Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.
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Methodenartikel
Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.
Einleitung
Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale1ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwen....
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Protokoll
Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt.
(1) Lösungen
-
Slicing Lösung
- Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .
- Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco33, Glukose und Saccharose in DdH2O und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherzustellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 315-320 mOsm und speichern ....
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Ergebnisse
Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen.
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Diskussion
Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durch stä.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben
Danksagungen
J.s. erhielt Ontario Graduate Stipendium. W.I Stipendium ein neue Ermittler aus Mental Health Research Kanada. Diese Arbeit wird unterstützt durch Betriebskostenzuschüsse, Wi aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) und des Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Spritze | BD | 309659 | |
| 10 Klingen | Fisher Scientific/andere | 35698 | |
| 22 Klingen | VWR/andere | 21909-626 | |
| 22 μ M Spritzenfilter | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Abgewinkelte scharfe Schere | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Doppelschneidige Klinge | VWR | 74-0002 | |
| Filterpapier | Sigma/andere | 1001090 | |
| Feiner Pinsel | Fisher/diverse | 15-183-35/diverse | |
| Gasdispersionsrohr | VWR | LG-8680-120 | |
| Isofluran | Fresenius Kabi/andere | M60303 | |
| Krazy Kleber | diverse | diverse | |
| Mini Analyse | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Modell 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteurpipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Gummibirne | VWR | 82024-550 | |
| Skalpellgriff Nr. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Skalpellgriff Nr. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Einschneidige Klinge | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1200S | |
| Wasseraufbereitungssystem | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well Plattendeckel | Fisher/diverse | 07-201-590/verschiedene | |
| Chemikalien/Reagenzien | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | Molekularsonden | B1204 | |
| CaCl2*2H2 | O Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Glukose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-Gluconat | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molekularbiologische Qualität Wasser | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconat | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| Saccharose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
Referenzen
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
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Nachdrucke und Genehmigungen
