Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

Zusammenfassung

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) wird allgemein als ein Wirbeltier Modell in Studien verwendet und eignet sich besonders für visuelle Neurowissenschaften. Für Funktionsmessungen der Sehleistung ist Zitterrochens (ERG) eine ideale nicht-invasive Methode, die in höheren Wirbeltierarten bestens etabliert hat. Dieser Ansatz wird zunehmend eingesetzt, für die Prüfung der Sehfunktion im Zebrafisch, auch während der frühen Entwicklungen Larvenstadien. Allerdings ist die am häufigsten verwendeten Aufnahme-Elektrode für Larven Zebrafisch ERG bisher Mikropipette Glaselektrode, die speziellen Ausrüstung für seine Herstellung, stellen eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen erfordert. Hier präsentieren wir Ihnen ein Larven Zebrafisch-ERG-Protokoll mit einer kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode. Die neuartige Elektrode ist einfacher zu Herstellung und Griff, sparsamer und weniger anfällig für die Larven Auge als das Glas Mikropipette schädigen. Wie zuvor veröffentlichten ERG Methoden kann das aktuelle Protokoll äußere retinale Funktion durch Photorezeptor und bipolar-Zell-Antworten, die a - und b-Welle, bzw. bewerten. Das Protokoll kann die Verfeinerung der visuellen Funktion während der frühen Entwicklung von Zebrafischlarven, Unterstützung der Dienstprogramm, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der neuartige Elektrode verdeutlichen. Die vereinfachte Elektrode ist besonders nützlich bei der Errichtung eines neuen ERG oder ändern von bestehenden kleinen Tier ERG Vorrichtung zum Zebrafisch-Messung, Beihilfe Forscher in den visuellen Neurowissenschaften der Zebrabärbling verwenden Modell Organismus.

Einleitung

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist eine verbreitete genetische vertebrate Modell, einschließlich Studien der visuellen Neurowissenschaften geworden. Die zunehmende Beliebtheit dieser Spezies kann Vorteile einschließlich einfache Genmanipulation, hoch konservierte vertebrate visuelle System (Neuron Typen, anatomischen Morphologie und Organisation sowie zugrunde liegende Genetik), hohe Fruchtbarkeit zugeschrieben werden und geringere Kosten für die Tierhaltung im Vergleich zu Säugetieren Modelle¹. Die nicht-invasive Elektroretinogramm (ERG) ist seit langem verwendet klinisch menschlichen visuellen Funktion zu beurteilen und in der Laborumgebung zu quantifizieren, Vision in einer Reihe von großen und kleinen Arten, darunter Nagetiere und Larven Zebrafisch^{2,3 , 4 , 5}. der am häufigsten untersuchten ERG Komponenten sind die a-Welle und b-Welle, mit Ursprung aus dem lichtempfindlichen Photorezeptoren und bipolar Interneuronen, beziehungsweise. Im Larvenstadium Zebrafisch unterschiedliche Schichten in der Netzhaut werden durch 3 Tage nach Befruchtung (Dpf) festgelegt und die Morphologie des Kegels Photorezeptor terminal Synapsen Reife vor 4 Dpf^6,7. Damit ist äußere retinale Funktion des larvalen Zebrafisch festgelegt vor 4 Dpf, was bedeutet, dass die ERG von diesem frühen Alter ab messbar ist. Wegen der kurzen experimentellen Zyklus und Hochdurchsatz-Eigenschaften des Modells ist die ERG an Larven Zebrafisch für funktionelle Beurteilung der Krankheitsmodelle, angewendet worden Analyse Vision und Retinal Farbentwicklung, Studium der visuellen zirkadianen Rhythmen und^8,9,10,11,12Drogen testen.

Aktuelle Ansätze für Larven Zebrafisch ERG hat jedoch einige Schwierigkeiten, die es erschweren können, anzunehmen. Veröffentlichten Larven Zebrafisch ERG Protokolle verwenden häufig ein Glas Mikropipette mit leitfähigen Flüssigkeit gefüllt, wie die Aufnahme Elektrode^3,4,5,13, wonach eine hochwertige Mikropipette Tipp³. Spezielle Ausrüstung, wie z. B. einer Mikropipette Puller und in einigen Fällen ein Microforge, sind für ihre Herstellung benötigt. Dies kann eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen und führt zu Mehrkosten, auch bei der Anpassung zur Verfügung kleine Tier ERG Systeme zur Messung von Larven Zebrafisch Sehfunktion. Auch wenn geglättet, kann die scharfe Mikropipette Spitze Larven Augenoberfläche beschädigen. Darüber hinaus sind kommerzielle Mikropipette Halterungen für Elektrophysiologie mit einer festen Silberdraht gebaut. Diese festen Drähten werden sich wiederholende Nachgebrauch, erfordert den Kauf von neuen Inhaber führt zu erhöhten Instandhaltungskosten passiviert.

Hier beschreiben wir eine ERG-Methode mit einer kegelförmigen Schwamm-Spitze Aufzeichnung Elektrode, das ist besonders nützlich für die Anpassung der etablierten kleinen Tier ERG Setups für Larven Zebrafisch ERG Messungen. Die Elektrode ist leicht gemacht mit gemeinsamen Polyvinylacetat (PVA) Schwamm und feinem Silberdraht ohne spezielle Ausrüstung. Unsere Daten zeigen, dass diese neuartige Elektrode empfindlich und zuverlässig genug, um die funktionelle Entwicklung des retinalen neuronale Schaltkreise im Larvenstadium Zebrafisch zwischen 4 und 7 Dpf zu demonstrieren. Diese wirtschaftliche und praktische Schwamm-Tip Elektrode kann Forscher zur Gründung neuer ERG Systeme oder ändern von bestehenden kleinen Tier-Systeme für Zebrafisch Studien sinnvoll sein.

Protokoll

Alle Elektroretinogramm (ERG) Verfahren gemäß den Bestimmungen der australischen National Health and Medical Research Council Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt wurden und institutionellen Tierethik zu vom Ausschuss angenommen wurden die Universität von Melbourne.

1. Puffer Vorbereitung

1. Bereiten Sie die 10 x Goldfisch Ringer Puffer (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 25 mm CaCl₂100 mM Glukose, 100 mM HEPES) mit Umkehrosmose (RO) Wasser. Passen Sie den Puffer pH 7,8 und sterilisieren Sie den Puffer mit 0,22-μm-Filter zu. Speichern Sie die 10-fach Puffer bei 4 ° C als Lösung Lager³.
   Hinweis: 10 x Ringerlösung Puffer sollte innerhalb von 3 Monaten verwendet werden.
2. Am Tag des Experiments machen Sie 1 x Goldfisch Ringerlösung Puffer durch die 10 x Goldfisch Ringer Puffer mit Umkehr-Osmose-Wasser verdünnen.
   Hinweis: 1 x Goldfisch Ringer Puffer wird verwendet, um den PVA-Schwamm, einschließlich des Schwamms verwendet für die Platzierung der Larven Zebrafisch, und den Schwamm auf der Elektrodenspitze Aufnahme zu sättigen.

2. Elektrode Vorbereitung

1. Bereiten Sie die kegelförmigen Schwamm Aufnahme Elektrode.
   1. Schneiden Sie den Stecker aus der Platin-Elektrode Blei Erweiterung und entfernen Sie am Ende 10 mm der äußeren Polytetrafluorethylen Isolierung Beschichtung mit einem Skalpellklinge. Achten Sie darauf, nicht um das innere Seil von der Elektrode Blei zu beschädigen.
   2. Ein 40 mm Schnittlänge von Silberdraht (0,3 mm Durchmesser) und befestigen Sie dies sicher mit der Elektrode Leitung von Silberdraht mit dem belichteten inneren Draht Liebesbeziehung. Umhüllen Sie das Gelenk mit Isolierband, ein ~ 15 mm Länge von Silberdraht ausgesetzt (Abbildung 1A).
   3. Galvanisieren der exponierten Silberdraht mit Chlorid mit einer 9 V DC-Quelle für 60 s, Signal-Leitung zu verbessern. Tauchen Sie die exponierten silberne Spitze in normalen Kochsalzlösung und verbinden Sie das andere Ende mit dem Pluspol der Batterie. Schließen Sie einen weiteren Draht an den Minuspol der Batterie und Tauchen Sie das andere Ende des Drahtes in der saline².
      Hinweis: Alternativ chloren Sie das Silberdraht durch Einweichen es für 1 Stunde in einem Bleichmittel-Lösung (Wirkstoff 42 g/L Natriumhypochlorit).
   4. Schneiden Sie ein ~ 20 mm x 20 mm Quadrat von PVA Schwamm mit einer Schere zu einem Kegel (Abbildung 1A). Sättigen Sie den Schwamm mit 1 x Ringer Puffer. Unter dem Mikroskop mit einer Maßstabsleiste am Okular verwenden einer Skalpellklinge die Spitze des Kegels auf ~ 40 µm Durchmesser zu gestalten. Luft trocknen den kegelförmigen Schwamm auf saugfähigem Papier Gewebe, bis sie fest ist.
      Hinweis: Die PVA Schwamm deutlich erweitert, wenn gesättigt, somit ist es wichtig, dass der Schwamm zuerst mit Kochsalzlösung gesättigt ist, bevor Sie die Spitze des Kegels Gestaltung.
   5. Nach Chloriding lufttrocknen Silberdraht auf ein saugfähiges Gewebe für 5 min. Insert Silberdraht in den getrockneten, feste, kegelförmige PVA Schwamm durch die Basis des Kegels. Isolieren Sie überschüssige exponierten Metall mit Maske Klebeband, um Photovoltaik-Artefakte (Abbildung 1 b-C) zu reduzieren.
      Hinweis: Entfernen Sie nach jeder experimentellen den Schwamm aus der Silberdraht. Waschen Sie den Schwamm mit Umkehr-Osmose-Wasser und Luft trocknen für Wiederverwendung. Um optimale Signal-Sammlung zu gewährleisten, empfiehlt Einzelnutzung Silberdraht. PVA-Schwämme sollte nicht mehr als 5 mal wiederverwendet werden.
   6. Am Tag des Experiments Tauchen Sie die Schwamm-Spitze der Elektrode Aufnahme in 1 x Ringer Puffer für mindestens 15 Minuten, den Schwamm vollständig zu sättigen.
2. Bereiten Sie Referenzelektroden, wie oben, jedoch ohne Befestigung der Schwamm Tipp beschrieben.
3. Erhalten Sie die Masseelektrode im Handel.

(3) Zebrafisch-Vorbereitung

1. Dunkelheit anzupassen Zebrafischlarven über Nacht (> 8 h) vor der Aufnahmen durch die Platzierung von Zebrafisch in einer 15 mL Tube (< 20 Larven pro Röhre) eingewickelt in Alufolie in einem dunklen Inkubator. Entfernen Sie den Deckel um ausreichende Sauerstoffversorgung sicherzustellen.
2. Am Tag der Aufnahme ziehen Sie den Deckel der folienverpackte Falcon-Röhrchen mit Larven und sicherstellen Sie, dass die Röhre lichtdicht ist. Larven an der ERG-Labor zu transportieren.
3. Gießen Sie den Fisch in Petrischalen im Dunkeln mit Hilfe von dim rote Beleuchtung aus einer Leuchtdiode (LED; 17,4 cd.m^-2, λ_Max. 600 nm). Decken Sie Petrischalen mit lichtdichten Handtücher, um Belichtung zu minimieren.

(4) Schwamm Plattform Vorbereitung

1. Schneiden Sie ein Rechteck von trockenen PVA schwamm gemütlich in einem 35 mm Petrischale passen. Sicherstellen Sie, dass die Dicke des Schwamms in die Tiefe der Petrischale ungefähr gleich sein sollte.
2. Machen Sie einen kleinen Schnitt senkrecht durch ein Ende des Schwamms, Silberdraht der Bezugselektrode unterzubringen.
3. 1 x Goldfisch Ringerlösung Puffer bis gesättigt einziehen Sie den PVA Schwamm. Dann setzen Sie den Schwamm in einer sauberen 35-mm-Petrischale. Verwenden Sie ein Papiertuch, zusätzliche Flüssigkeit aufzunehmen, bis keine Lösung aus dem Schwamm in Reaktion auf einen leichten Finger drücken strahlt.

5. Tier- und Positionierung der Elektrode

1. Die Larven mit 0,02 % Tricaine in 1 x Goldfisch Ringer Puffer verdünnt zu betäuben.
2. Verwenden Sie eine 3 mL Pasteurpipette, um einem narkotisierten Larve auf ein Quadrat aus Papierhandtuch (~ 3 cm²) übertragen.
3. Legen Sie das Papierhandtuch, enthält die Larve auf die feuchten Schwamm-Plattform mit Pinzette. Verwenden Sie einen feinen Pinsel getränkt in Ringerlösung Puffer um die Position von der Larve. Sicherzustellen Sie, dass ein Auge nach oben, steht isoliert von Flüssigkeiten in der Nähe auf dem Platz des Papiertuch unter der Larve.
4. Glasieren des Larven Körpers, außer dem Kopf, mit feuchtigkeitsspendenden Augengel, die Larve während der Aufzeichnung ERG feucht zu halten.
5. Positionieren Sie die Petrischale mit Schwamm-Plattform auf einer kleinen Warmwasser Plattform vor der Ganzfeld Schüssel Lichtreiz befindet sich im Inneren ein Faradayscher Käfig (Abbildung 1).
   Hinweis: Aufrechterhaltung der Temperatur der Schwamm und die Larven Körper sorgt für stabile ERG Signale.
6. Legen Sie die Bezugselektrode in den Schnitt in der Plattform Schwamm (Abbildung 1).
7. Verbinden Sie die kommerziell erworbenen Masseelektrode mit der Faraday-Käfig.
8. Befestigen Sie die Aufnahme-Elektrode ein Elektrodenhalter und sichern Sie die Halterung an der stereotaktischen Arm von einem Mikromanipulator (Abbildung 1). Verwenden Sie eine 3 mL Pasteurpipette einen Tropfen von 1 x Ringer Lösung auf die Schwamm-Spitze der Elektrode für Re Sättigung zu Tropfen.
9. Positionieren Sie das Mikroskop in der Faraday-Käfig über die ERG-Plattform für die Platzierung der Elektroden.
   Hinweis: Beleuchtung sollte durch eine dunkel rote LED (17,4 cd.m^-2, λ_Max. 600 nm) ermöglicht die Beobachtung von der Larve und Platzierung der aktiven Elektrode Beibehaltung Dark-adaptation erfolgen.
10. Passen Sie die Position der Schwamm Plattform zur Beobachtung der Larve unter dem Mikroskop zu ermöglichen. Verwenden Sie dann saugfähigem Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit aus der Elektrodenspitze Schwamm zu entfernen.
11. Positionieren Sie die aktive Elektrode so, dass es leicht die zentrale Hornhautoberfläche des Auges Larven Zebrafisch (Abbildung 1E) berührt.
12. Verschieben der Ganzfeld-Schüssel in Richtung der Schwamm-Plattform und sorgen dafür, dass die Larve durch die Schüssel abgedeckt ist.
13. Schließen Sie den Faraday-Käfig um irrelevante elektromagnetisches Rauschen zu reduzieren.

(6) Elektroretinogramm Aufnahme

1. Verwenden die Computer-Software bestimmten ERG-Systems (siehe Tabelle der Materialien für Details) den Reiz auslösen und Erfassung von Daten basierend auf den Einstellungen unter²empfohlen.
   1. Legen Sie die Abtastrate des Systems bis 4 KHz über eine 650 ms Aufnahme Fenster (2.560 Punkte) in der Software zur Datenerfassung.
   2. Legen Sie die Verstärkung des Systems auf 1.000 ×.
   3. Bandpass-Filter des Systems auf 1 – 300 Hz eingestellt.
   4. Notch-Filter verwenden, um 60 Hz (oder 50 Hz, abhängig von der lokalen Versorgungsunternehmen Frequenz) reduzieren Lärm.
      Hinweis: Der ideale Geräuschpegel sollte nicht mehr als ± 10 µV.
2. Beginnen Sie Datenerfassung mit dem unten beschriebenen Verfahren.
   1. Verwenden Sie ein einzelnes Testblitz (0,06 Log cd.s/m²) eine Test-Reaktion aus dem Auge zu beurteilen, die Positionierung der Elektroden zu messen.
      Hinweis: Diese Intensität Testblitz sollte eine b-Wellen-Amplitude größer als 25 µV bei 4-Dpf Larven führen. Wenn eine starke Reaktion gemessen werden kann, dann positionieren Sie die Elektroden und das andere tun testen Blitz zu bestätigen, dass die Elektroden gut positioniert sind.
   2. Nach dem Test-Blitz, erlauben das Tier zu dunkel für 3 min in völliger Dunkelheit vor Aufnahmen anzupassen.
   3. Blinkt aus Dimmer, heller Lichtintensitäten zu präsentieren.
   4. Durchschnittliche Signale über wiederholt nach dem Signal-Rausch-Niveau.
      Hinweis: In der Regel durchschnittlich mehr Signale mit dem dimmer Licht (nicht weniger als 3 Wiederholungen) und weniger, bei helleren Lichtverhältnisse (normalerweise 1 wiederholen). Nach und nach verlängern die inter-Stimulus-Intervall von 10 bis 60 s von der dunkelsten zur hellsten Licht Ebene. Ein Probe-Protokoll ist in Tabelle 1dargestellt.
   5. Nach den Aufnahmen menschlich töten Sie Larven mit 0,1 % Tricaine.

7. Analyse

1. Messen Sie a Wellenamplitude gegenüber dem Ausgangswert, negative a-Wellenwanne und die negativen a-Wellenwanne b Wellenamplitude zum Gipfel positive b-Welle.
2. Messen Sie die a - und b-Welle implizite Zeiten von Reiz Beginn der Trog der a-Welle und dem Höhepunkt der b-Welle, bzw..

Ergebnisse

Dieser Abschnitt enthält repräsentative Ergebnisse für ERG Messungen täglich von 4 auf 7 Dpf. ERG Antworten anzeigen von 4 Dpf robuste a - und b-Welle-Komponenten, die jeweils aus Photorezeptoren und bipolaren Zellen entstehen. In jedem Alter getestet erhöht die Amplitude der b-Welle mit Lichtintensität (Abbildung 2; Abbildung 3). Vor allem die Empfindlichkeit der Netzhaut Larven Zebrafisch, dimmer Blitze mit zunehmendem Alter erhöht. Die a -...

Diskussion

Funktionale anzeigen wie die ERG haben in die Suite von Tools zur Untersuchung Larven Zebrafisch^8,9,12,14immer wichtiger geworden. Aufgrund der geringen Größe des larvalen Zebrafisch Auges haben Glas Mikropipetten angepasst, als Aufnahme Elektroden in den veröffentlichten Protokollen^3,4,5,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 &Mikro; m Filter	Millex GP	SLGP033RS	Filtert den 10-fachen Goldfisch-Ringer-Puffer für die Sterilisation
1 mL Spritze	Terumo	DVR-5175	Mit einem 30G ½ "-Nadel zum Hinzufügen von Tropfen Kochsalzlösung zur Elektrodenschwammspitze, um ein Austrocknen und erhöhtes Rauschen in den ERG-Signalen zu verhindern.
30 G &mal; ½ " Nadel	Terumo	NN * 3013R	Zum Hinzufügen von Kochsalzlösung toteh sopnge Spitzenelektrode.
Bioverstärker	ADInstruments	ML135	Zur Verstärkung von ERG-Signalen.
Bleichlösung	King White	9333441000973	Für eine alternative Methode der Chlorierung von Splitterelektroden. Wirkstoff: 42 g/L Natriumhypochlorit.
Umlaufwasserbad	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	Wird zur Herstellung der wasserbeheizten Plattform verwendet.
Elektrodenkabel	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinkabel zum Anschluss von Silberdrahtelektroden an den Verstärker.
Faraday Cage	Photometric Solution International		Zur Beibehaltung der Dunkeladaption und zur Einhausung des Ganzfeld-Setups zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Speziell entwickelter Lichtstimulator: 36 mm Durchmesser, 13 cm Öffnungsgröße.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		Für die Lichtstimulation zwanzig 5W und eine 1W LEDs.
Mikromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Hält die Aufzeichnungselektrode während der Experimente.
Microsoft Office Excel	Microsoft	Version 2010	Tabellenkalkulationssoftware für die Datenanalyse.
Feuchtigkeitsspendendes Augengel	GenTeal Gel	9319099315560	Wird verwendet, um Zebrafischlarven während der Aufnahmen abzudecken, um Austrocknung zu vermeiden. Wirkstoff: 0,3 % Hypromellose und 0,22 % Carbomer 980.
Pasteurpipette	Copan	200C	Wird verwendet, um Zebrafischlarven vorsichtig zu übertragen.
Powerlab Datenerfassungssystem	ADInstruments	ML785	Steuert die LEDs zur Erzeugung von Stimuli.
PVA-Schwamm	MeiCheLe	R-1675	Zum Platzieren von Zebrafischlarven und zur Herstellung der kegelförmigen Elektrode Ti
Kochsalzlösung	Aaxis Pacific	13317002	Zum Galvanisieren von Silberdrahtelektroden.
Scope Software	ADInstruments	Version 3.7.6	Löst gleichzeitig den Stimulus durch das Powerlab-System aus und sammelt Daten
Silber (feiner Runddraht)	A& E-Metall	0,3 mm	Wird zur Herstellung von Aufzeichnungs- und Referenz-ERG-Elektroden verwendet.
Stereomikroskop	Leica	M80	Wird verwendet, um die kegelförmige Schwammspitze zu formen und zu messen (mit Maßstabsleiste am Okular). Positioniert im Faradayschen Käfig für die Elektrodenplatzierung.
Tricain	Sigma-aldrich	E10521-50G	Zur Betäubung von Zebrafischlarven.
Wasserbeheizte Plattform	nach		Zur Aufrechterhaltung der Temperatur der Schwammplattform und des Larvenkörpers während ERG-Aufnahmen