Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Protokolle zur Anwendung definierter mechanischer Belastungen auf Mauskälber und zur Überwachung der gleichzeitigen intramuskulären Druckänderungen. Die experimentellen Systeme, die wir entwickelt haben, können nützlich sein, um den Mechanismus hinter den positiven Auswirkungen von körperlicher Bewegung und Massage zu untersuchen.

Zusammenfassung

Massage ist allgemein anerkannt, vorteilhaft für die Linderung von Schmerzen und Entzündungen. Obwohl frühere Studien über entzündungshemmende Auswirkungen der Massage auf die Skelettmuskulatur berichtet haben, sind die molekularen Mechanismen dahinter schlecht verstanden. Wir haben vor kurzem ein einfaches Gerät entwickelt, um lokale zyklische Kompression (LCC) anzuwenden, die intramuskuläre Druckwellen mit unterschiedlichen Amplituden erzeugen kann. Mit diesem Gerät haben wir gezeigt, dass LCC entzündungshemmende Reaktionen von Makrophagen in situ moduliert und immobilisierungsinduzierte Muskelatrophie lindert. Hier beschreiben wir Protokolle zur Optimierung und Anwendung von LCC als massageähnliche Intervention gegen immobilisierungsinduzierte Entzündungen und Atrophie der Skelettmuskulatur von Maushinterbleibs. Das Protokoll, das wir entwickelt haben, kann nützlich sein, um den Mechanismus zu untersuchen, der den positiven Auswirkungen körperlicher Bewegung und Massage zugrunde liegt. Unser experimentelles System bietet einen Prototyp des analytischen Ansatzes zur Aufklärung der mechanischen Regulation der Muskelhomöostase, obwohl eine Weiterentwicklung für umfassendere Studien erforderlich ist.

Einleitung

Massage ist allgemein anerkannt, vorteilhaft für Schmerzlinderung und Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit bei Leistungssportlern und Nicht-Athleten gleichermaßen^1,2. In der Tat, frühere Studien haben gezeigt, dass Massage unterdrückt lokale Entzündung³ und fordert Erholung von der Post-Übung Muskelschäden^4,5. Molekulare Mechanismen, die den positiven Wirkungen der Massage zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt.

Eine der Schwierigkeiten bei der mechanistischen Untersuchung der Massage betrifft die Reproduzierbarkeit experimenteller Techniken, mit denen massageähnliche Eingriffe getestet werden. In früheren Studien, experimentelle Verfahren, die Massage imitieren meist die Anwendung von körperlichen Eingriffen mit Denkörpern der Praktiker, wie Handflächen und Finger^6,7,8. Dies macht es schwierig, ihre Größe, Häufigkeit, Dauer und Ihren Modus genau zu reproduzieren.

Viele Geräte wurden entwickelt, um definierte mechanische Belastungen auf das Zielgewebe anzuwenden. Zeng et al. haben beispielsweise ein pneumatisches System für die längenweise mechanische Belastung der Hinterbeine von Ratten⁹ entwickelt und Wang et al. haben ein mechatronisches Gerät entwickelt, das massageähnliche mechanische Belastungen auf Hinterbeine von Ratten und Kaninchen mit Echtzeit-Feedback-Steuerung¹⁰. Im Vergleich zu ihnen ist unser lokales System der zyklischen Kompression (LCC) viel einfacher und erfordert weit weniger Baukosten. Nichtsdestotrotz können wir die intramuskulären Druckänderungen reproduzieren, die während der leichten Muskelkontraktion entstehen. Mit diesem Gerät haben wir erfolgreich nachgewiesen, dass die massageähnlichen mechanischen Eingriffe die lokale interstitielle Fluiddynamik modulieren und die immobilisierungsinduzierte Muskelatrophie lindern¹¹.

Hier beschreiben wir die Details unseres Geräts und des Protokolls, die helfen können, die molekularen Mechanismen hinter den positiven Effekten von Übungen und Massagen zu erforschen. Die Schaltpläne des Protokolls werden als Ergänzende Abbildung 1dargestellt.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden mit Der Genehmigung des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und Nutzung des Nationalen Rehabilitationszentrums für Menschen mit Behinderungen durchgeführt.

1. Immobilisierung der Maus bilaterale Hinterbeine

HINWEIS: Männliche C57BL/6-Mäuse wurden für Experimente im Alter von 11 - 12 Wochen nach der Akklimatisierung für mindestens 7 Tage verwendet.

1. Eine Maus mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg i.p.) angemessen anästhesieren. Stellen Sie sicher, dass Mäuse nicht auf eine Hinterbalt-Zehen-Pinch reagieren.
   HINWEIS: Führen Sie das Immobilisierungsverfahren zwischen 10.00 und 19.00 Uhr durch, um die möglichen Auswirkungen auf die Fütterungsaktivität von Mäusen zu minimieren.
2. Tragen Sie chirurgische Bänder auf die bilateralen Hinterbeine der Maus in einer Supine-Position mit den Kniegelenken verlängert und Knöchelgelenke pflanzlich gebeugt.
3. Legen Sie einen Aluminiumdraht (siehe Materialtabelle) auf den Stamm auf L4-5-Rückenhöhe und wickeln Sie den Draht in einer Spiralkonfiguration um die Hinterbeine mit 5 mm Lücken zwischen jeder Drehung der Spiralschicht (Abbildung 1A). Achten Sie darauf, den Draht nicht zu fest zu wickeln und vermeiden Sie, den lokalen Blutfluss zu stören.
4. Um die Möglichkeit eines Entweichens aus der Verdrahtung zu minimieren, immobilisieren Sie die Hüftgelenke in der Position der 90°-Entführung, indem Sie die Konfiguration von Aluminiumdraht manuell einstellen.
5. Bringen Sie die Mäuse in ihre ursprünglichen Käfige zurück. 3 H später, stellen Sie sicher, dass sie von der Anästhesie erholen und Zugang zu Nahrung und Wasser wie üblich.
6. Haus 3 - 6 immobilisierte Mäuse pro Käfig wie vor der Immobilisierung.

2. Messung des intramuskulären Drucks der Magen-Darm-Muskeln der Maus

HINWEIS: In den mit LCC kombinierten Drucküberwachungsexperimenten wurden verschiedene Gewichte zylindrischer Einheiten (36 g, 66 g und 200 g) getestet. Diese Messung wurde getrennt von den Experimenten zur Analyse von Muskelentzündungen und Atrophie durchgeführt (siehe Schritt 3 - 5 für weitere Details), d.h. die Mäuse, die einer Druckmessung unterzogen wurden, wurden nicht für histologische Analysen verwendet.

1. Da die Druckmessung invasivere Verfahren (z. B. Hautschnitt und Nadeleinsatz) im Vergleich zu Hinterbeinerverdrahtung und LCC umfasst, verwenden Sie eine Mischung aus drei Anästhetika (Medetomidin 0,75 mg/kg, Midazolam 4,0 mg/kg und Butorphanol 5,0 mg/kg; i.p.). Stellen Sie sicher, dass Mäuse nicht auf die Hinterlimb-Zehen-Pinch reagieren.
2. Legen Sie die Maus in eine anfällige Position, machen Sie einen 2-mm-Schnitt mit einem Skalpell auf dem hinteren Kalb nach dem Enthaaren mit einem elektrischen Rasierer und halbsterilisieren die Hautoberfläche mit 70% Ethanol- und Chlorhexidin-getränkte saugfähige Baumwolle.
3. Setzen Sie eine 20 G-Indwelling-Nadel in den Magen-Darm-Muskel in einem stumpfen Winkel (150° – 170°) an die Hautoberfläche.
4. Mit der Kunststoffhülle der Nadel als Führung, legen Sie einen Sensor des Blutdrucktelemeters (siehe Tabelle der Materialien) in den Mittleren Bauch des Magens von Gastrocnemius Muskel, und dann entfernen Sie die Hülle aus dem Muskel.
5. Nachdem Sie die Haut mit 4-0 Nylon-Nähten bestreuen, lCC mit mehreren verschiedenen Gewichten zylindrischer Einheiten auf das Kalb in den Mäusen auftragen (siehe Schritt 3 für weitere Details), und den intramuskulären Druck mit Einer Software zur biologischen Signalanalyse überwachen (siehe Tabelle Materialien).
6. Bringen Sie die Mäuse in ihre ursprünglichen Käfige zurück. 3 H später, stellen Sie sicher, dass sie von anästhesie/Analgesie erholen und haben Zugang zu Nahrung und Wasser wie üblich.

3. Lokale zyklische Kompression (LCC) auf Mauskälbern

1. Verwenden Sie mit Ausnahme der intramuskulären Druckmessung und Einschlämung (d. h. der Zervixdislokation) Natriumpentobarbital (50 mg/kg i.p.) zur Anästhesie.
2. Lösen Sie die Maus von der Hinterbauchverdrahtung und legen Sie sie in eine anfällige Position mit den Kniegelenken verlängert und die Knöchelgelenke plantar-gebeugt, so dass die Waden nach oben gerichtet. Fixieren Sie die Maushinterbleibs nicht auf der Bühne.
3. Tragen Sie LCC auf das Kalb auf, indem Sie eine zylindrische Gewichtseinheit (Abbildung 1B) vertikal bewegen, die mit einem Polster (Abbildung 1C) bei 1 Hz für 30 min pro Tag, 7 Tage bedeckt ist.
4. Nach jedem Kampf der täglichen LCC, verdrahten Sie die Maus Hinterbeine.

4. Immunhistochemische Analyse von Gastrocnemius

1. Euthanisieren Sie die Maus durch Zervixdislokation unter ausreichender Anästhesie/Analgesie durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus drei Anästhesika (Medetomidin 0,75 mg/kg, Midazolam 4,0 mg/kg und Butorphanol 5,0 mg/kg).
2. Nach der Enthaarung der hinteren Wadenoberfläche, machen Sie einen Hautschnitt, und sezieren Gastrocnemius Muskeln durch Trennung von tibio-fibulären Knochen mit einer chirurgischen Schere und schnell einfrieren sie in einer optimalen Schneidtemperatur-Verbindung Lösung.
3. Mit einem Kryostat, bereiten Kryo-Sektion Proben von Gastrocnemius-Muskeln auf Glasrutschen. Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse in einem Gefrierschrank von -80 °C auf.
4. Nehmen Sie die zu analysierenden Gastrocnemius-Kryo-Sektionsproben aus dem Gefrierschrank heraus und dehydrieren Sie sie durch Lufttrocknung bei Raumtemperatur.
5. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblockerstift, um einen Bereich zu zeichnen, der alle Kryoabschnitte auf der Folie enthält. Der Kreis verhindert, dass die Lösungen von der Folie abfließen.
6. Vermeiden Sie das Trocknen der Proben, indem Sie die Dias in ein Tablett legen, in dem eine feuchte Umgebung mit wassergetränktem Papiertuch entsteht.
7. 100 l Sperrpuffer (phosphatgepufferte Saline (PBS) mit 0,25 % Casein, Trägerprotein und 0,015 M Natriumazid) 30 min bei Raumtemperatur auftragen.
8. Spülen Sie die Dias zweimal, indem Sie sie mit PBS-T (PBS mit 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat (siehe Materialtabelle)für 5 min inkubieren.
9. Tragen Sie 100 l Primärantikörper, der mit PBS verdünnt wird, auf jede Probe auf, bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
10. Waschen Sie 3 mal mit PBS-T (5 min für jede Wäsche).
11. Tragen Sie 100 l Sekundärantikörper, der mit PBS verdünnt wird, auf jede Probe auf und brüten Sie 1 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Für Anti-Lamin-Färbung, verwenden Sie Alexa Fluor 568-konjugierte Sekundärantikörper. Verwenden Sie für Anti-F4/80, Anti-MCP-1 und Anti-TNF-, Alexa Fluor 568- oder 488-konjugierte Sekundärantikörper.
12. Waschen Sie 3 mal mit PBS-T (5 min für jede Wäsche).
13. Tragen Sie 100 L DAPI-Lösung mit PBS-T verdünnt auf jede Probe auf und inkubieren Sie 3 min bei Raumtemperatur.
14. Waschen Sie 3 mal mit PBS-T (jeweils 5 min).
15. Montieren Sie die Proben mit Montagemedium und bedecken Sie sie mit Decklippen.

5. Histomorphometrische Analyse von Gastrocnemius

1. Die Probengletten auf ein Fluoreszenzmikroskop legen (siehe Materialtabelle) und die Proben mit einem 20-Zoll-Objektiv mit geeigneten Filtern (DAPI-B, 360/40 nm zur Anregung und 460/50 nm für Emissionen) betrachten; GFP-B, 470/40 nm für Anregung und 535/50 nm für Emissionen; FRITC, 540/25 nm für Anregung und 605/55 nm für Emissionen.
2. Mit der Software für die Bildanalyse (siehe Tabelle der Materialien), messen Sie den Querschnittsbereich (CSA) jedes Myofibers und zählen Sie die Anzahl der F4/80-, MCP-1- und TNF--positiven Zellen.
   HINWEIS: Bestimmen Sie CSA jedes Myofibers, indem Sie den inneren Rand der Kellermembran, der mit Anti-Laminin-2-Immunostainierung visualisiert wird, nachverfolgen.

Ergebnisse

In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Beobachtungen¹²wurde die CSA von Gastrocnemius-Myofibians durch imbehinderungsimmobilisierende Hinterbeine signifikant verringert (Abbildung 2A,B). Darüber hinaus ergab unsere Immunfluoreszenz-Färbeanalyse, dass Zellen, die MCP-1 und TNF-A exzieren, die beide eine Schlüsselrolle bei der Regulierung entzündlicher Prozesse^13,14, signifikant erhöht in Gas...

Diskussion

Wir haben eine Methode zur Anwendung eines massageähnlichen mechanischen Reizes beschrieben, die entzündungshemmende Wirkung hat. Unser System hat auch im Vergleich zu den zuvor gemeldeten Vorteilen folgende Vorteile. Erstens wurden in früheren Studien die angewandten mechanischen Kräfte² nicht quantitativ definiert oder ihre Größen auf der Grundlage der Messung an der Körperoberfläche, aber nicht innerhalb der Gewebe¹⁰definiert. Im Gegensatz dazu haben wir den intramuskulä...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aluminiumdraht	DAISO JAPAN	B028	Ein Aluminiumdraht wird verwendet, um zu vermeiden, dass die Einschränkung durch den Draht entweicht
Blutdruck-Telemeter	Millar	SPR-671	Ein Blutdruck-Telemeter wird verwendet, um den intramuskulären Druck zu messen.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI ist eine Fluoreszenzsonde, die häufig zum Färben von DNA für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird.
Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper Alexa Fluor 488 (Verdünnungsverhältnis, 1:500)	Invitrogen	A11034	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
Anti-Ratte Alexa Fluor 568 (Verdünnungsverhältnis, 1:500))	Invitrogen	A11077	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
ImageJ	NIH	N/A	Analysesoftware für Image
LabChart8	ADInstrumens		Analysesoftware zur Erfassung biologischer Signale.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold ist für die Aufnahme von gefärbten Proben.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	Zur Blockierung der unspezifischen Hintergrundfärbung in immunhistochemischen Verfahren.
Monoklonaler Anti-Laminin-2-Antikörper der Ratte (Verdünnungsverhältnis, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
Monoklonaler Anti-F4/80-Antikörper für Ratten (Verdünnungsverhältnis, 1:500)	Abcam	ab6640	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
Polyklonaler Kaninchen-Anti-MCP-1-Antikörper (Verdünnungsverhältnis, 1:1000)	Abcam	ab25124	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
Polyklonaler Kaninchen-Anti-TNF-&-alpha-Antikörper (Verdünnungsverhältnis, 1:1000)	Abcam	ab66579	Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
OP-Band	3M Japan	1530EP-0	Chirurgisches Klebeband wird verwendet, um die Gelenkbewegung einzuschränken.