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Methodenartikel

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

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DOI:

10.3791/59472

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15. Mai 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.

Zusammenfassung

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung von multiplem Myelom, induzieren Die Ubiquitination und den Abbau der lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3) über den Cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase für den proteasomalen Abbau. IMiDs wurden vor kurzem für die Erzeugung von bifunktionaler Proteolyse verwendet, die auf Chimären (PROTACs) abzielt, um andere Proteine zur Ubiquitination und proteasomalen Degradation durch die CRBN E3 Ligase zu zielen. Wir haben pomalidomidbasierte homobifunktionelle PROTACs entwickelt und synthetisiert und ihre Fähigkeit analysiert, eine selbstgesteuerte Ubiquitination und Abbau von CRBN zu induzieren. Hier dient CRBN als beides, die E3-Ubiquitinligase und das Ziel zugleich. Die homo-PROTAC Verbindung 8 degradiert CRBN mit einer hohen Potenz mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf IKZF1 und IKZF3. Die CRBN-Inaktivierung durch Verbindung 8 hatte keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit und proliferation verschiedener multipler Myelom-Zelllinien. Dieser Homo-PROTAC hebt die Wirkung von IMiDs in mehreren Myelomzellen auf. Daher können unsere homodimeren Pomalidomid-basierten Verbindungen helfen, die endogene Substrate und physiologischen Funktionen von CRBN zu identifizieren und den molekularen Mechanismus von IMiDs zu untersuchen.

Einleitung

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle für die Behandlung von multiplem Myelom zugelassen, binden an die E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), ein Substratadapter für cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Die Bindung von IMiDs erhöht die Affinität von CRL4CRBN zu den lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3), was zu ihrer Ubiquitination und Degradation führt (Abbildung 1)4,5, 6 , 7 , 8. Da IKZF1 und IKZF3 für mehrere Myelomzellen unerlässlich sind, führt ihre Inaktivierung zu einer Wachstumshemmung. SALL4 wurde vor kurzem als zusätzliches IMiD-induziertes Neosubstrat von CRBN gefunden, das wahrscheinlich für die Teratogenität und die sogenannte Contergan-Katastrophe in den 1950er Jahren verantwortlich ist, die durch Thalidomid9,10verursacht wurde. Im Gegensatz dazu ist Caseinkinase 1 (CK1) ein Lenalidomid-spezifisches Substrat von CRBN, das in die therapeutische Wirkung beim myelodysplastischen Syndrom mit Chromosom 5q Deletionen11verwickelt ist.

Die Fähigkeit von Kleinmolekülen, ein bestimmtes Protein für den Abbau zu zielen, ist eine spannende Implikation für die moderne Arzneimittelentwicklung. Während der Mechanismus von Thalidomid und seinen Analoga nach ihrer ersten Anwendung beim Menschen entdeckt wurde, wurden so genannte Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) speziell für ein Protein von Interesse (POI) entwickelt (Abbildung 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die aus einem spezifischen Liganden für den POI bestehen, der über einen Linker mit einem Liganden einer E3-Ubiquitinligase wie CRBN oder von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20verbunden ist. 21,22. PROTACs induzieren die Bildung eines transienten ternären Komplexes, der das POI auf die E3-Ubiquitinligase lenkt, was zu seiner Ubiquitination und proteasomalen Degradierung führt. Der Hauptvorteil von PROTACs gegenüber herkömmlichen Inhibitoren besteht darin, dass die Bindung an ein POI ausreichend ist und nicht seine Hemmung, und daher können PROTACs potenziell auf ein weit breiteres Spektrum von Proteinen abzielen, einschließlich derer, die als undruggable wie Transkriptionsfaktoren15. Darüber hinaus wirken chimäre Moleküle katalytisch und haben daher eine hohe Potenz. Nach der Ubiquitin-Übertragung in die POI löst sich der ternäre Komplex und steht für die Bildung neuer Komplexe zur Verfügung. Somit reichen sehr niedrige PROTAC-Konzentrationen für den Abbau des Zielproteins23aus.

Hier beschreiben wir die Synthese eines Pomalidomid-Pomalidomid konjugierten homo-PROTAC (Verbindung 8), das CRBN für die Degradierung von sich selbst rekrutiert24. Die E3 ubiquitin ligase CRBN dient sowohl als Recruiter als auch als Ziel zugleich (Abbildung 3). Um unsere Daten zu validieren, synthetisierten wir auch eine negative Bindungskontrolle (Verbindung 9). Unsere Daten bestätigen, dass der neu synthetisierte Homo-PROTAC spezifisch für den CRBN-Abbau ist und nur minimale Auswirkungen auf andere Proteine hat.

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Protokoll

1. Herstellung von PROTAC-Molekülen

VORSICHT: Bitte beachten Sie vor der Verwendung alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesen Synthesen verwendeten Chemikalien sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung.

  1. Zubereitung von tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbam (Verbindung 1)
    1. 1,1'-Carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) und eine katalytische Menge von 4-(Dimethylamino)pyridin (5 mg) in eine Mischung aus Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 ml) in 100 ml rund um den Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Bei Reflux 10 h unter Rühren erhitzen, bis sich eine klare Lösung bildet.
    2. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer, fügen Sie EtOAc (200 ml) hinzu und geben Sie es in einen Trenntrichter. Die organische Schicht mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) waschen und über Na2SO4trocknen.
    3. Filtern Sie die Lösung durch ein kurzes Pad Kieselgel (5 cm Durchmesser und 5 cm Höhe) und eluieren Sie mit einem weiteren Volumen (200 ml) von EtOAc.
    4. Verdampfen Sie das Lösungsmittel und trocknen Sie den erhaltenen farblosen Feststoff im Vakuum.
  2. Herstellung von tert-butyl N-(1-methyl-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamat (Verbindung 2)
    1. Kombinieren Sie Verbindung 1 (2,28 g, 10 mmol) mit gemahlenem Kaliumcarbonat (2,76 g, 20 mmol) und DMF (25 ml) in einem 100 ml runden Bodenkolben. Iodomethan (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) tropfenweise mit einer Spritze hinzufügen und den Kolben mit einem durchlöcherten Gummiseptum ausstatten. Legen Sie das Reaktionsgefäß für 2 h in ein Ultraschallbad.
    2. Das Reaktionsgemisch mit EtOAc (100 ml) verdünnen und in einen Trenntrichter geben. Die organische Schicht mit 1 N NaOH (2x 25 ml), H2O (25 ml) und Salzlake (25 ml) waschen und über Na2SO4trocknen.
    3. Filtern und verdampfen Sie das Lösungsmittel. Reinigen Sie das Produkt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (6 cm Säulendurchmesser und 20 cm Höhe) mit Erdölether/EtOAc (2:1).
  3. Herstellung von 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-Fluorisoindoline-1,3-dion (Verbindung 3)
    1. Kombinieren Sie 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), Glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) und eine Lösung von Natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) in Eisessigsäure (20 ml) in einem 50 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und ausgestattet mit einem Refluxkondensator. Das Gemisch bei 120 °C 6 h erhitzen.
    2. Nach dem Abkühlen die violette Mischung auf H2O (100 ml) gießen und 10 min rühren. Den gebildeten Feststoff durch Filtration sammeln, mit H2O (3 x 5 ml) und Petrolether (3 x 5 ml) waschen und im Vakuum trocknen.
  4. Herstellung von 4-Fluor-2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dion (Verbindung 4)
    1. Kombinieren Sie 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), Glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) und eine Lösung von Natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) in Eisessigsäure (20 ml) in einem 100 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Das Gemisch bei 120 °C 6 h erhitzen.
    2. Nach dem Abkühlen die violette Mischung auf H2O (100 ml) gießen und 10 min rühren. Den gebildeten Feststoff durch Filtration sammeln, mit H2O (3 x 5 ml) und Petrolether (3 x 5 ml) waschen und im Vakuum trocknen.
  5. Herstellung von tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamat (Verbindung 7)
    1. 50 ml runder Bodenkolben mit tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbam (5, 0.41 g, 1.65 mmol), Compound 3 (0.41 g, 1.50 mmol), trocken DMF (10 mL) und DIPEA (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol) aufladen. Mit rührstange und refluxkondensator ausstatten. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 10 h erhitzen.
    2. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Die kombinierten organischen Schichten mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) waschen, über Na2SO4trocknen, filtern und im Vakuum konzentrieren.
    3. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 60 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:1 bis 1:2).
  6. Zubereitung von Homodimer (Verbindung 8)
    1. Kombinieren Sie den ,,-Diamine-Linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) und eine Lösung von 3 (0,83 g, 3,00 mmol) in trockenem DMSO (20 ml) in einem 50 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 18 h erhitzen.
    2. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Die kombinierten organischen Schichten mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) trocknen, über Na2SO4trocknen und im Vakuum konzentrieren.
    3. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 50 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:2) zu EtOAc.
  7. Herstellung von Heterodimer (Compound 9)
    1. Auflösen 7 (0,83 g, 1,65 mmol) in trockenER CH2Cl2 (10 ml). Trifluoressigsäure (10 ml) zugeben und die gelbe Mischung bei 40 °C für 2 h in einem geschlossenen 50 ml runden Bodenkolben rühren.
    2. Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe und koevaporate mit CH2Cl2 (4x 5 ml). Den Rückstand im Vakuum 10 h trocknen.
    3. Lösen Sie das Material in trockenem DMF (20 ml) auf. Fügen Sie Verbindung 4 (0,44 g, 1,50 mmol) und DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) hinzu und statten Sie den Kolben mit einem Refluxkondensator aus. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 10 h erhitzen.
    4. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Waschen Sie die kombinierten organischen Schichten mit gesättigten NaHCO3 (50 ml), H2O (50 ml), 10% KHSO4 (50 ml), H2O (50 ml) und Sole (50 ml), trocknen über Na2SO4,filtern und konzentrieren im Vakuum.
    5. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 50 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:2) zu EtOAc.
    6. Molekülstruktur aufklären und verifizieren (Abbildung 5A Verbindung 8, 5B Verbindung 9) durch 1H NMR und 13C NMR Spektren in DMSO-d6 auf einer Kernspinresonanz (NMR) Spektrometer. Prüfen Sie, ob die Reinheit beider Verbindungen mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) höher als 97 % ist, indem Sie eine Dioden-Array-Erkennung (DAD) bei 220–500 nm anwenden.

2. Funktionelle Validierung von PROTAC-Molekülen

  1. Western Blot Analyse der CRBN-Degradation durch PROTACs
    ANMERKUNG: Die Wirkungen von8und Verbindung9auf CRBN-Proteinspiegel wurden durch Western-Blot-Analyse getestet. Darüber hinaus konnten auch die Auswirkungen auf die IkZF1- und IKZF3-Werte bestätigt werden (Abbildung 6).
    1. Probenvorbereitung
      1. Lösen Sie die Verbindungen 8 und 9, Lenalidomid (Len), Pomalidomid (Pom), MG132 und MLN-4924 in DMSO in einer Konzentration von 10 mM, aliquot und lagern Bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung.
      2. Samen 1 x 106 MM1S-Zellen in einer 6-Well-Platte mit 2,5 ml Medien und behandeln Zellen mit 100 nM oder 1 m Verbindung 8 oder 9 für 24 h.
      3. Erntezellen nach der Behandlung und Zentrifuge bei 700 x g,5 min, 4 °C. Waschen Sie Zellpellet mit kalten 1x PBS, um restliche Medien, Zentrifuge bei 700 x g, 5 min, 4 °C zu entfernen und Überstand zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
      4. Lysezellen im Lysepuffer (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% Glycerin, 1x Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail) für 10 min auf Eis, Zentrifuge bei 320 x g für 10 min, 4 °C. Ernte überstand und bestimmen Die Proteinkonzentration durch einen Bicinchoninsäure-Protein-Assay (BCA-Assay) nach dem Herstellerprotokoll.
      5. Denatur-Proteine (15–30 g/Probe) mit 1x LDS-Ladepuffer (5% 2-Mercaptoethanol) und kochen 10 min, 75 °C.
    2. SDS-PAGE
      1. Fix-Gel-Sandwich mit 10% Trenngel [4 ml 3x Gelpuffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,45), 4 ml Acrylamid 30%, 2,52 ml Glycerin 50%, 1,395 mL H2O, 75 x L 11% Ammoniumpersulfat (APS) und 9,75 l TEMED] und ein 4%-Stapelgel [1.992 mL 3x Gelpuffer, 0,792 ml 30% Acrylamid, 3.168 mL H2O, 36 'L 11% APS und 6 'L TEMED] in einer Elektroden-Montageeinheit. Entfernen Sie Kämme, spülen Sie Brunnen mit Kathodenpuffer (100 mM Tris/HCl, 100 mM Tricin, 0.1% (w/v) SDS) und laden Proben.
      2. Anodenpuffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) in den Tank füllen. Eiweißprobe ab Schritt 2.1.1.4 laden und SDS-PAGE bei 70 V, 20 min laufen lassen, gefolgt von 115 V, 150 min bei konstanter Spannung.
    3. Immunoblotting und Detektion von CRBN, IKZF1 und IKZF3
      1. Aktivieren Sie die PVDF-Membran (0,45 m) in 100% Methanol für 1 min. Equilibrate Membran und Trenngel im 1x Transferpuffer [10x Transferpuffer (192 mM Glycine, 25 mM Tris-Base/HCl, 900 mL H2O), 20% Methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Montieren Sie die Blotting-Kassette gemäß dem Herstellerprotokoll. Transfergel bei 180 mA für 90 min.
      3. Membran 3x in 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Blockmembran in 5% fettgetrockneter Milch (NFDM), TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur. Membran 3x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen.
      4. Inkubationsmembran mit Primärantikörper für CRBN (1:500 in 5% BSA, TBS-T) mit sanftem Schütteln bei 4 °C, über Nacht.
      5. Membran 3x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Inkubationsmembran mit Anti-Maus (1:10.000 in 5% NFDM, TBS-T) oder Anti-Kaninchen (1:5.000 in 5% NFDM, TBS-T) sekundärer Antikörper gekoppelt an Meerrettichperoxidase HRP (1 h bei Raumtemperatur.)
      6. Membran 2x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit 1x TBS.
      7. Inkubationsmembran für 2 min mit HRP-Substratlösung nach Herstellerprotokollen und Chemilumineszenz in einem Chemilumineszenzdetektionsgerät erkennen.
      8. Waschen Sie die Membran 1x in 1x TBS für je 5–10 min bei Raumtemperatur. Zur Freisetzung von Antikörpern Streifenmembran in handelsüblichen Abisolierpuffer für 15 min. Waschen Membran 3x in 1x TBS für je 5–10 min bei Raumtemperatur.
      9. Membran in 5% fettgetrockneter Milch, TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur reblockieren. Membran 3x in 1x TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen und mit IKZF1, IKZF3 oder Tubulin nach Schritt 2.1.3.4 erneut sondieren.
  2. Wettbewerbsexperimente mit MG132, MLN4942 oder Pomalidomid
    ANMERKUNG: Um zu bestätigen, ob CRBN über den Ubiquitin-Proteasome-Weg abgebaut wird, führten wir Wettbewerbsexperimente mit dem Proteasomen-Inhibitor MG132 und einem neddylierungsaktivierenden Enzym (NAE)-Inhibitor MLN4942 (Abbildung7) durch.
    1. Samen 1 x 106 MM1S Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte. Pretreat-Zellen mit 10 M MG132, 10 M MLN4942 oder Lenalidomid (100x) und 1 hbei 37 °C, 5% CO2 inkubieren.
    2. 100 nM Verbindung 8 für 3 h bei 37 °C, 5% CO2 hinzufügen.
    3. Erntezellen für Western Blot nach Schritt 2.1.1.
  3. Zelllebensfähigkeits-Assays in mehreren Myelom-Zelllinien
    HINWEIS: Dieser Test wird verwendet, um die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu testen und zusätzlich die Wirkung von IMiDs auf mehrere Myelomzellen durch Vorbehandlung der Zellen mit Verbindung 8 zu veranschlagen (Abbildung 8 , Abbildung 9A,B).
    1. Samen 5 x 104 MM1S-Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte in biologischen Triplicaten für den Lebensfähigkeitstest. Für die Western-Blot-Analyse, Samen 1 x 106 MM1S-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte in biologischen Triplicaten.
    2. Behandeln Sie Zellen mit DMSO oder 100 nM, 1 M oder 10 M Verbindung 8, Verbindung 9 oder Pomalidomid und inkubieren für 24 h, 48 h oder 96 h bei 37 °C, 5% CO2 . Für Rettungsexperimente, behandeln Sie Zellen mit 100 nM Verbindung 8 für 3 h, vor oder nach Zugabe von 1 M Pomalidomid und inkubieren für 96 h.
    3. Messen Sie 96-Well-Plattenlumineszenz mit einem lumineszierenden Zelllebensfähigkeitstest, gemäß dem Herstellerprotokoll auf einem Plattenleser oder Erntezellen aus der 6-Well-Platte für die Western-Blot-Analyse.

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Ergebnisse

Hier beschrieben wir das Design, die Synthese und die biologische Bewertung eines homodimer pomalidomidbasierten PROTAC zur Degradation von CRBN. Unser PROTAC interagiert gleichzeitig mit zwei CRBN-Molekülen und bildet ternäre Komplexe, die selbstallgegenwärtige und proteasomale Abbau von CRBN mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf pomalidomid-induzierte Neosubstrate IKZF1 oder IKZF3 induzieren.

Aus einer Reihe von zuvor v...

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Diskussion

Das Design solcher homo-PROTACs, wie hier für CRBN beschrieben, beruht auf der spezifischen Affinität von Pomalidomid zu CRBN, die in zahlreichen heterobifunktionellen PROTACs erfolgreich eingesetzt wurde und zur Entwicklung von PROTAC 8 als hochgradig selektiven CRBN-Degrader. Die Spezifität unseres Moleküls wurde bereits durch proteomische Analysen bestätigt24. Für genetisch vermittelten Knockout ist der Ausschluss und die Validierung von Nebenwirkungen eine Herausforderung und ...

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Offenlegungen

Einen möglichen finanziellen Interessenkonflikt erklären die Autoren nicht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 und SFB-1074 to J.K.; FOR2372 zu M.G.)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,1'-CarbonyldiimidazolTCI-ChemikalienC0119
2,2′-(Ethylendioxy)-bis(ethylamin)Sigma-Aldrich385506Verbindung 6
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalsäureanhydrid, 98 %Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridin, 99 %Acros148270250Giftiges
Acrylamidstammlö sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABZellsignalisierung15103S
Anti-CRBN-Antikörper, hergestellt in KaninchenSigmaHPA045910
Anti-Kaninchen IgG HRP-gebundener AntikörperSigma7074S
AmmoniumpersulfatRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI-ChemikalienB1649
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Lumineszierender ZellviabilitätsassayPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, wasserfrei, 99,8 %Acros348435000Extra trocken über Molekularsieb
DMSO, wasserfrei, 99,7 %Acros348445000Extra Dry über Molekularsieb
GlycinSigma-Aldrich15523-1L-R
Ziege Anti-Maus (HRP-konjugiert)Santa Cruz Biotechnologiesc-2005
Halt Protease & Phosphatase-Inhibitor Einweg-Cocktail (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab-Zellsignalisierung14859S
ImmobilonP-Transfermembran (0,45µ m)MerckIPVH000010
Iodomethan, 99 %Sigma-AldrichI8507Hochgiftiges
MethanolSigma-Aldrich32213-2,5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini-Trans-Blot-Elektrophorese-TransferzelleBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertikale ElektrophoresezelleBio-Rad1658004
MLN4942Biomol (Cayman)Cay15217-1
Monoklonaler Anti-α-Tubulin-Antikörper, hergestellt in Maus (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamin, 99 %Alfa Aesar A11801
Fettfreies TrockenmilchpulverPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell Weiß PolystyrolplatteThermo Scientific136101
NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
PomalidomidSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping PufferThermo Scientific46430
Natrium DodecylsulfatCarl Roth183.1
NatriumchloridSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamatSigma-Aldrich89761Verbindung 5
TricinCarl Roth6977.4
Trizma-BaseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL SprayAdvanstaK-12049-D50

Referenzen

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Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs
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