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Methodenartikel

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

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DOI:

10.3791/59463

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11. Mai 2019

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1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.

Zusammenfassung

Viren, die von Menschen und Tieren ausgeschieden werden, können Wasserquellen kontaminieren und eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen, wenn dieses Wasser zum Trinken, zur Bewässerung von Lebensmitteln, zum Waschen usw. verwendet wird. Der klassische Fäkalbakterienindikator überprüft nicht immer das Vorhandensein viraler Krankheitserreger, so dass der Nachweis viraler Krankheitserreger und Viralindikatoren relevant ist, um Maßnahmen zur Risikominderung zu ergreifen, insbesondere in humanitären Szenarien und in Gebieten. wo wasserübertragene Virusausbrüche häufig auftreten.

Derzeit stehen mehrere kommerzielle Tests zur Quantifizierung von Fäkalindikatorbakterien (FIB) zur Prüfung am Einsatzort zur Verfügung. Solche kommerziellen Tests sind jedoch nicht für den Nachweis von Viren verfügbar. Der Nachweis von Viren in Umweltwasserproben erfordert die Konzentration mehrerer Liter auf kleinere Volumina. Darüber hinaus beruht der Nachweis von Viren, sobald es konzentriert ist, auf Methoden wie nukleinsäureextraktion und molekularer Detektion (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR]-basierte Assays) der viralen Genome.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Konzentration von Viren aus 10 L Wasserproben sowie die Extraktion von viralen Nukleinsäuren am Einsatzort mit einfachen und tragbaren Geräten. Dies ermöglicht die Prüfung von Wasserproben am Einsatzort für mehrere Viren und ist in humanitären Szenarien sowie in jedem Kontext nützlich, in dem kein ausgestattetes Labor zur Verfügung steht. Alternativ ermöglicht die Methode die Konzentration von Viren in Wasserproben und den Versand des Konzentrats an ein Labor bei Raumtemperatur zur weiteren Analyse.

Einleitung

In den ersten Phasen humanitärer Notfälle sind der Zugang zu sauberer Wasserversorgung, sanitären Einrichtungen und Hygiene für das Überleben der Betroffenen von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Überwachung der Wasserqualität eine Priorität, um Ausbrüche auf dem Wasser zu verhindern. Es ist allgemein bekannt, dass kontaminiertes Wasser häufig der Ursprung von Krankheiten ist, aber es ist oft schwierig, die Quellen von Virusausbrüchen wie dem Hepatitis-E-Virus (HEV) zu bestimmen, selbst wenn herkömmliche Labormethoden zur Verfügung stehen. Die Kontrolle der Wasserqualität basiert auf der Quantifizierung von FIB1,2,3,4. Es wurde jedoch ausführlich dokumentiert, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Fehlen von FIB und dem Vorhandensein von viralen, wasserübertragenen Krankheitserregern wie Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) oder HEV5,6gibt. Daher kann die Verwendung der auf FIB basierenden Wasserqualitätskriterien zu einer Unterschätzung der Risiken führen, die mit dem Vorhandensein von wasserbasierten Viruserregern verbunden sind. Die Überwachung von Indikatorviren wie humanen Adenoviren (HAdV) oder spezifischen Krankheitserregern wäre hilfreich bei der Definition der Exposition gegenüber virusviralen Krankheitserregern und der Identifizierung der potenziellen Quelle einer infektion beim Menschen7,8, 9,10 und bei der Validierung der Wirksamkeit von sanitären Maßnahmen11.

Bisher beruhte der Nachweis von Viren in diesen Szenarien auf qualifiziertes Personal und komplexe Logistik. VirWaTest (virwatest.org) zielt auf die Entwicklung einer einfachen, erschwinglichen und tragbaren Methode zur Konzentration und anschließenden Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort ab.

Die Viruskonzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung von 10 L Wasserproben, durch die Viren in kleineren Bänden12,13zurückgewonnen werden. Die Flocken werden gesammelt und einem Puffer hinzugefügt, der die Viren liert und verhindert, dass die Nukleinsäuren abgebaut werden, wenn sie nicht mehr als 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

Die Nukleinsäureextraktionsmethode basiert auf der Verwendung von magnetischen Partikeln, an die die Nukleinsäuren adsorbiert werden. Sie können mit einer magnetischen Pipette, an die sich die Partikel anheften, von einem Waschpuffer in einen anderen und schließlich in den Elutionspuffer übertragen werden. Die erhaltenen viralen Nukleinsäuresuspensionen können an ein Referenzlabor geliefert werden, wo der Nachweis mit molekularen Methoden auf PCR-Basis durchgeführt werden kann. Für jede Nukleinsäureextraktion werden zwei verschiedene Mengen getestet, um eine enzymatische Hemmung, die von der Probe ausgeht, auszuschließen. Alternativ können bei minimaler Geräteverfügbarkeit PCR-Tests am Einsatzort durchgeführt werden. Der gesamte Prozess ist so konzipiert, dass er unabhängig von einem Netzteil durchgeführt wird (Abbildung 1).

Ein quantitativer PCR-Test zum Nachweis von HAdV, der vom Menschen ausgeschieden und in Abwasserproben in hohen Konzentrationen gefunden wurde, wurde angepasst, um am Einsatzort ausgeführt zu werden. HAdV werden als menschliche fäkalvirale Indikatoren verwendet. Eine PCR zur Quantifizierung von MS2-Bakteriophagen wurde ebenfalls angepasst, da MS2 in VirWaTest als Prozesskontrolle eingesetzt wird. Die Methode kann für die Erkennung von Viren von Interesse angepasst werden.

Nach der Entwicklung wurde die VirWaTest-Methode von den Anwendern in zwei verschiedenen Einstellungen in der Republik Zentralafrika (RCA) und Ecuador angewendet und gibt Feedback zur Anwendung des Protokolls in realen Situationen.

Unserer Kenntnis nach ist dies das erste Verfahren, das die Konzentration und Detektion von Viren am Einsatzort ermöglicht, unabhängig von stromversorgung, großen Geräten und Gefrier-/Kühlbedingungen. Es wird empfohlen, zwei Wiederholungen jeder Wasserprobe zu sammeln, um robuste Ergebnisse zu erzielen.

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Protokoll

1. Vorbereitung und Verpackung

HINWEIS: Die zu verpackenden Materialien/Ausrüstungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Verwenden Sie Handschuhe, um die für die Prozesskontrolle erforderlichen Reagenzien, die Konzentrationsreagenzien, die Nukleinsäureextraktionsreagenzien und die Nachweisreagenzien zu handhaben. Tragen Sie Schutzbrillen, um die reagenzien zu handhaben, die für die Nukleinsäureextraktion erforderlich sind.

  1. Prozesssteuerung
    1. Vorbereiten der MS2-Bakterienbestandskultur (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) mit 1 x 1010 PFU/ml im Labor nach dem ISO-Verfahren 10705-1:199514.
    2. Dann, aliquot 10 l der Suspension pro Rohr enthält 1 x 108 PFU in 10 ml Rohre und lassen Sie das Wasser bei 37 °C verdampfen. Verwenden Sie ein Rohr pro Wasserprobe.
    3. Bereiten Sie zusätzlich ein Rohr mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser pro entnommener Probe zu.
  2. Konzentrationsreagenzien
    1. Für die vorflockulierte Magermilchlösung (PSM) verwenden Sie die folgenden Mengen, um fünf 10 L Wasserproben zu konzentrieren.
      1. Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 5 g Magermilch vor.
      2. Bereiten Sie eine Reißverschluss-Plastiktüte mit 16,66 g Meersalz vor.
      3. Bereiten Sie eine Plastikflasche mit 500 ml destilliertem Wasser vor.
    2. Bereiten Sie die reagenzien vor, die für die pH-Einstellung erforderlich sind. Verwenden Sie die folgenden Mengen, um den pH-Wert des PSM und von fünf 10 L Wasserproben anzupassen.
      1. 5 g Zitronensäure 1-Hydrat in ein 10 ml Kunststoffrohr geben.
        VORSICHT: Zitronensäure verursacht schwere Reizungen, wenn sie mit den Augen in Berührung kommt. Wenn dies geschieht, spülen Sie das Auge vorsichtig mit Wasser für mehrere Minuten. Wenn die Reizung anhält, suchen Sie ärztlichen Rat.
      2. 2 g Natriumhydroxid in ein 10 ml Kunststoffrohr geben.
        VORSICHT: Natriumhydroxid kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund. Erbrechen nicht induzieren. Wenn es in Kontakt mit den Augen kommt, spülen Sie vorsichtig mit Wasser für einige Minuten. Dann suchen Sie ärztlichen Rat.
      3. 25 ml steriles destilliertes Wasser in einen Kunststoffbehälter geben.
      4. 50 ml steriles destilliertes Wasser in einen Kunststoffbehälter geben.
    3. Bereiten Sie den Probenkonditionierungsbeutel für die Flockung, die Konservierungslösung zur Konservierung der Nukleinsäuren und den neutralisierenden Beutel vor, um das ausrangierte Wasser und die Materialien zu neutralisieren. Verwenden Sie die folgenden Mengen für jede zu prüfende 10-L-Wasserprobe.
      1. 15 g Meersalze und 8 g Zitronensäure 1-Hydrat in eine Reißverschluss-Plastiktüte für den Konditionierungsbeutel geben.
      2. Fügen Sie 2 ml Lysepuffer (Materialtabelle) und 0,3 ml Nukleinsäurekonservierungsmittel (Materialtabelle) zu einem 5 ml-Rohr hinzu.
        VORSICHT: Lysispuffer enthält Guanidinthiocyanat und Triton X-100. Der Kontakt mit Säure befreit giftiges Gas, und es ist schädlich, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund. Erbrechen nicht induzieren. Wenn es in Kontakt mit der Haut kommt, mit viel Wasser waschen. Dann suchen Sie ärztlichen Rat. Nukleinsäurekonservierungsmittel verursacht Haut- und Augenreizungen und ist schädlich, wenn sie geschluckt werden. Wenn es in Kontakt mit der Haut oder den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser für mehrere Minuten. In jedem Fall, vor allem, wenn geschluckt und gefühlunwohl, suchen Sie ärztlichen Rat.
      3. 40 g Waschmittelpulver in vier Plastiktüten mit Reißverschluss geben.
        VORSICHT: Pulverwaschmittel verursacht Augenreizungen. Wenn es in Kontakt mit den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser für mehrere Minuten. Wenn Die Reizung anhält oder geschluckt wird, suchen Sie einen Arzt auf.
  3. Nukleinsäureextraktionsreagenzien
    1. Legen Sie 50 l magnetische Partikel (Materialtabelle) und 1 ml Ethanol 96% in ein 5 ml-Rohr, das den Bindungspuffer bildet.
      VORSICHT: Der magnetische Partikelpuffer enthält Natriumazid, das ein giftiges Gas bildet, wenn es mit Säuren oder Schwermetallionen in Berührung kommt und bei Aufnahme oder hautkontakt toxisch ist. Wenn Sie aufgenommen werden oder mit der Haut in Berührung geraten, spülen Sie den Mund oder die Haut mit reichlich Wasser ab und suchen Sie ärztlichen Rat. Ethanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und Dampf und verursacht schwere Augenreizungen. Von Hitze, heißen Oberflächen, Funken und jeder anderen Zündquelle fernhalten. Wenn es in Kontakt mit der Haut oder den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser. Bei Einnahme großer Wassermengen und/oder beim Einatmen in die Frischeluft gehen. In jedem Fall, suchen Sie ärztlichen Rat.
    2. Fügen Sie die Waschpuffer 1, 2 und 3(Materialtabelle)zu drei 2 ml-Rohren hinzu.
      VORSICHT: Waschpuffer enthalten Guanidiniumthiocyanat und Guanidiniumchlorid, die schädlich sind, wenn sie eingeatmet oder geschluckt werden und haut und augenreizend sind. Der Kontakt mit Säuren setzt sehr giftiges Gas frei. Wenn sie mit der Haut oder den Augen in Kontakt kommen, spülen Sie mit reichlich Wasser ab. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund mit reichlich Wasser. Erbrechen nicht induzieren. Suchen Sie immer ärztlichen Rat.
    3. Fügen Sie 120 l Elutionspuffer (Materialtabelle) zu einem 0,5 ml-Rohr hinzu.
  4. HAdV- und MS2-Detektionsreagenzien
    HINWEIS: Zwei verschiedene Nukleinsäureextraktionsreaktionen können gleichzeitig in jedem PCR-Test analysiert werden, wenn ein 8-Well-Thermocycler verwendet wird. Für alle PCR-Assays bereiten Sie molekularbiologisches Wasser vor, das in 1,5 ml-Röhren eingeflossen ist.
    1. HAdV-Erkennung
      1. Bereiten Sie eine Mischung vor, die 10 l mit 22,5 -M AdF-Vorwärtsprimer, 10 l mit 22,5 -M AdR-Reverse-Primer und 5 l mit 11,25 -M AdP-Sonde enthält (Tabelle 2).
      2. Fügen Sie 2,5 l der Mischung zu den Rohren 1 bis 8 eines Rohrstreifens hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, schließen Sie die Rohre und halten Sie sie vor dem Licht geschützt.
      3. Schneiden Sie den Streifen, der ihn teilt, in zwei Streifen: Rohre 1-5 und Rohre 6-8.
      4. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von DNA-Suspensionen vor, die die Nukleotidsequenz des amplifizierten HAdV-Bereichs enthalten. Lufttrockene 1 l Suspensionen mit 1 x 105, 1 x 107und 1 x 109 GC/ml in Rohre 6-8.
        HINWEIS: Bewahren Sie die Rohre mit den Primern, der Sonde und den luftgetrockneten Suspensionen vor Licht schutz.
    2. MS2-Erkennung
      1. Bereiten Sie eine Mischung vor, die 10 l mit 25 'M Pecson-2F-Vorwärtsprimer, 10 'L von 25 'M Pecson-2R-Reverseprimer und 2,5 'L von 25'M PecP-2-Sonde enthält (Tabelle2).
      2. Fügen Sie 2,25 l der Mischung zu den Rohren 1 bis 8 eines Rohrstreifens hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, schließen Sie die Rohre und halten Sie sie vor dem Licht geschützt.
      3. Schneiden Sie den Streifen, der ihn teilt, in zwei Streifen: Rohre 1-5 und Rohre 6-8.
      4. Fahren Sie wie in Schritt 1.4.1.4 vor, verwenden Sie jedoch stattdessen eine Standardaufhängung für MS2.

2. Virale Konzentration

HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe zu jeder Zeit während der Probenentnahme, Reagenzienzubereitung, Flockung, Flockensammlung und Abfallentsorgungsverfahren. Tragen Sie während der Reagenzzubereitung eine Schutzbrille.

  1. Beispielsammlung
    1. Sammeln Sie eine 10 L Wasserprobe in einem flachen Boden Eimer mit einem Deckel. Sammeln Sie mindestens zwei Replikationen für jede Probe.
      HINWEIS: Es ist wichtig, klare Eimer zu verwenden, um das Pellet zu visualisieren. Wenn die Wasserprobe schwebtes Material (z.B. Sand, Algen) enthält, lassen Sie es sedimentieren und sammeln Sie dann den Wasserüberstand in einem neuen Eimer.
    2. Registrieren Sie das gesammelte Volumen sowie den Ort und das Abholdatum für jede Wasserprobe.
    3. Legen Sie einen magnetischen Rührer, der mit einer Batterie verbunden ist, unter eine Eimerstütze und legen Sie den Eimer mit der Wasserprobe auf seine Stütze.
      HINWEIS: Achten Sie auf eine flache Oberfläche an einem frischen Ort und halten Sie die Eimer, die die Wasserproben enthalten, vor direkter Sonneneinstrahlung.
  2. Reagenzienzubereitung
    1. pH-Anpassungsreagenzien
      1. Gießen Sie das Zitronensäurepulver und die Natriumhydroxidpellets in die Töpfe mit 25 bzw. 50 ml destilliertem Wasser.
      2. Vorsichtig von Hand schütteln, bis die Zitronensäure und das Natriumhydroxid vollständig gelöst sind.
        VORSICHT: Gießen Sie das Wasser nicht über die Natriumhydroxidpellets. Stattdessen gießen Sie die Natriumhydroxidpellets über das Wasser.
    2. Vorflocculated Magermilch
      1. Legen Sie einen Stand-up-Beutel auf einen Magnetrührer und gießen Sie 500 ml destilliertes Wasser hinein. Lassen Sie einen Rührmagneten in die Tasche und schalten Sie den Magnetrührer ein.
      2. Den Inhalt eines Meersalzbeutels und eines Magermilchrohrs in den Stand-up-Beutel gießen und 5 min bei mittlerer Geschwindigkeit rühren, um sie aufzulösen.
      3. Fügen Sie der PSM-Lösung 3 ml Zitronensäure mit einer Pasteur-Pipette hinzu, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 3,4 und 3,6 liegt. Messen Sie den pH-Wert der PSM-Lösung mit pH-Indikatorstreifen. Fügen Sie kleinere Mengen an Zitronensäure und Natriumhydroxid hinzu, wenn der pH-Wert näher an 3,5 kommt.
      4. Schalten Sie den Magnetrührer aus und stellen Sie sicher, dass die Flocken sichtbar sind. Verwenden Sie eine Taschenlampe, um die Flocs zu visualisieren.
  3. Flockung
    1. Lassen Sie einen Rührmagneten ins Wasser, stellen Sie den Magnetrührer mit maximaler Geschwindigkeit ein und schalten Sie ihn ein. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührmagnet zu drehen beginnt.
    2. 10 ml destilliertes Wasser in ein Prozesskontrollrohr geben. Invertieren Sie die Röhre ein paar Mal, um den Virusbestand zu rehydrieren und die Lösung in das Wasser zu gießen.
    3. Gießen Sie den Inhalt eines Probe-Konditionierungsbeutels in das Wasser und rühren Sie 5 min.
    4. Messen Sie den pH-Wert der Wasserprobe mit pH-Indikatorstreifen. Fügen Sie der Wasserprobe ein paar Tropfen Zitronensäure oder Natriumhydroxid hinzu, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 3,4 und 3,6 liegt. Fügen Sie kleinere Mengen an Zitronensäure und Natriumhydroxid hinzu, wenn der pH-Wert näher an 3,5 kommt.
    5. Fügen Sie 100 ml der PSM-Lösung mit einem 100 ml-Container hinzu.
    6. Versiegeln Sie den Eimer mit dem Deckel, stellen Sie den Magnetrührer mit minimaler Geschwindigkeit ein und lassen Sie das Wasser 8 h rühren.
    7. Schalten Sie den Magnetrührer aus und lassen Sie das Wasser noch mindestens 5 h, damit sich die Flocken absetzen können.
  4. Floc-Kollektion
    1. Bauen Sie ein Siphoning-System, das aus einem Pipettenregler, zwei Pipetten und einem Kunststoffrohr besteht, um den Wasserüberstand zum Entladen des Wassers auf den Flocken zu aspirieren.
      1. Schließen Sie eine 10 ml Bandendpipette an den Pipettenregler an. Befestigen Sie dann die Spitze der Pipette am Kunststoffrohr.
      2. Entfernen Sie den Filter einer 10 ml-Open-Tip-Pipette mit einer Pinzette und befestigen Sie die Pipette am Kunststoffrohr.
    2. Legen Sie einen leeren Eimer auf den Boden.
    3. Tauchen Sie die Spitze der Open-Tip-Pipette in das Wasser. Achten Sie darauf, es in der Nähe der Wasseroberfläche zu halten, um zu vermeiden, dass die Flocken gestört werden. Aspirieren Sie den Wasserüberstand, bis er die Tape-End-Pipette erreicht.
    4. Kneifen Sie das Kunststoffrohr an das Ende, das an der Tape-End-Pipette befestigt ist, und lösen Sie es von der Pipette.
    5. Legen Sie das Rohr in einen leeren Eimer. Lassen Sie den Druck auf das Rohr los, damit das Wasser in den leeren Eimer fließen kann.
    6. Kneifen Sie das Kunststoffrohr, um den Wasserfluss zu stoppen, wenn der Wasserstand im Begriff ist, den Rührmagneten zu erreichen, und bewegen Sie die Pipette vom Eimer weg.
    7. Schütteln Sie den Eimer, um die Flocken wieder aufzuhängen, und gießen Sie sie in eine 500 ml Stand-up-Plastiktüte. Lassen Sie die Flocs mit 1 h mehr zufrieden sein.
    8. Saugen Sie den Wasserüberstand vorsichtig mit einer 50 ml Pipette und einem manuellen Pipettenregler, um eine Störung der Flocken zu vermeiden.
    9. Die Flocken mit einer 100 ml Pipette aspirieren und in ein 50 ml graduiertes Zentrifugenrohr übertragen. Notieren Sie sich das Endvolumen des Probenkonzentrats und übertragen Sie 1 ml davon in ein 5 ml-Rohr, das die Konservierungslösung enthält, wobei eine Pasteur-Pipette verwendet wird.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Zentrifugenrohr abgestuft wird, damit das Endvolumen der konzentrierten Probe so genau wie möglich gemessen und registriert werden kann.
    10. Führen Sie die Nukleinsäureextraktion im Feld durch. Alternativ können Sie die Konservierungslösung, die die Viren enthält, bis zu 15 Tage bei 20-30 °C aufbewahren oder zur weiteren Analyse an ein Referenzlabor liefern.
  5. Abfallentsorgung und Materialwiederverwendung
    1. Fügen Sie den Inhalt eines neutralisierenden Agentenbeutels in den Eimer ein, der das ausrangierte Wasser enthält. Mischen Sie das Wasser, und dann, lassen Sie es noch für 30 min.
    2. Entsorgen Sie das behandelte Wasser als allgemeinen Abfall.
    3. Legen Sie die Pipetten und das Kunststoffrohr in den Eimer. Füllen Sie den Eimer mit Wasser und gießen Sie den Inhalt eines neutralisierenden Agentenbeutels ein.
    4. Waschen Sie sie für mindestens 30 min, um sie zu sterilisieren und spülen Sie sie mit reichlich sauberem Wasser, um alle verbleibenden Neutralisationsmittel zu entfernen.

3. Nukleinsäureextraktion

HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe und tragen Sie während des Nukleinsäureextraktionsverfahrens immer eine Schutzbrille.

  1. Magnetische Rpipettenbedienung
    1. Machen Sie sich mit der Bedienung der magnetischen Pipette vertraut, bevor Sie die Extraktion durchführen.
  2. Nukleinsäureextraktion
    1. Ordnen Sie die Rohre, die die für die Extraktion erforderlichen Reagenzien enthalten, in einem Rack an, von links nach rechts: Bindungspuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Rohren entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben oder Replikationen fest.
    2. 1 ml Probenkonzentrat mit einer Einweg-Pasteurpipette in das Rohr mit dem Bindungspuffer geben. Invertieren Sie das Rohr 8x bis 10x, um die Lösung zu homogenisieren.
    3. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min beim kontinuierlichen Mischen, entweder mit einem solarbetriebenen Orbital oder manuell.
    4. Sammeln Sie die magnetischen Partikel mit der magnetischen Pipette und einer sauberen Spitze, die für die drei Waschpuffer wiederverwendet werden kann.
    5. Lassen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr mit 500 l Waschpuffer 1. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
    6. Übertragen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das 600 l Waschpuffer 2 enthält. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
    7. Übertragen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das 200 l Waschpuffer 3 enthält. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
    8. Lassen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das den Elutionspuffer enthält, und entsorgen Sie die Spitze.
    9. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 5 min beim kontinuierlichen Mischen, mit dem solarbetriebenen Orbital.
      HINWEIS: Das Mischen der magnetischen Partikel im Elutionspuffer ist ein entscheidender Schritt. Bei Fehlen eines Orbitals, während der Inkubationszeit kontinuierlich von Hand mischen.
    10. Ersetzen Sie die Spitze auf der magnetischen Pipette durch eine neue und sammeln Sie die magnetischen Partikel aus dem Elutionspuffer. Achten Sie darauf, die magnetischen Partikel vollständig aus dem Elutionspuffer zu entfernen, da sie molekulare Detektionsmethoden stören können.
    11. Entsorgen Sie die Spitze mit den partikeln, die daran befestigt sind. Fahren Sie mit der PCR-Analyse fort, versenden Sie den Elutionspuffer an ein Referenzlabor oder lagern Sie den Elutionspuffer bei 4 °C zur weiteren Analyse.

4. Virale Erkennung mit einem batteriebetriebenen Acht-Rohr-Echtzeit-Thermocycler

HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe und tragen Sie während des Nukleinsäurenachweises immer eine Schutzbrille. Ersetzen Sie die Handschuhe für neue, wenn Sie ein neues PCR-Experiment durchführen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

  1. HAdV quantitative PCR
    1. Fügen Sie den Rohren 2, 4 und 5 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
    2. Fügen Sie den Röhren 1-5 4 l PCR-Mix hinzu.
    3. Fügen Sie 14 l Nukleinsäureextraktion von Probe A zu Tube 1 und 14 l von Probe B zu Tube 3 hinzu.
    4. Fügen Sie 2 l extrahierte Nukleinsäuren aus Probe A zu Tube 2 und 2 l von Probe B zu Tube 4 hinzu. Schließen Sie den Fünfrohrstreifen.
    5. Fügen Sie den Rohren 6, 7 und 8 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
    6. Fügen Sie 4 l dieser Mischung zu den Rohren 6, 7 und 8 hinzu, und schließen Sie sie.
    7. Legen Sie beide Streifen in den Thermocycler und wählen Sie den entsprechenden Lauf aus (Tabelle 3).
    8. Entsorgen Sie das Wasserrohr und bewahren Sie die extrahierte Nukleinsäure möglichst an einem frischen, lichtgeschützten Ort auf, falls eine zweite Prüfung durchgeführt werden muss.
    9. Reinigen Sie die Mikropipetten, das Rack, das Arbeitsmaterial und das gesamte Material ordnungsgemäß mit einem Nukleinsäurereiniger, und entsorgen Sie die Plastiktüte mit der verwendeten Spitze, Handschuhe n. Chr. und Schläuchen.
      VORSICHT: Nukleinsäureentferner ist eine sehr brennbare Flüssigkeit und Dampf. Atmen Sie den Sprühnebel nicht ein und vermeiden Sie jeglichen Kontakt der Flüssigkeit mit den Augen oder der Haut. Ansonsten sofort mit reichlich Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen.
    10. Sammeln Sie die Ergebnisse und analysieren Sie die erhaltenen Daten.
  2. MS2 quantitative PCR
    1. Fügen Sie den Rohren 2, 4 und 5 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
    2. Fügen Sie den Röhrchen 1-5 4 l PCR-Mix und 0,5 l Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu.
    3. Fügen Sie 14 l Nukleinsäureextraktion von Probe A zu Tube 1 und 14 l von Probe B zu Tube 3 hinzu.
    4. Fügen Sie 1 l extrahierte Nukleinsäuren aus Probe A zu Tube 2 und 1 l von Probe B zu Tube 4 hinzu. Schließen Sie den Fünfrohrstreifen.
    5. Fügen Sie den Rohren 5, 6, 7 und 8 15,5 l nukleasefreies Wasser hinzu und schließen Sie sie.
    6. Fügen Sie den Röhrchen 6, 7 und 8 4 l PCR-Mix und 0,5 l Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu.
    7. Legen Sie beide Streifen in den Thermocycler und wählen Sie den entsprechenden Lauf aus (Tabelle 3).
    8. Fahren Sie wie in den Schritten 4.1.8 bis 4.1.10 beschrieben vor.

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Ergebnisse

Methodenentwicklung

Dieses Verfahren wurde im Labor für Viren Kontaminanten von Wasser und Lebensmitteln in Zusammenarbeit mit GenIUL und Oxfam Intermin entwickelt. Es besteht aus drei verschiedenen Schritten. Die erste, die virale Partikelkonzentration, ist eine Anpassung einer Magermilchflockungsmethode, die zuvor beschrieben wurde12,17,

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Diskussion

Die VirWaTest-Methode ermöglicht die Konzentration von Viren und Nukleinsäureextraktion aus Wasserproben am Einsatzort von unerfahrenen Anwendern. Es ist ein erschwingliches, schnelles und einfaches Protokoll. Die Konzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung mit Magermilch, wodurch sich Magermilchproteine aufgrund des niedrigen pH- und hohen Leitfähigkeitswertes zu Flocken aggregieren lassen, die die Viren adsorbieren. Wenn die Flocken Sediment, ist es einfach, sie zu sammeln, so dass es möglich ist, 10...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

VirWaTest war ein Forschungsprojekt, das vom HIF (Humanitarian Innovation Funds) Programm der ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance) finanziert wurde. Die Autoren würdigen die WASH-Teams, die freundlicherweise an dieser Studie mitgearbeitet haben. Die Analyse von Proben in Ecuador wurde von Oxfam Ecuador und Direccién de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas ist Serra-Hunter Fellow an der Universität Barcelona.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5x HOT FIREPol Sonde qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Enthält Solis Biodynes 5x HOT FIREPol Sonde qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reaktionen
8-Mikroröhrchen-Streifen mit KappendD Biolab840637flaches, dünnwandiges Profil, geeignet für quantitative und qualitative PCR-Batterien
und Netzteile für magnetische RührerGenIUL900011674Enthält 12V Autostrom Adapter
EimerhalterungGenIUL900011648Aluminium-Stützeimer
, 10 lCater4You10LTRPolypropylen, manipulationssicher, klare Farbe
Zentrifugenröhrchen, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polypropylen, steril, graduiert, mit Rand
Zitronensäure 1-Hydrat, 500 gPanReac AppliChem1410181211Pure, Pharma Grade, 1 Kilogramm
Durchsichtige PET-FlascheLabBoxFPET-500-088Klarfarbe, PET, Kappe nicht im Lieferumfang enthalten
Difco Magermilch, 500 gBecton Dickinson232100Dehydriertes
DNA/RNA-Schutzschild, 250 mLZymo ResearchR1100-250DNA/RNA-Konservierungsmedium, 250 mL
Easy9 PipettensteuerungLabBox EAS9-001-0010,3 μ m Filter, Pipetten von 0,1 bis 100 mL, Autoklavierbarer Silikon-Pipettenhalter
Eppendorf Tube, 0,5 mLEppendorf0030121023Polypropylen, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mLEppendorf0030120094Polypropylen, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5mL dD Biolab999542Polypropylen, steril, graduiertes
Ethanol 96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611Für UV-, IR - und
LabBoxFORS-007-002Dünnes, gebogenes Ende, L= 120 mm
MagnetrührerGenIUL900017000Batteriebetriebener
MarkerdD Biolab929203Schwarz, extra feine Spitze, wasserfest, schnell trocknend, für Kunststoff- und Glaswaren
Micro Rota-Rack für MikroröhrchendD Biolab377824 Module, L x B x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR CyclerCoyote Biosciences, ChinaMini-8Portable, funktioniert mit 12V Netzteilen oder externen Batterien, zwei Kanäle, Kapazität für 8 Röhrchen
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292Reagenzien für bis zu 48 Isolierungen, Lagerung bei Umgebungstemperatur
Serologische Pipette mit offener Spitze, 10 mLDeltalab900136NSteril, einzeln verpackt (Papier/Kunststoff)
PE-Schraubverschluss PP28LabBoxTP28-004-020für PET-Flaschen
pH-IndikatorstreifenLabBoxWSPH-001-001Bereich pH 2,8 bis pH 4,4, 50 Streifen pro Packung
Kunststoff-ReagenzglasQuimikals300913Enthält Kappe
Polyethylen-Pasteur-PipetteLabBoxPIPP-003-500graduiert, 7 mL Gesamtvolumen, Unsteriler
Polypropylen-Schraubkolben mit Schraubverschluss, 150 mLDeltalab409726Schraubverschluss, steril, graduiert bis 100 mL
Polypropylen-Schraubkolben mit Schraubverschluss, 60 mLDeltalab409526GSchraubverschluss, steril, graduiert bis 50 mL
Pulverpulverwaschmittel-Normale Pulverseife zum Waschen von Kleidung
Stromkabel für MagnetrührerGenIUL900011692Verbindung zwischen Batterien und Magnetrührern
QuickPick MagnetwerkzeugBioNobile24001Handwerkzeug für magnetische Partikel
QuickPick Tips in BoxBioNobile24296RNase-frei, autoklaviert, 96 Stück
QuickPick XL gDNA Magnetische PartikelBioNobileSN511003,2 mL
MeersalzeSigma-AldrichS9883-500GEine künstliche Salzmischung, die der Zusammensetzung der gelösten Salze des Meerwassers sehr ähnlich
SilikonschlauchLabBoxSILT-006-005Rolle von 5 Metern, innen   x außen  ø= 6 x 10 mm
Natriumhydroxid-Pellets, 98,5 - 100,5VWR Chemicals28244295Pellets, 1 kg
Solar-DrehplattformSOL-EXPERT Group70020Acrylplatte, 10 U/min, unterstützt bis zu 300 Gramm
SOLIScript 1-Stufen-Sonden-KitSolis BioDyne08-57-00250Enthält den 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) und 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transkriptase Enzym), 250 Reaktionen
SPEEDTOOLS RNA-Virus-ExtraktionskitBioTools21.141-4197Enthält den BAW-Puffer (Waschpuffer 1), den BAV3-Puffer (Waschpuffer 2 und 3) und den BRE-Puffer (Elutionspuffer) von BioTools.
SpinBar Oktaedrischer RührmagnetdD Biolab045926Drehring, L x x & oslash; = 38 x 8 mm, blaue
serologische Pipette mit Klebeband, 10 mLDeltalabPN10E1steril, einzeln verpackt (Papier/Kunststoff)
Serologische Pipette mit Klebeband, 50 mLDeltalab 900043steril, einzeln verpackt (Papier/Kunststoff)
Termi-DNA-Tor - Nukleinsäure-EntfernerBioTools22001-4291Entferner von Nukleinsäuren, Bakterien, Pilzen und Mykoplasmen von Materialien und Oberflächen, 450 mL
Reagenz für die Molekularbiologie in Wasser, 1 lSigma-AldrichW4502-1LNuklease- und Proteasefrei, 0,1 μ; m Gefilterter
Whirl-Pak Beutel, 540 mLDeltalab200361Stabiler Boden
Zip Lock Plain BagLabBoxBZIP-080-100Polyethylen, L x B= 120 x 80 mm
HPLC-Laborpinzetten ist %

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