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Methodenartikel

Die Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung mit Detect Multimerischen Komplexen, die durch Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture stabilisiert wurden

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DOI:

10.3791/59483

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2. Mai 2019

 , 
1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. Eine einfache Methode, um multimerische Komplexe zu analysieren, die durch diese Verknüpfungen stabilisiert werden, ist die Nicht-Remation der SDS-PAGE-Analyse. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS veranschaulicht.

Zusammenfassung

Die Strukturen vieler Proteine werden durch kovalente disulfide Verbindungen stabilisiert. In den jüngsten Arbeiten wurde diese Anleihe auch als nachträgliche Modifikation eingestuft. Daher ist es wichtig, diese Veränderung in lebenden Zellen studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten Multimerenkomplexe zu analysieren, ist eine zweistufige Methode, die SDS-PAGE-Analyse und Formaldehyd-Vernetzung nicht zu reduzieren. Diese zweistufige Methode ist als erster Schritt zur Aufdeckung von multimerischen Komplexen vorteilhaft, die durch disulfide Verbindungen aufgrund ihrer technischen Leichtigkeit und niedrigen Betriebskosten stabilisiert werden. Hier wird die menschliche Knochenosteosarkomat-Zelllinie U-2 OS verwendet, um diese Methode zu illustrieren, indem sie die nukleare Isoform von DUTPase gezielt analysiert.

Einleitung

Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. In jüngster Zeit wurde diese Bindung auch als eine resible post-translationale Modifikation klassifiziert und fungiert als ein auf Zylinder basierender "Redox-Schalter," der die Modulation von Proteinfunktion, Lage und Interaktion 1, 2 ermöglicht. 3,4. Daher ist es wichtig, diese Modifikation studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten multimerischen Komplexe zu analysieren, ist die Nicht-Rindung der SDS-PAGE-Analyse5. SDS-PAGE-Analyse ist eine Technik, die in vielen Labors verwendet wird, wo die Ergebnisse schnell, einfach und mit minimalen Kosten gewonnen und interpretiert werden können, und ist vorteilhaft gegenüber anderen Techniken, die verwendet werden, um disulfide Verbindungen wie Massenspektrometrie 6 zu identifizieren. ,7 und kreisförmig dichroistisch8.

Ein wichtiger Schritt bei der Bestimmung, ob diese Methode eine geeignete Technik ist, um in einer Studie zu helfen, ist es, die primäre Abfolge des Proteins von Interesse, um sicherzustellen, dass es Cystein-Rückstände (s) vorhanden sind gründlich zu untersuchen. Ein weiterer hilfreicher Schritt ist es, alle bisherigen Kristallstrukturen zu erforschen oder eine Bioinformatik-Anwendung zu verwenden, um die dreidimensionale Struktur des Proteins von Interesse zu erforschen, um zu visualisieren, wo sich die Cystein-Rückstände befinden können. Wenn die Rückstände auf der Außenfläche vorhanden sind, kann es ein besserer Kandidat sein, eine disulfide Verbindung zu bilden, anstatt einen Cystein-Rückstand, der auf der Innenseite der Struktur vergraben ist. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Proteine strukturelle Veränderungen bei Substratinteraktionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen durchlaufen können, so dass diese Rückstände dann auch der Umwelt ausgesetzt werden.

Identifizierte multimerische Komplexe können dann mit Hilfe chemischer Vernetzung mit Formaldehyd überprüft werden. Formaldehyd ist aufgrund der hohen Zelldurchlässigkeit und der kurzen Vernetzungsspanne von ~ 2-3, ein idealer Cross-Linker für diese Verifikationstechnik, der die Erkennung spezifischerProteinproteininteraktionen 9,10 gewährleistet. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS 11 veranschaulicht. Dieses Protokoll kann jedoch auch für andere Zelllinien, Gewebe und Organismen angepasst werden.

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Protokoll

1. Blocking Free Cysteine Residues mit Iodoacetamid

  1. Wachsen Sie U-2-OS-Zellen in einer 6 cm 2 Schüssel bis zu 50% – 60% Durchblutung in minimalem essentiellen Medium mit hoher Glukose, die 10% fetales Rinderserum und 1% Natriumpyruvat bei 37 ° C in 5% CO2enthält.
  2. Machen Sie einen frischen Vorrat von 10 mM Iodoacetamid kurz vor der Verwendung, dann verwerfen Sie jedes ungenutzte Reagenz.
  3. Fügen Sie 0,1 mM Endkonzentration Iodoacetamid direkt in die Zellkulturmedien ein. Die Schüssel bei Raumtemperatur für 2 min sanft rocken.

2. Die Ernte der Zellen

  1. Aspiration die Medien aus den Zellen.
  2. Die Zellen dreimal mit 5 ml kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung, dann 1 ml kalte PBS hinzufügen.
  3. Mit einem Zellkratzer die Zellen vom Boden der Schale abkratzen. Mit einer 1 ML-Pipette die PBS und die Zellaufhängung aufziehen und die gesamte Flüssigkeit in ein 1,5 ML Mikrozentrifugenrohr geben.
  4. Die Zellen bei 7.500 x g für drei min bei 4 ° C ausspinnen. Aspirieren Sie die PBS, lassen Sie das Zellpellet zurück. Das Zellpellet kann bis zur Verarbeitung bei-80 ° C gelagert werden

3. Proteinentnahme

  1. Bereiten Sie 100 μL eines 1x-Lysepuffers vor, der in ddH2 O (siehe Tabelle der Materialien) verdünnt ist. Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF) unmittelbar vor der Verwendung zu einer 1 mM-Endkonzentration hinzufügen.
  2. 50 μL des 1x-Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben und aussetzen. Inkubieren Sie dies auf Eis für 5 min.
  3. Sonicate für 8 s mit dem konstanten Pulsmodus bei 40% (siehe Materialtabelle für Soundatoren; passen Sie sich an, wie es für verschiedene Koniker notwendig ist), wobei der Extrakt auf Eis gehalten wird.
  4. Den Extrakt bei 4 ° C für 5 min bei 16.000 x g ausdrehen. Das Supernatant ist die lösliche Proteinfraktion. Bradford-Analysen können durchgeführt werden, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, wenn gewünscht.

4. Probenvorbereitung

  1. Nehmen Sie 10 μL des löslichen Proteinextrakts und fügen Sie 10 μL eines 1x Laemmli SDS-Probenpuffers hinzu (4% SDS, 20% Glycerin, 0,004% Bromophenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8). Fügen Sie keine Reagenzien hinzu.
  2. Halten Sie Proben auf Eis, wenn SDS PAGE-Analyse an diesem Tag durchgeführt wird; Für die langfristige Lagerung sind-20 ° C geeignet. Kurz vor dem Lauf des Gels die Probe 5 Minuten bei 85 ° C erhitzen.

5. In Vivo Formaldehyd Cross-linking of Endogenous Proteins in U-2 OS Cells

  1. Wachsen Sie U-2-OS-Zellen in einer 175 cm 2 Flasche auf 70% – 80% Konluenz (siehe Abschnitt 1).
  2. Führen Sie die Formaldehyd-Vernetzungsreaktion durch
    1. In einer Rauchhaube, aliquot eine 37% Formaldehyd-Lösung aus kommerziellen Quellen gekauft. Das Formaldehyd-Fixmittel direkt in das Medium geben und bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung für 15 min inkubieren.
    2. Um die Reaktion zu löschen, fügen Sie 1,25 M Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 M und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung auf einem Rocker für 5 min.
  3. Die Zellen dreimal mit 5 ml kalter PBS waschen. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Krabbeln Sie die Zellen mit einem Zellkratzer vom Boden der Flasche.
  4. Mit einer 10 mL-Pipette die PBS und die Zellaufhängung aufzeichnen und die gesamte Flüssigkeit in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr geben. Die Zellen bei 500 x g für 2 min bei 4 ° C ausspinnen. Aspirieren Sie die PBS, lassen Sie das Zellpellet zurück.

6. Fraktionierung von Nuclei

  1. Bereiten Sie 10 ml Homogenisierungspuffer vor: 0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES und 0,5% BSA bei pH 7.4. Fügen Sie PMSF unmittelbar vor der Verwendung zu einer 1 mM-Endkonzentration und 3 ml Kernfederpuffer hinzu (0,1% Triton X-100 in PBS).
  2. Fügen Sie den 5 mL-Homogenisierungspuffer direkt in das Zellpellet ein und setzen Sie ihn komplett aus. Die Aufhängung bei 500 x g für 2 min bei 4 ° C zentrifugen und dann das Supernatant abwerfen.
  3. Das Pellet in 5 ml Homogenisierungspuffer aussetzen. Verwenden Sie einen eng anliegenden Glas-Teflon-Homogenisierer, dounce homogenisieren Zellen bei 10 Strokes/500 U/min.
  4. Die Aufhängung bei 1.500 x g für 10 min bei 4 ° C zentrieren, dann das Supernatant abwerfen.
    NOTE: Verwenden Sie den Supernatant für die Isolierung von Mitochondrien, indem Sie 10 min zentrifugieren.
  5. Das Pellet in 1 mL Kerne aufhängend puffern und 10 min auf Eis inkubieren.
  6. Zentrifuge bei 600 x g für 10 min. Discard den Supernatant.
  7. Das Pellet in 1 mL Nuklei Aufhängepuffer und Zentrifuge wieder aufhängen. Den Supernatant abwerfen. Das letzte Pellet wird isolierte Kerne sein.

7. Extraktion von Protein

  1. Wiederholen Sie den Abschnitt 4, es sei denn, man fügt 25 μL des 1x-Lysepuffers direkt in das Zellpellet hinzu und wird dann ausgesetzt.

8. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie zwei Proben für SDS-PAGE vor, indem Sie jeweils 10 μL des löslichen Proteinextrakts einnehmen und 10 μL 2x Laemmli SDS-Probenpuffer und 1 μL 2-Mercaptoethanol (BME) hinzufügen.
  2. Eine Probe für 5 min bei 37 ° C und die zweite Probe für 15 min bei 98 ° C erhitzen, um die Formaldehyd-Querverbindung umzukehren.

9. SDS-PAGE-Analyse

  1. Bereiten Sie 1 L von 1x Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) vor.
  2. Richten Sie den SDS-PAGE-Blaufgerät ein.
    Hinweis:     Dieses Protokoll verwendet eine 16% vorgegebene TGX SDS-Seite. Beachten Sie jedoch, dass jedes prozentuale Gel verwendet werden kann.
    1. Öffnen Sie nach dem Herstellerprotokoll das Paket, in dem das Gel gespeichert ist, und entfernen Sie die Kassette.
    2. Entfernen Sie den Kamm, der die Brunnen und das Klebeband von der Unterseite der Kassette auskleidet.
    3. Das Gel in den laufenden Apparat legen.
    4. Füllen Sie die Kammer mit dem 1x laufenden Puffer, bis die Brunnen in Flüssigkeit getaucht sind. Mit einem Plastikpiptier die Brunnen mit dem laufenden Puffer ausspülen.
  3. Laden Sie die Proben auf dem Gel zusammen mit 10 μL vorgefärbtem Standardmarker.
  4. Das Gel bei 200 V laufen lassen, bis die Farbstofffront ca. 1 cm vom Boden des Gels entfernt ist.

10. Western Blot

  1. 1 L 1x-Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 4 ° C lagern.
  2. Das Gel vorsichtig entfernen und die Kassette öffnen. Mit einem Rasierer das Stapelgel vorsichtig schneiden und abwerfen. Nehmen Sie das Gel mit einer Ecke hoch und legen Sie es in ein Tablett mit Transferpuffer, so dass es für 5 Minuten sanft rocken kann.
  3. Während das Gel rockt, legen Sie einen Eisblock (in-20 ° C) in den Transferbehälter und fügen Sie den Transferpuffer auf 3/4 voll.
  4. Das Polyvinylidene Fluorid (PVDF)-Membran mit 100% Methanol für 30 s verdauen.
  5. Sobald die 5 Minuten vergangen sind, bereiten Sie sich darauf vor, den Transfer in einem Tablett mit Transferpuffer einzurichten. Der Transferpuffer sollte ausreichen, um den Schandfleck komplett zu untertauchen. Stellen Sie den Blot Transfer wie folgt ein: Unten, unten der Kassettenhalter (schwarz); Dann ein dicker Schwamm, extra dickes Flackpapier, das Polyacrylamid-Gel, eine PVDF-Membran, extra dickes Blottierpapier und ein dicker Schwamm; Dann schließlich die Spitze des Kassettenhalters (weiß) oben.
  6. Die Kassette verschließen und mit der PVDF-Membran in den Übergabetank in Richtung der positiven Anode und das Gel in Richtung Negativ legen. Füllen Sie das Gerät mit dem Transferpuffer aus, bis Ihr Transfer vollständig untergetaucht ist.
  7. Das Gerät auf eine ühren legen. Fügen Sie dem Gerät eine Rührstange hinzu und beginnen Sie mit 125 U/min.
  8. Laufen Sie bei 100 V für 60 min.
  9. Während der Transfer läuft, bereiten Sie eine Lösung von 5% Milchpulver in Tris-gepufferte Saline aufgelöst, mit Tween-20, pH 7,5 (TBST).
  10. Das Gerät zerlegen und die Membran entfernen, wobei festgestellt wird, welche Seite mit dem Gel in Kontakt stand; Stellen Sie sicher, dass diese Seite in der Schale für die restlichen Stufen bleibt.
  11. Die Membran 2 min in Tris-gepufferte Saline (TBS) einweichen, danach die Membran blockieren, indem in 5 mL 5 ml mit 5% Milch-TBST-Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wird.
  12. Ersetzen Sie die Milch durch eine frische 4 ml Milch-TBST-Lösung und fügen Sie den primären Antikörper bei der richtigen Verdünnung hinzu (in diesem Fall ist unsere Verdünnung 1:2000 für den DUTPase-Antikörper) und inkubieren Sie über Nacht mit sanftem Schaukeln bei 4 ° C.
  13. Am nächsten Tag den Schandfleck aus dem 4 ° C-Rocker zu einem Raumtemperatur-Rocker entfernen und die primäre Antikörperlösung verwerfen.
  14. Machen Sie drei Schnellwäschungen mit TBST, mit genügend Flüssigkeit, um den Schlitz vollständig zu untertauchen, gefolgt von 3 Wäschen, jeweils 5 min, schaukeln langsam.
  15. Nach der letzten Wäsche 5 ml der 5%-Milk-TBST-Lösung hinzufügen und den Schlitz für 15 Minuten ausstechen und dann abwerfen.
  16. Bei der gewünschten Konzentration sekundärer Antikörper in 5% Milch-TBST verdünnt. (In diesem Fall 1:5000 Verwässerung von Ziege gegen Kaninchen in 5 mL von 5% Milch-TBST-Lösung verdünnt)
  17. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur, rocken für 1 Stunde, dann werfen Sie die Lösung.
  18. Drei Schnellwäschungen mit TBST, gefolgt von 3 Waschungen, jeweils 5 min, langsam rocken, dann die letzte Wäsche ablegen und 5 ml TBS hinzufügen.
  19. Bereiten Sie eine 1:1 Mischung aus einer ECL-chemilumineszierenden Detektorungslösung (1 mL jedes Reagenzes für ein Endvolumen von 2 mL) vor und fügen Sie diese direkt in den Blot inkubieren für 1 min.
  20. Entfernen Sie die Membran mit Pinzette und dab die Ecke mit einem Laborwischtuch, wodurch jede überschüssige Lösung entfernt wird. Die Membran in Schrumpffolie legen und die Eiweißseite in eine Röntgenkassette legen.
  21. Die Membran dem Röntgenfilm aussetzen. Die Zeit der Exposition wird variieren.

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Ergebnisse

Die KerndUTPase bildet eine intermolekulare disulfide Verbindung, die durch das Zusammenspiel von zwei Cystein-Rückständen, die an der dritten Aminosäure jedes monomeren Proteins 11 positioniert sind, eine stabile Düste-Konfiguration bildet. Das zeigt sich in Abbildung 1A, B. Um sicherzustellen, dass es sich bei dieser disulfiden Verbindung nicht um eine unspezifische Wechselwirkung handelte, die auf Migrationsanomalie...

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Diskussion

Die hier skizzierte Methode gibt ein Straight-Forward-Protokoll für die Analyse von multimären Komplexen, die durch disulfide Verbindungen stabilisiert werden. Dieses Protokoll lässt sich leicht an andere Zellkulturlinien, Gewebe und Organismen anpassen, die eine breite Palette von Anwendungen ermöglichen.

Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist es, sicherzustellen, dass die Disulfid-Verbindungen keine Folge des Absaugverfahrens sind. Alle freien Cystein-Rückstände können mit Iodoacetami...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Manuskripts haben.

Danksagungen

Wir freuen uns über die Bemühungen von Dr. Jennifer Fischer für die Reinigung des dUTPase polyklonalen Antikörpers und Kerri Ciccaglione für all ihre Bemühungen, dieses Manuskript zu bearbeiten. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Stipendium der New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16% vorgefertigte TGX GeleThermoFisherXp00160
175 cm2 FlaskCell Star658175
18COATCCCRL-1459
6 cm2 SchaleVWR10861-588
A549ATCCCCL-185
Amersham ECL DetektionskitGE
Blot-TransferapparatBiorad153BR76789
BMESigma AldrichM3148
Bradford-Protein-ReagenzBiorad5000006
Bromphenol Blue
BSA-Zellsignalisierung99985
ZelllysepufferZellsignalisierung9803
ZentrifugeEppendor5415D
DMEMGibco11330-032
Bohrer
EDTASigma AldrichM101
ElektrophoresegerätInvitrogenA25977
Extra dickes Western-LöschpapierThermoFisher88610
Fetal RinderserumGibco1932693
FormaldehydThermoFisher28908
Glas-Teflon-Homogenisator
GlycerinSigma Aldrich65516
GlycinRPI636050
WärmeblockDenville10285-D
HepesSigma AldrichH0527
SalzsäureVWR2018010431
IodacetamidThermoFisher90034
KimwipeKimtech34155
MethanolPharmco339000000
Fettfreie TrockenmilchZellsignalisierung99995
PBSSigma AldrichP3813
PMSFSigma Aldrich329-98-6
Posi-Click-RöhreDenvilleC2170
NetzteilBiorad200120
Vorgefärbter MarkerThermoFisher26619
PVDF-MembranBiorad162-0177
RockerReliable Scientific55
Saos2ATCCHTB-85
SDSBiorad161-0302
Sekundärer AntikörperZellsignalisierung70748
KleinzellschaberTygonS-50HL Klasse VI
NatriumchloridRPIS23020
NatriumpyruvatGibco
UltraschallgerätBranson450
Schwammpad zum AbtupfenInvitrogenE19051
RührplatteCorningPC353
SaccharoseSigma AldrichS-1888
Tris BaseRPIT60040
Tris gepufferte Kochsalzlösung, mit Tween 20, pH 7,5Sigma AldrichSRE0031
Tris-Glycin LaufpufferVWRJ61006
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tween 20Sigma AldrichP9416
U-2 OSATCCHTB-96
RöntgenfilmThermoFisher34090
16817200

Referenzen

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  14. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Cystein stabilisierte KomplexeFormaldehyd QuervernetzungU 2 OS ZellendUTPase AnalyseProteinextraktionWestern Blot
Die Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung mit Detect Multimerischen Komplexen, die durch Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture stabilisiert wurden
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