Methodenartikel

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/59490

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3. April 2019

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1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Zusammenfassung

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Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) routinemäßig auf drei Arten von Proben angewendet wurde: Gewebeschnitte Sphäroide und mikrobiellen Kolonien. Diese Probentypen wurden analysiert mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), um die Verteilung der Proteine, Lipide und Metaboliten in der biologischen Probe von Interesse zu visualisieren. Wir haben eine neue Probe Vorbereitung Methode entwickelt, die kombiniert die Stärken der drei vorhergehenden Anwendungen an ein unentdecktes Ansatz zur Identifizierung von chemischen Kommunikation bei Krebs, durch impfen Säugerzelle Kulturen in Agarose in coculture mit gesundem Gewebe, gefolgt von Austrocknung der Probe. Säugetier-Gewebe und Zellen sind in der Nähe, so dass chemische Kommunikation über Diffusion zwischen dem Gewebe und Zellen cocultured. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Agarose-basierte Probe auf die gleiche Weise wie mikrobiellen Kolonien vorbereitet für IMS-Analyse getrocknet. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Kommunikation zwischen hochwertigem serösen Ovarialkarzinom Eileiter abgeleitet, wie es mit dem Eierstock während Metastasen interagiert zu modellieren. Optimierung der Probenvorbereitung führte bei der Identifizierung von Noradrenalin als chemische Schlüsselkomponente in der Eierstöcke Mikroumgebung. Diese neu entwickelte Methode kann auf anderen biologischen Systemen angewendet werden, die ein Verständnis der chemischen Kommunikation zwischen benachbarten Zellen oder Gewebe erfordern.

Einleitung

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Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) wurde optimiert, um die räumliche Verteilung der molekularen Eigenschaften in drei weit verbreitete Anwendungen charakterisieren: Gewebe Scheiben, Sphäroide und mikrobiellen Kolonien1,2,3. Gewebe-Scheiben können verwendet werden, um die Lokalisierung von Metaboliten im Zusammenhang mit der biologischen Bedingungen in einer Vielzahl, entweder gezielt oder ungezielte innerhalb eines bestimmten Bereichs der Masse zu bewerten. Unterschiede zwischen molekularen Funktionen sind jedoch erhebliche und offensichtlich, wenn ein gesundes Gewebe ist ....

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Protokoll

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Alle tierische Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ausschuß für institutionelle Animal Use und Pflege (IACUC) an der University of Illinois at Chicago genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Pflegen Sie, murine oviductal Epithel (MOE) bei 37° C mit 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator in alpha Minimum wesentliches Medium (αMEM) Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 10 mg/mL Insulin, Transferrin, Selen (ITS) Zellen , 1,8 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 U/mL Penicilli....

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Ergebnisse

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Eine optimal getrocknete ITO Folie führt in einer flachen trockenen Probe mit minimale bis keine Falten auf der Oberfläche der Agarose und Agarose-Stücke, die räumliche auf der Folie (Abbildung 3 Trennung). Abbildung 3A zeigt optimale Trocknung, während Abbildung 3 b zeigt die Falten, die vermieden werden sollten. Diese Optimierung erfordert sorgfältige Überwachung der Folie in den Ofen, da die genau.......

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Diskussion

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Es gibt eine wachsende Zahl von beweisen, die Noradrenalin Rolle HGSOC12,17,18impliziert, und diese Technik hat mehr mechanistischen Informationen beigetragen. Mit mindestens acht biologischen Bedingungen auf derselben Folie vorhanden kann die Methode biologische Kontrollen entfallen, wie gen sowie Zelle Spezifität und Medienkontrolle in einem einzigen IMS laufen. Während die Methode optimiert wurde zur Bewertung ausgetauscht kl.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

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Von der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung wurde der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S); finanziert University of Illinois at Chicago Startup finanziert (L.M.S); Grant 543296 von Eierstockkrebs Research Fund Alliance (M.D.); und UG3 ES029073 (Jeb) und des nationalen Zentrums für die Förderung translationale Wissenschaften, Nationales Institut für Gesundheit, durch Grant UL1TR002003 (JEB & LMS).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Falcon RöhrchenDenvilleC1017-OZur Entnahme von Zellen
8-Well-Kammer (Millipore EZ-Objektträgerkammer)MilliporePEZGS0816Wiederverwendung aus Millipore Millicell EZ-Objektträgerkammer Objektträger
AcetonitrilSigma-Aldrich34998-4LLösungsmittel für gesprühte Matrix
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)Fisher10-022-CVZellkulturmedien
Autoflex speed MALDI-TOF LRFBrukerFür die IMS-Datenanalyse
ZentrifugeEppendorf5810 RZum Sammeln von Zellen und Entfernen von Überständen
CHCA MatrixBruker Daltonic8201344Matrix auf getrockneten Objektträger gesprüht
DHB MatrixBruker Daltonic8201346Matrix gesprüht auf getrockneten Objektträger
Einweg-SkalpelleFisher22-079-707Zur Entfernung der Eierstöcke
PräparierschereFisher13-804-6Zur Entfernung der Eierstöcke
DMEM MediaGibco11995-065Medium gemischt mit Agarose
epidermalem WachstumsfaktorPeprotech Inc.100-15Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Eppendorf-RöhrchenGenesee Scientific22-282Für Agarose-Aliquote
Estradiol-17βSimga-AldrichE2758Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Fötales RinderserumDenvillefb5001Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
FlexControl 3.4Bruker DaltonicIMS Datenerfassungssoftware
FlexImaging 4.1Bruker DaltonicIMS Datenanalysesoftware
Pinzette (fein)Fsiher22-327379Zur Entfernung der Eierstöcke
GentamycinCellgro30-005-CRNahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Insulin, Transferrin, Selen (ITS)Sigma-Aldrich11074547001Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
ITO-beschichteter ObjektträgerBruker8237001Plattform für die Inkubation
von Co-Kulturen Das L-15 MediumGibco11415064Medium für die Verwendung im Gewebe Dissektion
L-GlutaminGibco25030-081Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Niedrigschmelzende AgaroseSigma-AldrichA9414-10GGemischt mit Medien zum Plattieren
MedienbeckenCorning4870Wird zum Schneiden von Kunststofftrennwänden für geteilte Kammern
verwendet Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Nahrungsergänzungsmittel
für ZellkulturmedienPeptid-KalibrierstandardBruker Daltonic8206195Kalibrant für den mittleren Massenbereich
Phophorus rotSigma-Aldrich343-242-5GKalibrant für den niedrigen Massenbereich
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS Daten statistische Analyse
Chirurgische Pinzette (stumpf)Fisher08-875-8BZur Entfernung der Eierstöcke
TFAFisher TechnologiesA116-50Hinzugefügt zur Matrixlösung
TM SprayerHTX TechnologiesZum Auftragen von Matrix

Referenzen

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  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

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Schlagwörter

Imaging Mass SpectrometryMALDI TOF MSSmall Molecule CommunicationOvarian Cancer MetastasisAgarose CocultureTissue Cell CocultureSample Preparation MethodDesiccation ProcessSpatial IntegrityLabel Free Analysis

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