Method Article

Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pinselzellen sind seltene cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die in der naiven Maustrache gefunden werden. Aufgrund ihrer begrenzten Anzahl ist die Ex-vivo-Bewertung ihrer funktionellen Rolle bei der Atemwegsimmunität und dem Umbau eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen durch Durchflusszytometrie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trachealbürstenzellen sind cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die bereit sind, Signale aus dem Atemwegslumen an das Immunsystem und das Nervensystem zu übertragen. Sie sind Teil einer Familie von chemosensorischen Epithelzellen, die Tuffsteinzellen in der Darmschleimhaut, Bürstenzellen in der Luftröhre und einsame chemosensorische und mikrovillous Zellen in der Nasenschleimhaut enthalten. Chemosensorische Zellen in verschiedenen Epithelkompartimenten teilen sich wichtige intrazelluläre Marker und eine transkriptionelle Kernsignatur, weisen aber auch eine signifikante transkriptionelle Heterogenität auf, die wahrscheinlich die lokale Gewebeumgebung widerspiegelt. Die Isolierung von Trachealbürstenzellen aus einzelzelligen Suspensionen ist erforderlich, um die Funktion dieser seltenen Epithelzellen im Detail zu definieren, aber ihre Isolierung ist eine Herausforderung, möglicherweise aufgrund der engen Wechselwirkung zwischen Trachealbürstenzellen und Nervenenden oder aufgrund der luftwegspezifischen Zusammensetzung von engen und haftenden Kreuzungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Bürstenzellen aus Maustrachealepithel. Das Verfahren basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und bequeme Lösung für die zytometrische Durchflusssortierung und funktionelle Analyse lebensfähiger Trachealbürstenzellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pinselzellen gehören zu einer Klasse von chemosensorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von bitteren Geschmacksrezeptoren und der Geschmacksrezeptor-Transduktionsmaschinerie in Geschmacksknospenzellen auszeichnen. Im Gegensatz zu Geschmacksknospenzellen sind chemosensorische Epithelzellen in epithelialen Oberflächen verstreut und werden als einsame chemosensorische Zellen (SCCs) und mikrovillous Zellen im Nasenepithel1,2, Bürstenzellen in der Luftröhre bezeichnet 3,4und Büschelzellen im Darm5,6. Epithelzellen, die bittere Geschmacksrezeptoren und die bitteren Geschmackstransduktionsmaschinen exdrücken, finden sich auch in der Harnröhre7,8 und der Gehörröhre9. Atemwegsbürstenzellen haben einzigartige Funktionen in neurogenen und immunen Atemwegsreaktionen. Sie sind Acetylcholin-produzierende Chemosensorienzellen, die bei Aktivierung mit Bitterverbindungen und bakteriellen Metaboliten wie quorum-sensing Substanzen10schützende Atemreflexe evozieren. Atemwegsbürstenzellen sind auch die dominante Atemwegsepithelquelle von IL-25, die aeroallergen-entlöste Typ-2-Entzündungen in den Atemwegen reguliert3.

Die Charakterisierung des vollständigen Transkriptoms der unteren Atemwegsbürstenzellen und ihre Reaktion auf Umweltreize wurde durch ihre geringe Anzahl im Trachealepithel und sehr begrenzte Zahlen über die großen Bronchien hinaus begrenzt10. Techniken zur Isolierung von chemosensorischen Zellen aus dem Darmepithel haben keine proportional hohen Zahlen aus der Luftröhre ergeben, möglicherweise aufgrund der intimen Kontakte von Trachealbürstenzellen mit Nervenenden10 oder anderen gewebespezifische Faktoren in der Atemschleimhaut wie die Zusammensetzung von Aufenthalten und engen Knotenproteinen. Jüngste Berichte über eine erfolgreiche Isolierung von Trachealbürstenzellen in höheren Zahlen für die einzellige RNA-Sequenzierungsanalyse verwendeten entweder eine 2 h Inkubation mit Papain oder eine 18 h Inkubation mit Pronase11,12. Da längere Inkubationen mit Verdauungsenzymen die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen aus verdauten Geweben verändern können13, könnte dies eine vergleichende Analyse mit anderen chemosensorischen Epithelpopulationen vortragen.

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen zur RNA-Sequenzierung3. Die Behandlung der Luftröhre mit hochdosierter Dispase trennt das Epithel von der Submucosa. Die anschließende Verdauung des Epithelblatts mit Papain ermöglicht eine hervorragende Rückgewinnung dieser Strukturzelle.

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Protocol

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Stellen Sie vor der Durchführung der folgenden Experimente sicher, dass alle Tierpflege- und -protokolle vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortiere" (8. Auflage, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung im Brigham and Women es Hospital überprüft und genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien

  1. Bereiten Sie die Dispase-Verdauungslösung vor, bei der es sich um eine PBS-Lösung handelt, die 16 U/ml-Dispase und 20 g/ml DNase I enthält. Stellen Sie sicher, dass das Dispasepulver vollständig gelöst ist, bevor Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C aufwärmen.
  2. Fügen Sie 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um eine Stopplösung zu finden.
  3. Vorbereiten Tyrode I Puffer: Fügen Sie 26 U/ml Papain (20 l/ml 48 U/mg Papain-Lösung) und 10 l/ml L-Cystein in den Puffer von HEPES-Tyrode ohne Kalzium.
  4. Vorbereiten Des Tyrode II-Puffers: 2 L/ml Leupeptin (5 mg/ml) mit Kalzium in den Puffer von HEPES-Tyrode geben.
  5. FACS-Puffer vorbereiten: Verwenden Sie Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium, Magnesium & Phenolrot, ergänzt mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und fügen Sie 2% FBS hinzu.

2. Zerlegung der Maus-Trachea

HINWEIS: Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 Monate alt von beiden Geschlechtern. Minimieren Sie die Exposition des Gewebes, Licht zu lenken, um photobleaching von eGFP zu reduzieren.

  1. Euthanisieren Sie die Maus mit 100 mg/kg Pentobarbital Euthanasie-Lösung intraperitoneal oder mit Standardprotokollen von der IACUC genehmigt injiziert.
  2. Fixieren Sie die Maus auf einem chirurgischen Brett in der Supine-Position mit 21 G Nadeln mit verlängerten oberen und unteren Extremitäten. Sprühen Sie das Fell mit 70% EtOH, um den Bereich zu desinzipieren.
  3. Mit geraden Zangen, heben Sie die Haut und das Fell des Bauches und machen einen Schnitt in der Mitte mit sezierender Schere (gerade Schere, 3 cm). Mit der Schere, trennen Sie die Haut vom subkutanen Gewebe vom Bauch zur Mandibula. Während Sie das unterkutane Gewebe mit der Zange hochhalten, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Mitte der Bauchwand.
  4. Öffnen Sie das Peritoneum mit einem V-förmigen Schnitt. Mit der Zange bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig zur Seite, lokalisieren Sie die Bauchaorta und Vena cava und machen Sie einen Schnitt mit der sezierenden Schere, um eine schnelle Exsanguination zu ermöglichen.
  5. Suchen Sie die Membran. Mit einer 18 G Nadel, machen Sie eine Öffnung im Zwerchfell direkt unter dem Brustbein, um die Lunge zu entschärfen. Trennen Sie das Zwerchfell vorsichtig vom Rippenkäfig mit einer scharfspitzen geraden Sezierenderschere, um entlang der Unterbasis der Rippen zu schneiden.
  6. Heben Sie mit der Zange das exponierte Ende des Brustbeins an und schneiden Sie das Brustbein längs von der Basis des Rippenkäfigs bis zum Hals. Machen Sie einen zentralen Zervixschnitt mit kurzer gerader Schere (2 cm) und trennen Sie die beiden Lappen der submandibulären Drüse.
  7. Entfernen Sie vorsichtig das umgebende Bindegewebe und den Thymus, der die Carina mit einem Paar feinfeiner, hochpräziser Zange überlagert.
  8. Sezieren Sie die Luftröhre zuerst frei, indem Sie das proximale Ende auf der Ebene der Epiglottis trennen und dann das distale Ende auf der Ebene der Bifurkation der Luftröhre sezieren.
  9. Suchen Sie die Epiglottis und schneiden Sie die Luftröhre längs von den Epiglottis zur Carina.

3. Tracheal epitheliale Verdauung

  1. Legen Sie die Luftröhre in ein 1,5 ml-Rohr mit 750 l vorgewärmter (auf 37 °C) Dispase-Verdauungslösung. Auf einem Shaker bei 200 Rpm für 40 min bei Raumtemperatur bebrüten. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.
  2. Fügen Sie 750 l kaltes DMEM mit 5% FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Auf Eis legen.
  3. Die Luftröhre auf eine Petrischale (100 mm x 15 mm) geben und unter ein Seziermikroskop stellen. Richten Sie die Luftröhre mit der epitheliale Seite nach oben. Die längs sezierte Luftröhre hat eine halbzylindrische Form, die von den Knorpelringen gepflegt wird. Das Epithel befindet sich auf der konkaven Oberfläche.
  4. Tether der Epiglottis Bereich der Luftröhre mit geraden Zangen auf die Petrischale und mit einem Einwegsskalpell der Größe 22, kratzen Sie das Epithel von der Luftröhre. Die Epithelschicht trennt sich als transluzentes Blatt.
  5. Das Epithel mit dem Skalpell zerkleinern. Übertragen Sie die Epithelschicht in ein 2 ml-Rohr.
  6. Spülen Sie die Petrischale mit 750 L Tyrode I Puffer und übertragen Sie in das 2 ml Rohr, das die Epithelschicht enthält.
  7. Inkubieren Sie die Trachealepithelschicht in Tyrode I 30 min bei 37 °C auf einem Shaker bei 200 Rpm puffern. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.
  8. Fügen Sie 750 l kalten Tyrode II Puffer hinzu. Das verdaute Gewebe für 20-30 s kräftig vortexen. Das Homogenat mit einer Spritze, die an einer 18 G Nadel befestigt ist, 10 Mal trituieren.  Wechseln Sie zu einer 21 G-Messnadel und trituieren Sie 10-20 Mal.
  9. Filtern Sie die Zellen durch ein 100-m-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie 30:1 Vol/Vol des kalten FACS-Puffers hinzu.
  10. Drehen Sie bei 350 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet im kalten FACS-Puffer aussetzen und die Suspension auf ein 12 mm x 75 mm (5 ml) Polystyrolrohr übertragen. Drehen Sie bei 350 x g 10 min bei 4 °C wieder und entsorgen Sie den Überstand.
  11. Setzen Sie das Pellet in 100 L FACS-Puffer wieder aus.
  12. Fügen Sie 1 L Anti-Maus-CD16/32-Blockierungsantikörper hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren und 15 min auf Eis zu brüten. Nicht waschen.
  13. Fügen Sie die folgenden Antikörper und die entsprechenden Isotyp-Steuerelemente hinzu: pazifischeblaue Anti-Maus-CD45 oder Ratte IgG2a, k (0,25 g/106 Zellen in 100 L Volumen) und Allophycocyanin (APC) Anti-Maus-EpCAM oder Ratte IgG2b, k (0,5 g/106 Zellen in 100 l Volumen) monoklonale Antikörper. 45 min auf Eis vor direktem Licht geschützt. 4,5 ml kalter FACS-Puffer hinzufügen, bei 350 x g mischen und drehen, 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den FACS-Puffer, und setzen Sie das Pellet in 300 L kalten FACS-Puffer wieder auf.
  14. Fügen Sie Propidiumiodid (PI) (5 g/ml) unmittelbar vor der zytometrischen Durchflusssortierung hinzu.
    HINWEIS: Pinselzellen haben eine unregelmäßige Form mit mehreren Prozessen, die ihre Einhaltung von Filtern erhöhen könnten (Abbildung 3C). Wir verglichen 30 mm mit 70 mm und 100 mm Filter und stellten fest, dass größere Porenfilter für bessere Erträge sorgten. Darüber hinaus verbessert eine gründliche Triturierung der Zellsuspension nach der Papainverdauung die Ausbeute der Bürstenzelle signifikant. Wir empfehlen die Verwendung einer 18G-Nadel für die anfängliche Trituration, gefolgt von einer kleineren Bohrung (21 oder 23 G Nadel) zur feineren Trennung von Zellen.

4. Flow Cytometry Gating Strategie

  1. Identifizieren Sie Zellen aus Schutt durch vorwärts und seitlichen Streuwinkel. Schließen Sie die Doublets mit Vorwärtsstreuhöhe und -breite und seitenstreuungshöhe und -breite aus. Die Doublets wären die Zellen mit hohen Breitenwerten.
  2. Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Zellen die lebenden Zellen als die Population, die PI-negativ ist.
  3. Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Einzelzellen die CD45-Zellen mit niedrigen bis negativen Zellen basierend auf der Isotypkontrolle.
  4. Identifizieren Sie innerhalb der CD45-Low/Negativ-Zellen die EpCAM-positiven Zellen, die ebenfalls eGFP-positiv sind (im FITC-Kanal). Dies ist die Grundgesamtheit der Pinselzellen (Abbildung 2A).

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Results

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Dieses Verfahren wurde erfolgreich implementiert, um Trachealbürstenzellen für die RNA-Sequenzierung3zu isolieren. Nach Isolierung der Luftröhre und Verdauung des Gewebes mit einem 2-stufigen Protokoll (Abbildung 1) wurden Zellen gesammelt und mit fluoreszierend gekennzeichneten CD45 und EpCAM nach Ausschluss abgestorbener Zellen mit PI gefärbt. Nachdem wir Doublets basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungsmerkmalen herausgezäunt hatten, definierten wir Bürstenzelle...

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Discussion

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Wir fanden heraus, dass eine Kombination von hochdosierter Dispase-Behandlung für 40 min gefolgt von einer kurzen Papain-Behandlung (30 min) ein optimales Protokoll für die Trachealverdauung und die Isolierung von Bürstenzellen bietet. Diese Kombination vermeidet eine umfangreiche Verdauung und erzeugt die höchste Ausbeute an Bürstenzellen im Vergleich zu alternativen Protokollen.

Während die Lungenverdauung zur Extraktion hämatopoetischer Zellen sich klassischerweise auf milde Verdauungsenzym...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken Adam Chicoine vom Brigham and Women es Human Immunology Center Flow Core für seine Hilfe bei der zytometrischen Sortierung durch Fluss. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) und K08 AI132723 (L.G.B) und von der American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), durch den AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), den Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), den Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) und großzügige Spende der Familie Vinik (L.G.B.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikörper
Anti-GFP (Polyklonale Ziege Ig)Abcamcat# ab5450
APC Anti-Maus CD326 (EpCAM)  (G8.8)BiolegendKatze#118214
APC Ratte IgG2a, k IsotypkontrolleBiolegendKatze#400511
DAPIBiolegendKatze#422801
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488Life Technologies/Molekulare SondenKat#A-11055
Normales Ziegen-IgGR& D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue Anti-Maus CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k IsotypkontrolleBiolegendcat#400627
TruStain FcX (Anti-Maus CD16/32) AntikörperBiolegendcat#101320
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
DispaseGibcoKat# 17105041 
DNase ISigma Kat# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Puffer ohne Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m FilterBoston BioProductsKat# PY-912
Tyrode' s Lösung (HEPES-gepuffert) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 und 10 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m Filter. )Boston BioProductsKat# BSS-355
L-CysteinSigmaKat# C7352
Leupeptin TrifluoracetatsalzSigmaKatze# L2023
Papain aus PapayalatexSigmaKatze# P3125
Propidiumiodid Sigmacat# P4170
Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)The Jackson Laboratory7902
Equipment
  auf a  Zeiss Axio Observer Z1 Inverses MikroskopZeiss
LSRFortessaBD647465
Einweggeräte
1,5 mL sterile RöhrchenThomas Scientific1157C86
5 mL Poysteren-Röhrchen mit rundem Boden, 12 mm x 75 mm AusführungFalcon14-959-1A
50 mL konisches Röhrchen aus Polypropylen, 30 mm x 115 mmFalcon352098
Feather Einweg-Skalpell Nr. 12Fisher ScientificNC9999403
Petrischale, 100 mm x 15 mm StyleFalcon351029
Steriles Zellsieb, 100 & mu; mFisherbrandKat#22363549
LSM 800 mit konfokalem Airyscan-System

References

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