Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Die eukaryotische mRNA-Synthese ist ein komplexer biochemischer Prozess, der die Transkription einer DNA-Vorlage in eine Vorläufer-RNA durch das Multi-Subunit-Enzym RNA-Polymerase II und die kotranskriptionale Verkabelung und Spleißung der Vorläufer-RNA zur Bildung der reifen mRNA erfordert. Während der mRNA-Synthese ist der RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplex ein Ziel für die Regulierung durch eine große Sammlung von Transkriptionsfaktoren, die seine katalytische Aktivität steuern, sowie die Verschluss-, Spleiß- und 3'-Verarbeitungsenzyme, die die ausgereifte mRNA erzeugen. Aufgrund der inhärenten Komplexität der mRNA-Synthese haben einfachere experimentelle Systeme, die die Isolierung und Untersuchung ihrer verschiedenen kotranskriptionsbasierten Stadien ermöglichen, einen großen Nutzen.

In diesem Artikel beschreiben wir ein solches einfaches experimentelles System, das für die Untersuchung der co-transkriptionellen RNA-Verkappung geeignet ist. Dieses System stützt sich auf definierte RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Polymerase- und künstlichen Transkriptionsblasen zusammengesetzt sind. Bei immobilisierter DNA-Deaktivierung bieten diese RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe ein leicht zu manipulierbares Werkzeug zur Sezieren von co-transkriptioniellen RNA-Verschließungen und Mechanismen, mit denen der Dehnungskomplex das Verschlussenzym während der co-transkriptionelle RNA-Verkappung. Wir gehen davon aus, dass dieses System für die Untersuchung der Rekrutierung und/oder Montage von Proteinen oder Proteinkomplexen mit Rollen in anderen Stadien der mRNA-Reifung angepasst werden könnte, die an den Dehnungskomplex der RNA-Polymerase II gekoppelt sind.

Einleitung

Die eukaryotische Boten-RNA-Synthese (mRNA) ist ein ausgeklügelter biochemischer Prozess, der die Synthese einer unverarbeiteten Vorläufer-RNA durch RNA-Polymerase II und die Verarbeitung der Vorläufer-RNA umfasst, um die ausgereifte mRNA zu erhalten. Die RNA-Verarbeitungsschritte der Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung werden weitgehend ko-transkriptional durchgeführt. Der Dehnungskomplex Pol II dient als Gerüst, das die Aktivitäten vieler RNA-Verarbeitungsenzyme rekrutiert und orchestriert. Folglich wird unser endgültiges Verständnis, wie ausgereifte eukaryotische mRNAs erzeugt werden, in hohem Maße von der Entwicklung experimenteller Systeme abhängen, um die....

Protokoll

1. Montage von Künstlichen Dehnungskomplexen und Pol II Walking

1. Immobilisieren Sie 1 nmol nicht-template DNA Oligo enthält ein 3' BiotinMolekül auf magnetischen Perlen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte können im Voraus durchgeführt werden, um sich auf zukünftige Experimente vorzubereiten. Alle in diesem Protokoll verwendeten Oligosequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt. RNA-Oligos werden mit 5'-Triphosphat-Modifikationen synthetisiert.
   1. Fügen Sie 200 l magnetisch (10 mg/ml) zu einem proteinarmen, proteinarmen 1,5 ml-Rohr hinzu und legen Sie es dann 2 min auf ein magnetisches Rack.
   2. Während sich das Rohr auf ....

Ergebnisse

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative Ergebnisreaktionen, die zur Erzeugung künstlicher Dehnungskomplexe verwendet werden, die Transkripte unterschiedlicher Länge enthalten, indem sie sich erweitern oder Pol II aus verschiedenen Quellen beziehen. Abbildung 4 zeigt, wie diese Dehnungskomplexe verwendet werden können, um die co-transkriptionelle CTD-Phosphorylierungsabhängige RNA-Verkappung zu assay.

Diskussion

Studien, die Ereignisse, die mit dem Pol II-Dehnungskomplex gekoppelt sind, wie die RNA-Verarbeitung und die Regulation der Transkriptdehnung selbst, sezieren sollen, können durch den Einsatz eines hochgereinigten Enzymsystems erheblich erleichtert werden. Der Aufbau solcher Enzymsysteme kann eine Herausforderung sein. Die durch den Veranstalter abhängige Transkription durch Pol II erfordert mindestens fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die Vorbereitung und Lagerung dieser Faktoren kann Monate dauern; Daher ist der .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	Für die Radiomarkierung von RNA
2x RNA-Ladefarbstoff	New England Biolabs	B0363S	Sehr empfohlen. Zur Vorbereitung von RNA während der Gelbeladung
40% Bis:Acrylamid-Lösung	Biorad	1610144
Rinderserumalbumin (20 mg/ml)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK-Komplex) Protein, aktiv, 10 &; Mikro; g	Millipore Sigma	14-476	Wird zur Phosphorylierung von Pol II CTD
DNA-Oligonukleotiden	verwendet IDT		Siehe Tabelle 8 für Reinheitsspezifikationen
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	Wir haben auch Dynabeads M-280 Streptavidin ohne Probleme verwendet, bevorzugen aber MyOne Streptavidin Kügelchen, weil sie langsamer sedimentieren
GlycoBlue Coprezipitant (15&dünnsp; mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Sehr empfehlenswert. Färbt Nukleinsäure-Pellet blau, wodurch Reaktionen viel einfacher zu handhaben
sind Hoefer SE600 Standard doppelt gekühltes vertikales Elektrophoresesystem mit 1 mm Spacern und 15-Well-Kamm	Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract Röhrchen mit hoher Dichte (1,5 mL)	Qiagen	129046	Sehr empfohlen. Enthält ein Gel mit hoher Dichte, das eine stabile Barriere zwischen wässriger und organischer Phase bildet; verbessert die RNA-Ausbeute bei Extraktionen
Proteinase K-Lösung (20&dünnsp; mg/ml)	Life Technologies Invitrogen	25530049 RNA-Oligonukleotide
	Trilink		Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 8
Anorganische Pyrophosphatase (100 Einheiten/ml)	New England Biolabs	NEBM2403S	Nur bei Verschließreaktionen erforderlich