösung hinzufügen und mischen. Verwenden Sie Schalen und Kämme, je nach geeignetem Gießen, so dass eine angemessene Anzahl von Brunnen für DNA-Referenzleitern frei bleibt.
2. Tauchen Sie das Gel nach der Einstellung in den 1x TBE-Puffer in ein GE-System. Mischen Sie 5 l PCR-Produkt zusammen mit 2 l Ladefarbstoff und Transfer zu Gelbrunnen. Fügen Sie als Referenz 5 l DNA-Leiter in leere Brunnen ein.
3. Führen Sie das Gel mit 110 V pro 15 cm für ca. 1 h aus und verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungs-/Visualisierungssystem, um das Vorhandensein mehrerer (bis zu fünf) Bänder zu überprüfen, die PCR-Amplicons darstellen (siehe Beispiel in Abbildung 1). Entsorgen Sie das Gel. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die verbleibenden PCR-Produkte bei 4 °C bis zur weiteren Verarbeitung.

4. Kapillarelektrophorese Setup und Laufbedingungen

1. Nach Bestätigung von PCR-Amplicons, verdünnen PCR-Produkte 1:10 (v/v) in gereinigtem Wasser. Kurz versiegeln, mischen und zentrieren.
2. In einem Rauchschrank arbeiten, bereiten Sie ein Volumen des Master-Mix, bestehend aus 9 l Formamid und 0,5 l der Größe Standard pro PCR-Produkt (erlauben 10% Überschussvolumen). Vortex kurz und verteilen Sie 9,5 l in Brunnen auf einer Platte, die für das verfügbare CE-System geeignet ist, bevor Sie 0,5 l des verdünnten PCR-Produkts hinzufügen. Kurz versiegeln, mischen und zentrieren.
   ACHTUNG: Behandeln Sie mit Sorgfalt. Das Mischen von Formamid mit Wasser erzeugt Ameisensäure, die giftig ist.
3. Mit Einem PCR-Thermocycler denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 3 min vor dem Abkühlen auf 4 °C unbegrenzt. Zentrifugieren Sie kurz und laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes CE-System.
4. Fragmentanalyse CE mit Reagenzien entsprechend dem Gerät der Wahl und den folgenden Einstellungen: 60 °C; 5 s Injektionen bei 1,6 kV (32 V pro cm); 32 min Laufzeit bei 15 kV (300 V pro cm). Die CE-Fragmentanalyse von 24 Brunnen auf einer 24-Kapillare (50 cm) dauert in der Regel ca. 50 min.

5. VNTR-Größenaufruf, Wiederholungszählerberechnung und MLVA-Profilierung

HINWEIS: Schritt 5.1 beschreibt Y. ruckeri VNTR CE Größe Aufrufen aus Elektropherogramm-Dateien, mit der spezifischen Software in Tabelle der Materialienaufgeführt . Weitere Informationen und Zur Problembehandlung finden Sie im Softwarehandbuch. Für die Verwendung anderer Software konsultieren Sie die entsprechenden Handbücher.

1. Importieren Sie CE-Ergebnisdateien (zwei pro Y. ruckeri isolieren). Legen Sie die Analysemethode auf Microsatellite Default fest, und wählen Sie die entsprechende Produktauswahl unter Größenstandard aus, bevor Sie die Schaltfläche Analysieren drücken. Überprüfen Sie die korrekte Identifizierung von Größenstandardfragmenten über den Size Match Editor, und korrigieren Sie sichtbar fehlerhafte Zuordnungen.
   1. Nachdem Sie die zu lesenden Stichproben ausgewählt haben, drücken Sie die Schaltfläche Diagramme anzeigen, und drücken Sie Strg+A, um die Ansicht der Größentabellezu aktivieren. Halten Sie im oberen Bereich Strg gedrückt, während Sie auf die fünf Spitzen klicken, die die VNTR-Amplicons darstellen (zoomen Sie nach Bedarf).
      HINWEIS: Für jedes Multiplex-PCR-Produkt zeigt das Elektropherogramm fünf Spitzen, die auf die drei verwendeten Farbstoffe verteilt sind (siehe 5' Farbkennzeichnung von Vorwärtsprimern in Tabelle 1 und die beiden Beispiele in Abbildung 2).
   2. Drücken Sie Strg+G, um die Größentabellezu filtern, wobei nur die Merkmale der fünf hervorgehobenen Peaks angezeigt werden, und zeichnen Sie CE-Größenaufrufe für jeden VNTR-Lokus (mit Bezug auf Tabelle 1) für die nachgelagerte Anwendung auf.
2. Um verzerrte Amplicon-Mobilitätsmuster während der CE zu berücksichtigen, berechnen Sie genaue VNTR-Wiederholungszahlen nach der nachstehenden Formel, wobei VNTR CE-Größenaufrufe zusammen mit ortsspezifischen Variablen verwendet werden (siehe Tabelle 1). Aus Gründen der Effizienz ist es ratsam, diesen Prozess zu automatisieren (z. B. mithilfe einer Tabellenvorlage).
   
3. Rund berechnete VNTR-Wiederholung zählt zur nächsten ganzzahligen Zahl und verketten sich in zehnstellige Zeichenfolgen, die jeweils das MLVA-Profil eines einzelnen Y.-Ruckeri-Isolats darstellen.

6. Minimale Spanning Tree Cluster-Analyse von MLVA-Daten

HINWEIS: Schritt 6 beschreibt die Erstellung von MST-Diagrammen aus Y. ruckeri MLVA-Daten unter Verwendung der spezifischen Software, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Weitere Informationen und Zur Problembehandlung finden Sie im Softwarehandbuch. Für die Verwendung anderer Software konsultieren Sie die entsprechenden Handbücher.

1. Erstellen Sie eine neue Datenbank und aktivieren Sie das MLVA-Plugin.
2. Importieren Sie Y. ruckeri MLVA-Profile und Metadaten, indem Sie Zeichentypdaten gefolgt von Importfeldern und Zeichen auswählen (weitere Unterauswahl je nach Speicherformat). Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Importregeln entsprechend dem Inhalt der Importdatei an: Klassifizieren Sie in der Spalte Zieltyp VNTR-Wiederholungszahlen als Zeichenwert: VNTRund die verschiedenen Metadaten als Eingabeinformationen: Eingabeinfofeld .
   HINWEIS: Zum Vergleich und Kontext ist es auch möglich, den gesamten veröffentlichten Datensatz (Open Access) zusammen mit dem Originalpapier unter Verwendung des vorliegenden MLVA-Protokolls¹⁴zu importieren. MLVA-Profile und Metadaten zur vielfältigen Sammlung von Y. ruckeri Isolaten (n = 484), die in dieser Studie untersucht werden, sind aus ihrem ergänzenden Material (Tabellen S1 und S2) unter folgendem Link erhältlich: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
3. Öffnen Sie im Bedienfeld "Experiment" den VNTR-Eintrag, und legen Sie die Minimal- und Maximalwerte für jeden VNTR-Lokus auf 0 bzw. 100fest. Legen Sie unter Allgemeine Einstellungendie Anzahl der Dezimalstellen auf 0 fest, und wählen Sie Unter Datentyp Zahlen aus. Aktivieren Sie diese Option, um fehlende Werte als Null zu betrachten.
4. Wählen Sie importierte Stichproben aus, die für die MST-Clusteranalyse bestimmt sind, und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Vergleicherstellen erstellen (im Vergleichsfenster).
   1. Ordnen Sie die Samples auf Wunsch für die visuelle Darstellung des MST farbigen Gruppen (z. B. nach einem bestimmten Metadatenmerkmal) zu, indem Sie die verschiedenen Optionen im Gruppenbedienfeld nutzen.
      HINWEIS: Gruppen können nach den folgenden Schritten auch nachträglich erstellt/verändert werden.
   2. Wählen Sie Erweiterte Clusteranalyse... und MST für kategoriale Daten aus, um ein MST-Diagramm basierend auf den ausgewählten Stichproben zu generieren.
   3. Ändern Sie die visuelle Darstellung des MST weiterhin als bevorzugt (z. B. durch Hinzufügen von Partitionierungsparametern, Knoten-/Zweigbeschriftung, Querverbindungen, Legenden usw.). Siehe Beispiel in Abbildung 3.
      HINWEIS: Ein Cluster-Partitionierungsschwellenwert (klonaler Komplex) von 4/10 nicht identischen VNTR-Loci wurde zusätzlich zum Ausblenden von Zweigverbindungen, die >5/10 nicht identische VNTR-Loci darstellen, zuvor für die MST-Clusteranalyse auf der Grundlage von MLVA-Daten verwendet. mit diesem Protokoll¹⁴. Sofern der oben genannte Datensatz von 484 Y. ruckeri MLVA-Profilen importiert wurde, können diese Beispiele auch für die MST-Clusteranalyse (wie oben beschrieben) eingeschlossen werden, um einen globalen und historischen Kontext zu liefern. Dies erleichtert z. B. die Identifizierung von Proben, die mit zuvor beschriebenen klonalen Komplexen verbunden sind, sowie von Proben, die noch unbeschriebene Abstammungslinien darstellen. Je nach verfügbaren Metadaten kann das resultierende MST-Diagramm auf unterschiedliche Weise überprüft werden, z. B. um eventuelle Clustering-Muster zu ermitteln, die mit bestimmten Merkmalen (Geographie, Host, Zeit usw.) verknüpft sind.
   4. Exportieren Sie bei Bedarf den fertigen MST in ein gewünschtes Format mit der Auswahl des Exportbilds.

Results

Nach Multiplex-PCR, wie hier beschrieben, wird in Abbildung 1ein typisches GE-Bild gezeigt, das das Vorhandensein mehrerer Amplicons aus jeder PCR-Reaktion überprüft. Die nachgeschaltete CE-Fragmentanalyse, die an verifizierten PCR-Produkten durchgeführt wird, führt für jedes untersuchte Y. ruckeri-Isolat zu zwei Elektropherogrammdateien, die für den Größenaufruf der jeweiligen VNTR-Loci verwendet werden ( Abbildung2). Bei der Analyse von 484 verschiedenen Y. ruckeri Isolaten wurde keine Überlappung im Amplicon-Größenbereich zwischen VNTR-Loci beobachtet, die mit demselben Farbstoff in derselben Multiplexreaktion gekennzeichnet waren (Tabelle 1)¹⁴. Jeder der elektrophoretischen Spitzen kann daher eindeutig durch Farbe identifiziert werden.

Nach dem Import von MLVA-Profilen und relevanten Metadaten in die bevorzugte Software können MST-Diagramme wie beschrieben für die Prüfung etwaiger epidemiologischer Muster erstellt werden, die für das Material von Interesse sind. Weitere Optionen finden Sie in den entsprechenden Handbüchern der jeweiligen Software. Als Beispiel zeigt Abbildung 3 den Vergleich von MLVA-Profilen für Y. ruckeri-Isolate, die von Fischen gewonnen wurden, die mit fünf verschiedenen Lachsfarmen in Norwegen in Verbindung gebracht wurden, anhand von MST.

Die konsistenten Wiederholungsgrößen der zehn VNTR-Loci sowie deren In-vitro- und In-vivo-Stabilität wurden zuvor in der ursprünglichen Studie auf der Grundlage dieses Protokolls¹⁴überprüft. Kurz gesagt, wurde dies mit Sanger-Sequenzierung (Wiederholungsgröße) und durch MLVA-Typisierung mehrerer Isolate nach seriellen Passagen (in vitro) und innerhalb einzelner Krankheitsausbrüche (in vivo) durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Umweltstabilität der Loci im Laufe der Zeit untersucht, indem mehrere "Hausstamm"-Isolate eingegeben wurden, die über mehrere Jahre von anhaltend infizierten Süßwasserproduktionsstätten für Atlantischen Lachs geborgen wurden.

Abbildung 1 : Gelelektrophorese zur Überprüfung des Vorhandenseins mehrerer PCR-Produkte. Das Bild bestätigt das Vorhandensein mehrerer PCR-Amplicons in allen 12 Bahnen, die Proben enthalten, wobei die erste Spur die verwendete DNA-Leiter darstellt. Die Größen ausgewählter Leiterfragmente wurden angegeben, ebenso wie der PCR-Assay und die Dehnung (siehe Tabelle S1 in Gulla et al. 2018¹⁴) Zugehörigkeit jeder Spur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Elektropherogramme, die Spitzen zeigen, die VNTR-Ampliconsentsprechen. Die Namen der verschiedenen VNTR-Loci sind mit Farbstoffetiketten (VIC = grün; NED = schwarz; 6FAM = blau) in Klammern. Die beiden Elektropherogramme (PCR-Assay 1 oben; PCR-Assay 2 unten) stammen aus der Eingabe eines einzelnen Y. ruckeri Isolat. Orange Peaks (Dye LIZ) stellen den verwendeten Größenstandard dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Beispiel Mindestspannbaum für die epidemiologische Bewertung. Das Diagramm basiert auf MLVA-Profilen von Y. ruckeri Isolaten, die in fünf verschiedenen norwegischen Farmen (1-5; siehe Legende) von atlantischen Lachsen gewonnen wurden und wiederkehrende Yerisnioseausbrüche erfahren. Eine deutliche Cluster-Tendenz, die mit dem Ursprung landwirtschaftlicher Betriebe verbunden ist, ist zu beobachten. Querlinks zeigen alle möglichen Verbindungen mit nicht identischen VNTR-Loci mit der Größe 1/10 (siehe Legende). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Elektropherogramm visualisiert Stotter- und Split-Peaks. In diesem Fall treten beide gleichzeitig auf, was nicht immer der Fall ist. Die längere und höhere Spitze, die den YR1070 VNTR-Lokus darstellt, lässt sich leicht unterscheiden. Das Display ist vergrößert und zeigt nur blaue Färbespitzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Eigenschaften des VNTR-Lokus. Relevante Merkmale der zehn Y. ruckeri VNTR-Regionen, die im vorliegenden MLVA-Protokoll zum Ziel sind.

Discussion

Beide multiplexPCRs, die hier vorgestellt wurden, erschienen angesichts der schlechten DNA-Qualität der Schablone relativ robust, aber der Mangel an PCR-Verstärkung wurde dennoch gelegentlich beobachtet, wenn Vorlagen mit extrem hohen DNA-Konzentrationen verwendet wurden. Diese Probleme wurden leicht gelöst, indem die Vorlagen vor pcR verdünnt wurden. Es können auch andere Methoden zur DNA-Extraktion als die hier verwendeten verwendet werden (z. B. kommerzielle Kits).

Obwohl von jeder Multiplex-PCR-Reaktion fünf Amplicons erwartet werden, sollten von GE nicht immer fünf visuell unterscheidbare Bänder erwartet werden, da einige (anders beschriftete) VNTR-Loci innerhalb derselben Reaktion überlappende Größenbereiche aufweisen. Die endgültige PCR-Verlängerungszeit von 60 min kann bei Bedarf verkürzt werden, wird aber wahrscheinlich zu einem erhöhten Auftreten von Splitpeaks in nachfolgenden CE-Elektropherogrammen führen (siehe unten). Da der Zweck des GE-Schritts ausschließlich der qualitativen Überprüfung von PCR-Amplicons dient, können die Laufzeit, die Spannung und/oder das Gelrezept wie gewünscht angepasst werden. Wenn GE besonders schwache Bänder beobachtet, kann es ratsam sein, den Verdünnungsfaktor dieser Proben vor CE zu reduzieren.

Während das hier beschriebene CE-Protokoll auf einem bestimmten kommerziellen Kapillarelektrophoresegerät ausgeführt wurde (siehe Materialtabelle),können verschiedene CE-Systeme unterschiedliche Probenanforderungen aufweisen, was wiederum zu einigen Änderungen am Protokoll führen kann. . Hinweise zur Fragmentanalyse finden Sie im Handbuch des jeweiligen CE-Systemherstellers. Es besteht auch die Möglichkeit, dass sich die während des CE beobachteten voreingenommenen Amplicon-Mobilitätsmuster relativ erweise zwischen CE-Systemen und/oder Maschinen unterscheiden, wie zuvor für andere MLVA-Protokolle^15,16dokumentiert wurde. Wenn die stritten den letzten (gerundeten) VNTR-Wiederholungszähler, so müssen die ortsspezifischen Variablen s und i (Tabelle 1), die zur Bestimmung der VNTR-Wiederholungszahlen verwendet werden, neu kalibriert werden. Dies beinhaltet eine lineare Regression auf Diagrammen, die genaue Sequenzgrößen mit CE-Größenaufrufen vergleichen, wie von Gulla et al. 2018¹⁴beschrieben.

Split-Peaks und Stotterspitzen, beides bekannte Artefakte in CE-basierter MLVA-Typisierung¹⁷, können bei Elektropherogrammen während des Größenaufrufs beobachtet werden (Abbildung 4). Während Stotterspitzen unberücksichtigt bleiben sollten, sollte der längere Peak bei geteilten Spitzen, die durch ein einzelnes Basispaar getrennt sind, konsequent für nachgeschaltete Anwendungen ausgewählt werden. Darüber hinaus sind fehlende Spitzen, die auf das Fehlen bestimmter VNTR-Loci hinweisen, selten, können jedoch auftreten, wobei eine Wiederholungszahl von '0' zugewiesen werden sollte. Wenn die Ausgangskultur, aus der DNA extrahiert wird, nicht rein ist (d.h. mehr als einen Y. ruckeri Subtyp enthält), können nach CE mehrere hohe Spitzen beobachtet werden, die verschiedenen Allelen desselben Lokus/Loci entsprechen. Sekundäre Kultivierungen müssen dann aus einzelnen Kolonien durchgeführt werden, bevor neue DNA-Extraktion für die Wiedertypisierung erfolgt.

Wie im Protokoll angegeben, sollte Die Vorlagen-DNA für PCR standardmäßig aus reinen Kulturen von Y. ruckeriextrahiert werden. In einigen Fällen wurden jedoch eifluidische Proben, die positiv auf Y. ruckeri durch qPCR (Ct-Werte < 27) getestet wurden, erfolgreich MLVA direkt, ohne vorherige Kultivierung, unter Verwendung einer erhöhten Menge an genomischer DNA (extrahiert mit kommerziellem Kit) als Vorlage. Obwohl dieser Ansatz nicht ausgiebig getestet oder verifiziert wurde, weist er auf das Potenzial dieses MLVA-Assays zur Untersuchung komplexer biologischer Matrizen hin, die neben Y. ruckeriauch DNA-haltige DNA aus einer Reihe verschiedener Organismen enthalten.

Das gesamte hier vorgestellte MLVA-Typisierungsverfahren, von der DNA-Extraktion bis zur epizootiologischen Auswertung, kann an einem einzigen Arbeitstag abgeschlossen werden. Die Anzahl der untersuchten Proben steht jedoch in einer sublinearen Beziehung zur Zeit, die für DNA-Extraktion, PCR und CE benötigt wird, und die Methode ist daher viel zeiteffizienter, wenn mehrere Proben gleichzeitig ausgeführt werden. Dies ist jedoch der Fall für die meisten Labor-basierten Methoden, und als Werkzeug für die epidemiologische Subtypisierung von Y. ruckerimacht die Kombination aus hoher Auflösung, Einfachheit und Portabilität diesen MLVA-Assay den zuvor veröffentlichten Protokollen überlegen^{4 ,5}. Es wurde auch verwendet, um die begrenzte epidemiologische Relevanz von Y. ruckeri serotyping¹⁴zu überprüfen.

Durch eine umfassende MLVA-basierte Populationsstudie mit 484 Y. ruckeri Isolaten, die aus einer Reihe von raumzeitlichen Ursprüngen und Lebensräumen (Wirtsfische, Umwelt usw.) gewonnen wurden, haben wir verständnisvolle Informationen über die Epizootiologie und die Population Struktur dieses wichtigen Fischpathogens wurde deutlich erhöht¹⁴. Die MLVA-Typisierung ermöglichte die Rückverfolgung von Klonen, die über Jahrzehnte anthropogen verbreitet wurden, vermutlich durch den Transport von Fischen, sowie die Identifizierung lokal begrenzter Stämme. Während einige klonale Komplexe des Bakteriums eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden könnten, insbesondere mit Fischwirten (Regenbogenforelle bzw. Atlantischer Lachs), wurden andere nur aus Umweltquellen und/oder klinisch nicht betroffenen Fischen geborgen. Exemplare. Die Anwendbarkeit des Verfahrens beschränkt sich daher nicht nur auf die Rückverfolgung von Infektionen, da sie auch Informationen von potenzieller Relevanz liefern kann, z. B. für die Entwicklung von Impfstoffen, die Risikobewertung und die Aufrechterhaltung der nationalen Biosicherheit. Es ist derzeit im aktiven Einsatz am Norwegischen Veterinärinstitut als Werkzeug zur Untersuchung von Y. ruckeri Diagnosen in der norwegischen Aquakultur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22°; C/15° C-Inkubator	Nach Belieben.
5' markierte Grundierung, 10K PMOL, entsalzt, trocken	Thermo Fisher Scientific 450007		Sequenzen und Markierung in Tabelle 1. Bereiten Sie die Arbeitsaliquouts in TE-Puffer vor.
Agarose, universal, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	Wird bei der Gelelektrophorese verwendet.
Avant 3500xL Genetischer Analysator	Thermo Fisher Scientific	A30469	Wird für die Analyse von Kapillarelektrophorese-Fragmenten verwendet.
BioNumerics7 modules	Applied Maths	NA	Wird zum Generieren von Minimum Spanning Trees aus MLVA-Daten verwendet.
Zentrifuge(n)	Nach Belieben.
NA Custom DNA Oligo, 25N, entsalzt, trockene	Thermo Fisher Scientific	A15612	Sequenzen in Tabelle 1. Bereiten Sie die Arbeitsaliquouts in TE-Puffer vor.
DNA-Gel-Ladefarbstoff (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611	Ladefarbstoff, der während der Gelelektrophorese verwendet wird.
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Zentrifugenröhrchen für die DNA-Extraktion.
Gefrierschrank	Nach Belieben.
Abzug	Nach Belieben.
Gel-Elektrophorese-System	Wie gewünscht.
GelRed Nukleinsäure-Färbung, 10.000X in Wasser	Biotium	41003	Fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff, der während der Gelelektrophorese verwendet wird.
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Wird zum Lesen von Elektropherogrammen aus der Kapillarelektrophorese verwendet.
GeneRuler 50 bp DNA-Leiter, gebrauchsfertig	Thermo Fisher Scientific	SM0373	DNA-Leiter für die Gelelektrophorese.
GeneScan 600 LIZ Farbstoff Größenstandard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Größenstandard, der bei der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Heizblock	Nach Belieben.
Hi-Di Formamid	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Deionisiertes Formamid, das bei der Kapillarelektrophorese verwendet wird. Arbeitsaliquouts vorbereiten.
Milli-Q Wasser	NA	NA Gereinigtes	während der PCR und Kapillarelektrophorese verwendet wird. Standardrezept; im eigenen Haus produziert.
Multiplex-PCR  Plus  Kit	Qiagen	206151/206152
PCR-Thermocycler	Nach Wunsch.
POP-7 Polymer für 3500 Dx/3500xL Dx Genetische Analysatoren	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Trennmatrix, die während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Reinkultur Yersinia ruckeri	NA	NA	Z.B. kryokonserviert oder frisch.
RNasefreies Wasser	Qiagen	NA	In: Multiplex-PCR  Plus  Kit
Tris-Borat-EDTA (TBE)   Puffer	NA	NA	Standardrezeptur; aus eigener Herstellung.
Trypsin-Soja-Agar/Rinderblut-Agar	NA	NA	Standardrezept; aus eigener Herstellung.
UV-basiertes Gel-Imaging-/Visualisierungssystem	Nach Belieben.
Vortexer	Wie bevorzugt.	Na