Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

Zusammenfassung

Pinselzellen sind seltene cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die in der naiven Maustrache gefunden werden. Aufgrund ihrer begrenzten Anzahl ist die Ex-vivo-Bewertung ihrer funktionellen Rolle bei der Atemwegsimmunität und dem Umbau eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen durch Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Trachealbürstenzellen sind cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die bereit sind, Signale aus dem Atemwegslumen an das Immunsystem und das Nervensystem zu übertragen. Sie sind Teil einer Familie von chemosensorischen Epithelzellen, die Tuffsteinzellen in der Darmschleimhaut, Bürstenzellen in der Luftröhre und einsame chemosensorische und mikrovillous Zellen in der Nasenschleimhaut enthalten. Chemosensorische Zellen in verschiedenen Epithelkompartimenten teilen sich wichtige intrazelluläre Marker und eine transkriptionelle Kernsignatur, weisen aber auch eine signifikante transkriptionelle Heterogenität auf, die wahrscheinlich die lokale Gewebeumgebung widerspiegelt. Die Isolierung von Trachealbürstenzellen aus einzelzelligen Suspensionen ist erforderlich, um die Funktion dieser seltenen Epithelzellen im Detail zu definieren, aber ihre Isolierung ist eine Herausforderung, möglicherweise aufgrund der engen Wechselwirkung zwischen Trachealbürstenzellen und Nervenenden oder aufgrund der luftwegspezifischen Zusammensetzung von engen und haftenden Kreuzungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Bürstenzellen aus Maustrachealepithel. Das Verfahren basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und bequeme Lösung für die zytometrische Durchflusssortierung und funktionelle Analyse lebensfähiger Trachealbürstenzellen.

Einleitung

Pinselzellen gehören zu einer Klasse von chemosensorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von bitteren Geschmacksrezeptoren und der Geschmacksrezeptor-Transduktionsmaschinerie in Geschmacksknospenzellen auszeichnen. Im Gegensatz zu Geschmacksknospenzellen sind chemosensorische Epithelzellen in epithelialen Oberflächen verstreut und werden als einsame chemosensorische Zellen (SCCs) und mikrovillous Zellen im Nasenepithel^1,2, Bürstenzellen in der Luftröhre ^{bezeichnet 3,4}und Büschelzellen im Darm^5,

Protokoll

Stellen Sie vor der Durchführung der folgenden Experimente sicher, dass alle Tierpflege- und -protokolle vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortiere" (8. Auflage, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung im Brigham and Women es Hospital überprüft und genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Bereiten Sie die Dispase-Verdauungslösung vor, bei der es sich um eine PBS-Lösung handelt, die 1....

Ergebnisse

Dieses Verfahren wurde erfolgreich implementiert, um Trachealbürstenzellen für die RNA-Sequenzierung³zu isolieren. Nach Isolierung der Luftröhre und Verdauung des Gewebes mit einem 2-stufigen Protokoll (Abbildung 1) wurden Zellen gesammelt und mit fluoreszierend gekennzeichneten CD45 und EpCAM nach Ausschluss abgestorbener Zellen mit PI gefärbt. Nachdem wir Doublets basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungsmerkmalen herausgezäunt hatten, definierten wir Bürstenzelle.......

Diskussion

Wir fanden heraus, dass eine Kombination von hochdosierter Dispase-Behandlung für 40 min gefolgt von einer kurzen Papain-Behandlung (30 min) ein optimales Protokoll für die Trachealverdauung und die Isolierung von Bürstenzellen bietet. Diese Kombination vermeidet eine umfangreiche Verdauung und erzeugt die höchste Ausbeute an Bürstenzellen im Vergleich zu alternativen Protokollen.

Während die Lungenverdauung zur Extraktion hämatopoetischer Zellen sich klassischerweise auf milde Verdauungsenzym.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper
Anti-GFP (Polyklonale Ziege Ig)	Abcam	cat# ab5450
APC Anti-Maus CD326 (EpCAM)  (G8.8)	Biolegend	Katze#118214
APC Ratte IgG2a, k Isotypkontrolle	Biolegend	Katze#400511
DAPI	Biolegend	Katze#422801
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molekulare Sonden	Kat#A-11055
Normales Ziegen-IgG	R& D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue Anti-Maus CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k Isotypkontrolle	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (Anti-Maus CD16/32) Antikörper	Biolegend	cat#101320
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
Dispase	Gibco	Kat# 17105041
DNase I	Sigma	Kat# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Puffer ohne Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m Filter	Boston BioProducts	Kat# PY-912
Tyrode' s Lösung (HEPES-gepuffert) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 und 10 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m Filter. )	Boston BioProducts	Kat# BSS-355
L-Cystein	Sigma	Kat# C7352
Leupeptin Trifluoracetatsalz	Sigma	Katze# L2023
Papain aus Papayalatex	Sigma	Katze# P3125
Propidiumiodid	Sigma	cat# P4170
Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	The Jackson Laboratory	7902
Equipment
auf a  Zeiss Axio Observer Z1 Inverses Mikroskop	Zeiss
LSRFortessa	BD	647465
Einweggeräte
1,5 mL sterile Röhrchen	Thomas Scientific	1157C86
5 mL Poysteren-Röhrchen mit rundem Boden, 12 mm x 75 mm Ausführung	Falcon	14-959-1A
50 mL konisches Röhrchen aus Polypropylen, 30 mm x 115 mm	Falcon	352098
Feather Einweg-Skalpell Nr. 12	Fisher Scientific	NC9999403
Petrischale, 100 mm x 15 mm Style	Falcon	351029
Steriles Zellsieb, 100 & mu; m	Fisherbrand	Kat#22363549

LSM 800 mit konfokalem Airyscan-System