Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.
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Methodenartikel
Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.
Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.
Einleitung
Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.
Das Fettgewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Adipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen. Während des Fortschritts der Fettleibigkeit können Veränderungen in der Anzahl und Aktivität von Immunzellen zu einer minderwertigen Entzündung des hypertrophischenFettgewebes 3,4führen. Konkret wurde festgestellt, dass eine übermäßige Energieaufnahme, begleitet von chronisch erhöhten Blutzuckerwerten, Triglyceriden und freien Fettsäuren, zu Adipozyten-Hypoxie, endoplasmatischer Retikelstress, beeinträchtigter Mitochondrien-Funktion und Verstärkten die Cytokin-Sekretion, was zur Aktivierung von entzündungshemmenden Fettzellen5,6führt. Die bisherigen Forschungen haben sich vor allem auf die angeborene Immunität konzentriert, aber in jüngerer Zeit haben sich adaptive Immunzellen (T und B-Zellen) als wichtige Regulatoren der Glukose-Homöostase herausgebildet. Sie verfügen über entzündliche Funktionen (einschließlich CD8+ T-Zellen, Th1 und B-Zellen) oder vor allem über regulatorische Funktionen (einschließlich regulatorischer T (Treg) Zellen, Th2-Zellen) und können sowohldie Insulinresistenz von7,8 verschärfen noch schützen. , 9. September
Darüber hinaus wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, um zu erklären, wie Fettleibigkeit die Steatohepatitis erhöht, einschließlich der erhöhten Produktion von Zytokinen durch Fettgewebe 10. NASH, die fortschreitende Form der alkoholfreien Fettlebererkrankung und eine große gesundheitliche Belastung in den Industrieländern, ist histologisch durch aufgeblasene Hepatozyten, Fettansammlungen, Fibrose und pericelluläre Entzündungen gekennzeichnet und kann sich fortentwickeln, um Zirrhose, Lebererkrankung im Endstadium oder hepatokelluläres Karzinom. Mehrere Regimen (zum Beispiel die Methion-und Cholin-Mangelnahrung 11) sind dafür bekannt, dass sie in nicht-menschlichen Tiermodellen eine NASH-ähnliche Leberpathologie hervorrufen, aber die meisten dieser Ansätze rekapitulieren die menschlichen Bedingungen der NASH und ihrer Stoffwechsels nicht. Konsequenzen, da sie entweder einen spezifischen Genknockout, nicht-physiologische Ernährungsmanipulationen oder keine Insulinresistenz erfordern, die typisch für die menschliche NASH ist. Darüber hinaus basiert unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Stoffwechselerkrankungen derzeit auf Experimenten, die mit Labormäusen durchgeführt werden, die unter den üblichen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht sind. Diese Barriereanlagen sind ungewöhnlich hygienisch und berücksichtigen nicht die mikrobielle Vielfalt, auf die der Mensch stoßen muss, was für Schwierigkeiten im Übersetzungsprozess von Tierstudien zu klinischen Ansätzen 12, 13 verantwortlich sein kann. , 14.
Um die verschiedenen Immunzelluntergruppen in Fettgewebe und Leber bei der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH in einem fortgeschrittenen Mausmodell zu untersuchen, das menschliche Immunbedingungen reproduziert, wurden Mäuse in einzelnen Käfigen in halbsterilen Bedingungen ohne Barriere. Mäuse, die unter Antigen-exponierten Bedingungen untergebracht waren, entwickelten bereits nach 15 Wochen fettreicher Ernährung(HFD) eine NASH-ähnliche Leberpathologie. Im Vergleich zu altersgerechten SPF-Mäusen entwickelten sie makrovesikuläre Steatose, Leberinfiltration und Aktivierung von Immunzellen.
Dieses Manuskript beschreibt eine robuste Strömungszytometrie-Analyse, um Immunzellen-Teilmengen aus dem Fettgewebe und der Leber der Maus in einem Modell von NASH zu definieren und zu zählen. Die Strömungszytometrie-Analyse ermöglicht die Ermittlung mehrerer Parameter einzelner Zellen gleichzeitig im Gegensatz zu RT-PCR oder Immunhistochemie-Ansätzen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie ein Mausmodell der kurzfristigen HFD zur Untersuchung der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH sowie den zugrundeliegenden Mechanismen bietet, die auch die Treue zum menschlichen Zustand aufweisen.
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der Nationalen Gesundheitsinstitute und des Tierschutzgesetzes unter der Aufsicht unseres institutionellen Tierschutzausschusses durchgeführt. Die Tierprotokolle wurden nach institutionalethischen Richtlinien der Charité Berlin durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt und entsprechen den ARRIVE-Richtlinien.
1. Diät-induziertes Tiermodell der Steatohepatitis
- Im Alter von 4 Wochen Mäuse (C57Bl/6J) auf Nicht-SPF-Gehäuse übertragen und kontinuierlich einer breiten Palette von Umweltpathogens-und Antigenen aussetzen. Die Exposition durch den täglichen Umgang mit den Labortieren als Antigene garantieren, wird auf diese Weise durch die Luftpassage verteilt.
- Halten Sie Mäuse (C57Bl/6J, männlich, 12 Wochen alt) in offenen Käfiersystemen mit herkömmlichen Filtern auf einem 12 h hellen/dunklen Zyklus bei einer Temperatur von 22 ° C. Bestrahlen Sie nicht oder autoklavische experimentelle Diät und Bettwäsche. Zugang zu Tierheim ohne Maske oder Haarnetz. Offene Türen zwischen Tierräumen. Keine Luftdusche.
- Garantieren Sie den täglichen Umgang mit den Labortieren und Schalterräumen regelmäßig, so dass Antigene durch die Luftpassage verteilt werden. Ergänzen Sie schmutziges Gehäuse mit täglich unspezifischer mikrobieller Exposition gegenüber Antigenen aus der Bettzeuge von Säugetiertieren, die in den Räumen neben den Labormäusen untergebracht sind.
- Gemessen von den Proportionen von CD44-CD62L- Effektorspeicher CD4 + und CD8+ T-Zellen im Blut und Milz mit Fließzytometrie(wie in der Refefence 13 beschrieben).
NOTE: In diesem Zusammenhang haben wir einen Anstieg der Effektorspeicher CD8+ T-Zellen aus CD8 + T-Zellen um 20% als Beleg für eine ausreichende mikrobielle Exposition definiert. - Start HFD (60 kJ% von Fett, 19 kJ% von Proteinen und 21 kJ% aus Kohlenhydraten und Ad-Libitum-Verbrauch von Wasser mit 6% Saccharose-Gehalt mit fünf Wochen alten C57Bl/6J männlichen Mäusen für 7-15 Wochen. Die HRFD sollte 60% kJ aus Fett enthalten (wie oben beschrieben), um die Entwicklung der Insulinresistenz während des gesamten Experiments zu fördern.
NOTE: Die Hematoxyl-Färbung sollte durchgeführt werden und histologische Merkmale wie Hepatocyte-Ballononing, Mallory-Denk-Körper, Immunzellinfiltration und makroväsikuläre Steatose müssen gefunden werden, um NASH-ähnliche Leberpathologie zu demonstrieren (wie in Bezug auf die Referenz gezeigt 13).
2. Vorbereitung von Reagents und Lösungen
- Bereiten Sie 70% Ethanol, Phosphat-gepuffertes Salz (PBS, ohne Kalzium und Magnesium), ergänzt um 0,5% BSA und ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysepuffer.
-
Stauender Puffer
- Lösen Sie 10 ml fetales Kalbsserum (FCS) in 500 ml PBS auf, um 2% FCS PBS zu erhalten. Stellen Sie den Färbepuffer vor dem Gebrauch auf Eis.
- Ladelösung in einer Plastikflasche bei 4 ° C.
-
Kollagen-Lösung für Fettgewebe-Verdauung
- Lösen Sie 2,5 g Rinder-Serum Albumin (BSA) in 500 ml PBS auf, um eine 0,5% BSA/PBS zu erhalten.
- Lösen Sie 74.5 g CaCl2 in 10 mL von 0,5% BSA/PBS auf, um eine 10 mM CaCl2-Lösung zu erhalten.
- Fügen Sie 1 mg Kollagenase Typ II (siehe Materialtabelle) zu jedem ml von 0,5% BSA mit 10 mM CaCl2 PBS hinzu.
- Bereiten Sie 3 mL Collagenase Verdauungslösung pro g Fettgewebeprobe. Bereiten Sie für jede Isolierung eine neue Collagenase-Lösung vor.
-
Kollagenaulösung für die Verdauung von Lebergewebe
- Lösen Sie 2,5 g BSA in 500 ml Hank ́s Balanced Salt Solution (HBSS), um 0,5% BSA HBSS zu erhalten.
- Fügen Sie 10 ml FCS in 500 mL von 0,5% BSA/HBSS hinzu, um 2% FCS 0,5% BSA/HBSS zu erhalten.
- Fügen Sie 0,5 mg Kollagenase Typ IV (siehe Materialtabelle) zu jedem ml von 2% FCS 0,5% BSA/HBSS hinzu.
- Fügen Sie 0,02 mg DNase pro ml von 2% FCS 0,5% BSA/HBSS Kollagenase-Lösung hinzu.
- Bereiten Sie 13 ml Collagenase Verdauungslösung pro Lebergewebeprobe.
- Bereiten Sie für jede Isolierung eine neue Collagenase-Lösung vor.
3. Generation von Einzelzellensuspensionen
-
Fettgewebe-Verdauung
- Die Mäuse mit der Isofluranässeanästhesie mit anschließender Verwerfung mit Mäusen beweihen. Die Brust mit 70% Ethanol besprühen. Machen Sie vorsichtig einen 5-6 cm großen Zentralschnitt durch die integumente und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz zu entlarven.
NOTE: Schädigen Sie die zugrunde liegenden Organe nicht und halten Sie die Spitzen der Schere hoch. - Mit einer 26 G-Nadel mindestens 10 ml von 0,9% Salzlösung in die Spitze der linken Herzkammer einspritzen.
NOTE: Eine erfolgreiche Perfusion wird durch Leberblanchieren festgestellt. - Öffnen Sie die Peritonealhöhle mit einer Schere und schneiden Sie die perigonadalen Fettpolster auf jeder Seite mit fein gebogenen Scheren aus. Gonadengewebe mit fein gebogener Schere abschneiden und Fettgewebe wiegen.
- Führen Sie die mechanische Dissoziation mit der Schere durch und schneiden Sie Fettgewebe in einer Petrischale bei 4 ° C in feine Stücke. Das Fettgewebe auf 50 ml konische Zentrifugenröhren übertragen und die Petrischale mit 1 ml von 0,5% BSA/PBS abspülen.
- Fügen Sie 3 ml Fettgewebe-Verdauungslösung (wie in Schritt 2.3 vorbereitet) pro Gramm Fettgewebe hinzu. Inkubate Fettgewebslösung bei 37 ° C für 20 min bei sanftem Schütteln (200 U/min).
- 5 ml von 0,5% BSA/PBS pro Gramm Fettgewebe hinzufügen und auf Eis legen. Die Lösung mehrmals mit einer 10 mL serologischen Pipette verungern und mit Hilfe eines Kolbens durch einen Sieb (100 μm) passieren.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die schwimmende Adipozytenfraktion durch Pipettieren. Das Zellpellet (stromal vascular fraction) wird in 1 mL ACK-Lysepuffer wiederhergestellt (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 10 ml von 2% FCS PBS hinzu.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Decant supernatant und wiederbelebt Zell-Pellets in 250 μL von 2% FCS PBS.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan blauen Ausschluss.
- Die Mäuse mit der Isofluranässeanästhesie mit anschließender Verwerfung mit Mäusen beweihen. Die Brust mit 70% Ethanol besprühen. Machen Sie vorsichtig einen 5-6 cm großen Zentralschnitt durch die integumente und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz zu entlarven.
-
Verdauung des Lebergewebes
- Leber in einem konischen Zentrifugenrohr aufbewahren, das mit PBS gefüllt ist und auf Eis transportiert wird.
- Führen Sie die mechanische Dissoziation mit Spritzenstempeln in einer Petrischale bei 4 ° C durch. Lebergewebe in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml warmer Leberverdauungslösung geben. Die Petrischale mit 3 ml Leberverdauungslösung abspülen.
- Inkubate Lebergewebelösung bei 37 ° C für 20 min bei sanftem Schütteln (200 U/min).
- 20 ml HBSS hinzufügen. Die Lösung mehrmals mit einer 10 mL serologischen Pipette verungern und mit Hilfe eines Kolbens durch einen Sieb (100 μm) passieren.
- Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Decant den Supernatant und rettet das Zellpellet in 20 ml HBSS wieder.
- Zentrifuge bei 30 x g für 1 min bei Raumtemperatur, um die Hepatocyte-Matrix zu entfernen. Das Zellpellet abwerfen.
- Zentrifuge den Supernatant bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 mL mit 33% niedriger Viskositätsdichte gradierender Mittellösung (siehe Materialtabelle) in HBSS wiederbeleben, gefolgt von Zentrifugation ( 800 x g; 30 min; Raumtemperatur; keine Bremse).
- Das Pellet in 1 mL ACK-Lysetepuffer wiederzubeleben und bei Raumtemperatur für 4 min inkubieren. Dann 10 ml HBSS hinzufügen.
NOTE: Um das Supernatante mit Interphase (Hepatozyten) sehr vorsichtig mit einer Transferpipette zu verwerfen (so viel wie möglich, ohne das Pellet mit Immunzellen und Erythrozyten zu nehmen). - Lassen Sie die Zellen durch einen 30-μm-Trog in einem 15 mL konischen Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4 ° C. Decant supernatant und wiederbelebt Zell-Pellets in 250 μL von 2% FCS PBS.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan blauen Ausschluss.
4. Oberflächengeständung
- Bereiten Sie eine Antikörper-Mischung für T-Zell-Subsets (Panel 1) und angeborene Immunzellen (Panel 2), wie sie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben sind. Die Volumes sind für eine Probe (100 μL) hinsichtlich Antikörperkonzentrationen optimiert.
NOTE: Lymphozyten und angeborene Immunzellen stellen Unterschiede in der Autofluoreszenz auf und sollten separat analysiert werden. - Verwenden Sie bis zu 3 x 106 Zellen in 100 μL in einem Polystyrol-FACS-Rohr zur Oberflächenfärbung. Um Fc-Rezeptoren zu blockieren, fügen Sie 10 μL Anti-CD16/CD32-Antikörper (verdünnt 1:100) und Inkubat für 10 Minuten auf Eis. Verwenden Sie eine unbefleckte negative Kontrollprobe, um die Seitenstreuung (SSC) und die Vorwärtsstreuung (FSC) anzupassen, um den Standort der negativen Zellpopulation zu bestimmen.
- Wirbel und das passende Antikörper-Gemisch für Panel 1 und Panel 2 hinzufügen. Fügen Sie jeder Probe 1 μL Viabilitätsfarbe hinzu, um eine Diskriminierung von lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. 20 min bei 4 ° C und lichtgeschützt.
- Zwei Mal mit 2 mL von 2% FCS PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C waschen.
- Das Zellpellet in 300 μL von 2% FCS PBS wiederverwenden und bis zur FACS-Analyse bei 4 ° C speichern.
NOTE: Vor dem Start der Messung werden die Zellen durch 30 μm Zell-Trost in das Polystyrol-FACS-Rohr und den Wirbel geleitet. Die Strömungszytometrie wurde mit beschrifteten Zellen durchgeführt, die in 2% FCS PBS bei 4 ° C für 1-3 h gespeichert waren. Zellen sollten so schnell wie möglich auf optimierte Ergebnisse analysiert werden.
5. Flow Cytometry Compensation, Acquisition und Gating
- Führen Sie eine nicht gefärbte negative Kontrollprobe aus, um den FSC und den SSC einzustellen und die Spannungen des Strömungszytometers anzupassen, um Leukozyten-Populationen zu erkennen und zwischen Schmutz und lebensfähigen Zellen zu unterscheiden. Schutt und abgestorbene Zellen ausschließen.
NOTE: Die Durchlässigkeit der Zellsuspensionen aus der Leber könnte geringer sein als die Lebensfähigkeit der Zellsuspensionen aus perigonadalem Fettgewebe aufgrund eines zusätzlichen Dichte-Trennschrittes. - Führen Sie einzelne gebeizte Kontrollmuster für die Mehrfarbenkompensation aus.
NOTE: Antikörper-Erfassungsperlen könnten auch verwendet werden, um sich auf spektrale Überschneidungen einzustellen, wenn die Anzahl der Zellen einer Zellpopulation zu niedrig ist, um die Verwendung von Zellen auszugleichen. Um mögliche Autofluoreszenzsignale der Zellen zu erkennen, werden Fluoreszenzsignale minus eine (FMO)-Steuerung für jeden Antikörper empfohlen, die aber in diesem Protokoll nicht angewendet wurden. - Starten Sie die Messung, sammeln Sie eine angemessene Anzahl von Ereignissen (mindestens 50.000 Ereignisse) und erfassen Sie experimentelle Daten.
- Exportieren Sie FCS-Dateien zur Analyse und setzen Sie die Gating-Strategie. Gate auf CD45+ Leukozyten, um nachfolgende Zellpopulationen zu identifizieren.
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Ergebnisse
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Oberflächenmarkern angeborener und adaptiver Immunzellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber in einem Modell der Diät-induzierten NASH isoliert sind. Bei diesem Modell wurde NASH durch die Verabreichung von HFD plus Saccharose (6%) induziert. 7 bis 15 Wochen im Trinkwasser in C57Bl/6J Mäuse, wie zuvor berichtet 13. Wichtig ist, dass Mäuse in halbsterilen Bedingungen untergebracht waren und daher während des gesamten Expe...
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Diskussion
Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hinaus w...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des "BCRT-Stipendiums" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 &Mikro; M-Zell-Siebe | Falcon | 352340 | |
| 1 mL Spritze | BD | ||
| 26 G x 5/8 Nadeln | BD | ||
| 35 mm Petrischalen | Falcon | 353001 | |
| 40 & Mikro; M-Zell-Siebe | Falcon | 352340 | |
| ACK-Lysepuffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Kat. Nr. 103127) |
| Analysesoftware | FlowJo 10.0.8 Software | ||
| APC Anti-Maus CD11c Antikörper | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Kat. Nr. 117309) |
| APC Anti-Maus KLRG1 (MAFA) Antikörper | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Kat. Nr. 138411) |
| BV421 Anti-Maus CD127 Antikörper | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Kat. Nr. 135023) |
| BV421 Anti-Maus F4/80 Antikörper | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Kat. Nr. 123131) |
| BV605 Anti-Maus CD279 (PD-1) Antikörper | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Kat. Nr. 135219) |
| BV605 Anti-Maus NK-1.1 Antikörper | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Kat. Nr. 108739) |
| BV650 Anti-Maus/humaner CD11b-Antikörper | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Kat. Nr. 101239) |
| BV711 Anti-Maus/Mensch B220 Antikörper | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Kat. Nr. 103255) |
| BV785 Anti-Maus CD8a Antikörper | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Kat. Nr. 100749) |
| C57Bl/6J Mäuse, männlich, 5 Wochen alt | Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätä tsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Kollagenase NB 4G Geprüfte Qualität | SERVA | ||
| Kollagenase Typ I | Worthington | ||
| Konisches Zentrifugenröhrchen 15mL | Falcon | 352096 | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | ||
| Fötales Rinderserum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µ M | Zelltrics | ||
| FITC Anti-Maus CD3 Antikörper | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Kat. Nr. 100203) |
| Durchflusszytometrie | BD-LSR Fortessa | ||
| Pinzette | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytische GmBH | 085021-0500 | |
| Fettreiche Ernährung | SSNIF | E15741– 34 | 60 kJ% aus Fett, 19 % kJ% aus Proteinen und 21 kJ% aus Kohlenhydraten |
| Mikro-Präparierschere | Sigma-Aldrich | S3146 | wird zum Sezieren verwendet |
| PE Anti-Maus CD25 Antikörper | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Kat. Nr. 101903) |
| PE/Cy7 Anti-Maus CD62L Antikörper | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Kat. Nr. 104417) |
| PE/Cy7 Anti-Maus I-A/I-E (MHCII) Antikörper | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Kat. Nr. 107629) |
| PE/Dazzle 594 Anti-Maus CD4 Antikörper | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Kat. Nr. 100565) |
| Percoll-Lösung | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 Anti-Maus CD44 Antikörper | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Kat. Nr. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 Anti-Maus Gr-1 Antikörper | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Kat. Nr. 108427) |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 12559069 | |
| Röhrchen mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX Anti-Maus CD16/32 | Biolegende | 101301 | AB_312800 (BioLegend Kat. Nr. 101301) |
| Trypanblau | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixierbares Viabilitätskit | Biolegend | 423105 | Viablitätsfleck |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
