Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.
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Methodenartikel
Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.
Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.
Einleitung
Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.
Das ....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der Nationalen Gesundheitsinstitute und des Tierschutzgesetzes unter der Aufsicht unseres institutionellen Tierschutzausschusses durchgeführt. Die Tierprotokolle wurden nach institutionalethischen Richtlinien der Charité Berlin durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt und entsprechen den ARRIVE-Richtlinien.
1. Diät-induziertes Tiermodell der Steatohepatitis
- Im Alter von 4 Wochen Mäuse (C57Bl/6J) auf Nicht-SPF-Gehäuse übertragen und kontinuierlich einer breiten Palette von Umweltpathogens-und Antigenen auss....
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Ergebnisse
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Oberflächenmarkern angeborener und adaptiver Immunzellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber in einem Modell der Diät-induzierten NASH isoliert sind. Bei diesem Modell wurde NASH durch die Verabreichung von HFD plus Saccharose (6%) induziert. 7 bis 15 Wochen im Trinkwasser in C57Bl/6J Mäuse, wie zuvor berichtet 13. Wichtig ist, dass Mäuse in halbsterilen Bedingungen untergebracht waren und daher während des gesamten Expe.......
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Diskussion
Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hinaus w.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des "BCRT-Stipendiums" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 &Mikro; M-Zell-Siebe | Falcon | 352340 | |
| 1 mL Spritze | BD | ||
| 26 G x 5/8 Nadeln | BD | ||
| 35 mm Petrischalen | Falcon | 353001 | |
| 40 & Mikro; M-Zell-Siebe | Falcon | 352340 | |
| ACK-Lysepuffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Kat. Nr. 103127) |
| Analysesoftware | FlowJo 10.0.8 Software | ||
| APC Anti-Maus CD11c Antikörper | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Kat. Nr. 117309) |
| APC Anti-Maus KLRG1 (MAFA) Antikörper | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Kat. Nr. 138411) |
| BV421 Anti-Maus CD127 Antikörper | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Kat. Nr. 135023) |
| BV421 Anti-Maus F4/80 Antikörper | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Kat. Nr. 123131) |
| BV605 Anti-Maus CD279 (PD-1) Antikörper | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Kat. Nr. 135219) |
| BV605 Anti-Maus NK-1.1 Antikörper | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Kat. Nr. 108739) |
| BV650 Anti-Maus/humaner CD11b-Antikörper | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Kat. Nr. 101239) |
| BV711 Anti-Maus/Mensch B220 Antikörper | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Kat. Nr. 103255) |
| BV785 Anti-Maus CD8a Antikörper | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Kat. Nr. 100749) |
| C57Bl/6J Mäuse, männlich, 5 Wochen alt | Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätä tsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Kollagenase NB 4G Geprüfte Qualität | SERVA | ||
| Kollagenase Typ I | Worthington | ||
| Konisches Zentrifugenröhrchen 15mL | Falcon | 352096 | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | ||
| Fötales Rinderserum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µ M | Zelltrics | ||
| FITC Anti-Maus CD3 Antikörper | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Kat. Nr. 100203) |
| Durchflusszytometrie | BD-LSR Fortessa | ||
| Pinzette | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytische GmBH | 085021-0500 | |
| Fettreiche Ernährung | SSNIF | E15741– 34 | 60 kJ% aus Fett, 19 % kJ% aus Proteinen und 21 kJ% aus Kohlenhydraten |
| Mikro-Präparierschere | Sigma-Aldrich | S3146 | wird zum Sezieren verwendet |
| PE Anti-Maus CD25 Antikörper | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Kat. Nr. 101903) |
| PE/Cy7 Anti-Maus CD62L Antikörper | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Kat. Nr. 104417) |
| PE/Cy7 Anti-Maus I-A/I-E (MHCII) Antikörper | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Kat. Nr. 107629) |
| PE/Dazzle 594 Anti-Maus CD4 Antikörper | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Kat. Nr. 100565) |
| Percoll-Lösung | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 Anti-Maus CD44 Antikörper | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Kat. Nr. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 Anti-Maus Gr-1 Antikörper | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Kat. Nr. 108427) |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 12559069 | |
| Röhrchen mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX Anti-Maus CD16/32 | Biolegende | 101301 | AB_312800 (BioLegend Kat. Nr. 101301) |
| Trypanblau | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixierbares Viabilitätskit | Biolegend | 423105 | Viablitätsfleck |
Referenzen
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
