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Methodenartikel

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59510

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19. September 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der toxikologischen Profile von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NPs), insbesondere der Art des Zelltodes in menschlichen MRC5-Lungenfibroblasten und der ROS-Bildung in der Fruchtfliege Drosophila.

Zusammenfassung

Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) haben eine breite Palette von Anwendungen, aber die Anzahl der Berichte über ZnO NP-assoziierte Toxizität hat in den letzten Jahren rapide zugenommen. Jedoch, Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen für ZnO NP-induzierte Toxizität aufklären, sind spärlich. Wir ermittelten die Toxizitätsprofile von ZnO NPs anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimentalmodellen. Bei ZnO NP-exponierten MRC5-Lungenfibroblasten wurde eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet, was zeigt, dass ZnO NPs zytotoxische Wirkungen ausüben. In ähnlicher Weise, interessanterweise, Darm ausgesetzt ZnO NPs zeigte einen dramatischen Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Fruchtfliege Drosophila. Es sind eingehendere Studien erforderlich, um eine Risikobewertung für die verstärkte Nutzung von ZnO-NPs durch Verbraucher zu erstellen.

Einleitung

Nanotechnologie bezieht sich auf die Anwendung nanogroßer Materialien, die in allen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Medizin, Materialwissenschaft und Biochemie. ZnO NPs, die für ihre ultraviolette Streuung, chemische Sensorik und antimikrobielle Eigenschaften sowie hohe elektrische Leitfähigkeit bekannt sind, werden beispielsweise bei der Herstellung verschiedener Konsumgüter wie Lebensmittelverpackungen, Kosmetika, Textilien, Kautschuke, Batterien, Katalysatoren für die Rückgasbehandlung von Kraftfahrzeugen und biomedizinische Anwendungen1,2,3.

Die aufkeimenden Anwendungen von ZnO NP-basierten Produkten, die zu einer erhöhten Exposition des Menschen gegenüber ZnO-NPs führen, haben jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer möglichen nachteiligen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit aufkommen lassen. Eine Reihe von in vitro zellulären Studien haben gezeigt, dass ZnO NPs oxidativen Stress, autophagiebedingte Zytotoxizität, Entzündung und Genotoxizität4,5,6,7,8 induzieren können . Insbesondere wird angenommen, dass die Toxizität von ZnO NPs durch die Auflösung von Zn zu freien Zn2+-Ionen sowie die Oberflächenreaktivität von ZnO verursacht wird, was zu den zellulären ionischen und metabolischen Ungleichgewichten führt, die mit einer beeinträchtigten ionischen Homöostase und Hemmung des Ionentransports4,7,9,10. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einer der primären Mechanismen ist, die ZnO NPs-assoziierte Toxizität zugrunde liegen. Unzureichende antioxidative Aktivität nach ROS Beleidigung hat sich als verantwortlich für die Auslösung der Zytotoxizität und DNA-Schäden9. Die toxischen Wirkungen von ZnO NPs wurden auch in Tiermodellen berichtet, einschließlich Nagetier1, Zebrafisch11,12, sowie die wirbellose Drosophila13.

Drosophila dient als etabliertes alternatives Tiermodell für das Toxizitätsscreening chemischer Einheiten und Nanomaterialien (NMs)14,15. Wichtig ist, dass es ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit zwischen dem Menschen und Drosophila gibt, was die Verwendung von Drosophila als In-vivo-Modell für die Bewertung biologischer Reaktionen auf Umweltschadstoffe wie NMs rechtfertigt. 16. Darüber hinaus gibt es viele Vorteile der Verwendung von Drosophila aufgrund seiner geringen Größe, kurze Lebensdauer, genetische Amenabilität, und einfache und kostengünstige Wartung. Darüber hinaus ist Drosophila weithin für die Erforschung der Genetik, Molekular- und Entwicklungsbiologie angenommen worden, seit sein vollständiges Genom vor Jahren im Jahr 2000 vollständig sequenziert wurde, wodurch es für eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist. und zur Behandlung ungelöster biologischer Fragen17,18,19,20,21. In den letzten Jahren, eine Reihe von Studien im Zusammenhang mit Immuntoxizität mit verschiedenen Arten von NPs in Drosophila wurden berichtet15,22,23,24. Dieses grundlegende neue Wissen aus den Studien mit Drosophila hat dazu beigetragen, mehr Einblicke in unser Verständnis der Nanotoxikologie zu geben.

ROS ist ein bekannter Schuldiger für Zytotoxizität und Genotoxizität, verursacht durch NPs, insbesondere metallbasierte NPs25. ROS sind sauerstoffhaltige chemische Spezies mit höheren reaktiven Eigenschaften als molekularer Sauerstoff. Freie Radikale wie Superoxid-Radikal (O2-) und sogar nicht-radikale Moleküle wie Wasserstoffperoxid (H2O2) können als ROS fungieren. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind sie verpflichtet, zelluläre Homöostase26zu erhalten, jedoch kann übermäßige ROS aufgrund von Überproduktion oder Dysregulation des antioxidativen Abwehrsystems oxidativen Stress verursachen, was zu Schäden an Proteinen führen, Lipide und Desoxyribonukleinsäure (DNA)27. Zum Beispiel, wenn ROS-Spiegel erhöhen und Glutathion (GSH) Niveau sinkt gleichzeitig, Störung der Adenosintriphosphat (ATP) Synthese findet statt und Lactat-Dehydrogenase (LDH) Niveau steigt im Medium, gipfelnd in Zelltod27.

Hier bieten wir Protokolle für die Durchführung zellulärer und genetischer Analysen mit kultivierten Säugetierzellen und Drosophila, um die potenziellen Nebenwirkungen von ZnO NPs zu bestimmen. Abbildung 1zeigt eine Übersicht über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO NPs .

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Protokoll

1. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse von lived/Fixed Cells

  1. Sonicate ZnO NPs in Suspension für 15 min.
  2. Bereiten Sie ZnO NPs in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 0, 10, 25, 50,100 und 200 g/ml) mit 1 mg/ml ZnO NP-Stammlösung zur Behandlung kultivierter Zellen vor.
  3. Seed MRC5 menschliche Lungen-Fibroblasten (1 x 105 Zellen/gut) auf eine 6-Well-Kulturplatte pro Tag im Voraus, und dann behandeln Sie die Zellen mit 2 ml ZnO NPs (in Triplicates) für 8 h, 16 h und 24 h.
  4. Zu jedem Zeitpunkt die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min sammeln.
  5. Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).
  6. Setzen Sie die Zellen mit 1x Bindungspuffer, der aus 0,1 M HEPES/Natriumhydroxid (NaOH), 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) und 25 mM Calciumchlorid (CaCl2) besteht, bei einer Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 100 l wieder auf.
  7. Fügen Sie 5 L Fluorescein isothiocyanat (FITC) Annexin V Fleck und 5 l Propidiumiodid (PI) DNA-Färbung, und inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT; 25 °C) im Dunkeln.
  8. Aufladen Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400-L-Bindungspuffer, bevor Sie die Zellen nach Durchflusszytometrie sortieren. Für jede Probe werden mindestens 10.000 Zellen analysiert.
  9. Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität.

2. Exposition von ZnO NPs gegenüber Drosophila

  1. Fügen Sie 1 ml Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen, gefolgt von 9 ml Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml oder 0,5 mg/ml ZnO NPs zu erreichen.
  2. Mischen Sie die Nanopartikel mit Lebensmitteln gründlich in den Fläschchen mit der Pipette.
  3. Fliegenfutter mit ZnO NPs vor Gebrauch mindestens 2-3 h abkühlen lassen.
  4. Führen Sie erwachsene männliche und weibliche Fliegen in die Fläschchen für 5 Tage, und lassen Sie sie zu paaren und legen Eier (die als weiße Flecken erscheinen) auf der Oberfläche der Nahrung.
  5. Entfernen Sie die Elternfliegen, und lassen Sie die Eier weiterentwickeln, die aus 4 verschiedenen Entwicklungsstadien besteht (embryonale, Larven- und Erwachsenenstadium).

3. Zerlegung der Fliege

  1. Sammeln Sie späte 3rd instar Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. Frisch gelegte Eier entwickeln sich in der Regel zu späten3. Instar Larven nach 72-120 h bei RT.
  2. Reinigen Sie die Sezierschale und füllen Sie den Brunnen mit Dissektionsmedium/PBS.
  3. Sezieren Sie die Larven (später 3rd instar) unter dem Stereomikroskop, mit einem Paar Zangen.
  4. Verwenden Sie die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu machen und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven. Ziehen Sie den Darm vorsichtig heraus und legen Sie ihn in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila-Medium, bevor der Befestigungsschritt mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PF) verwendet wird.
  5. 3.5Befestieren Sie den Darm in PF für 10 min bei RT, für nachfolgende Experimente, wie z. B. Immunfärbung.

4. ROS-Erkennung mit Dihydroethidium (DHE) Färbung

  1. Behandeln Sie Larven mit verschiedenen Konzentrationen von ZnO NPs, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
  2. Nach der Zerlegung des Darms von3. Instar-Larven, wie unter Abschnitt 3 beschrieben, inkubieren Sie den Darm in Schneiders Drosophila-Medium bei RT, bevor Gewebefärbung durchgeführt wird. Lösen Sie 1 l DHE-Farbstoff (aus der Lagerkonzentration von 30 mM) in 1 ml Schneiders Medium auf, was eine endige Arbeitskonzentration von 10-30 m DHE-Farbstoff macht.
  3. Inkubieren Sie den Darm für 5 min bei RT im Dunkeln, und waschen Sie dann dreimal mit Schneiders Medium für alle 5 min.
  4. Fixieren Sie den Darm mit 4% PF (optionaler Schritt) und montieren Sie den Darm auf Glasschlitten, mit Anti-Fade-Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop.

5. Messung der Fluoreszenz mit ImageJ-Software

  1. Importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software.
  2. Klicken Sie auf das Menü Analysieren und wählen Sie Messungen einstellen.
  3. Wählen Sie die Ausgabemessung aus, z. B. flächenintegrierte Intensität und mittlerer Grauwert.
  4. Klicken Sie auf Messen.
  5. Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen.
  6. Exportieren Sie die Daten in die Excel-Tabelle, und ermitteln Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) mithilfe der berechnungsgemäß enden.
    CTCF = Integrierte Dichte - (Fläche der ausgewählten Zelle X Mittlere Fluoreszenz von Hintergrundwerten)
  7. Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch.

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Ergebnisse

NP-exponierte Zellen wurden mit dem Zellfärbereagenz-Kit verarbeitet, gefolgt von der Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie. ZnO NP-behandelte Zellen (unten, rechter Bereich) weisen einen höheren Prozentsatz früher (R3)/später apoptotischer Zellen (R6) auf als Kontrollzellen (R5, unten, links). Der nekrotische Zelltod wird durch R4 (oben, rechts) bezeichnet (Abbildung 2). Die Ergebnisse des FITC/Annexin V Assays auf ZnO NP-behandelten MRC-5-Fibroblasten...

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Diskussion

Um zu beurteilen, ob ZnO NP Apoptose in MRC5-Fibroblasten induzieren kann, verwenden wir Die durchflusszytometrie, um die Zellen vom nekrotischen oder apoptotischen Zelltod zu unterscheiden. In normalen lebenden Zellen wird Phosphatidylserin (PS) an der Zellmembran lokalisiert. Wenn Apoptose auftritt, wird PS in die extrazelluläre Packungsbeilage der Plasmamembran transziert, so dass die Bindung von Annexin V mit Fluorescein (FITC Annexin V)29gekennzeichnet ist. Andererseits ist das rotfluoreszier...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Studie wurde durch die Stipendiennummer R706-000-043-490 unterstützt. Die Studie stellt nicht die Ansicht des Stipendiaten dar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15% Methyl-4-HydroxybenzoatSigma Aldrich
4% ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences<
em>cncCK6/TM3, Sbein Geschenk von Dr. Kerppola
T Maismehl, Glukose, Hefe BrauerSigma Aldrich
CyAn ADP mit Summit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidin)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD biosciences556547
FluoreszenzmikroskopOlympus
GlucolinSupermarkt
ImageJ SoftwareNIH
MRC5 humaner LungenfibroblastATCCCCL-171
Schneider' s Drosophila MediumThermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyONIG-FLY
Zinkoxid-NanopartikelSigma Aldrich721077Siehe Blatt 2

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Zellviabilitätreaktive SauerstoffspeziesDurchflusszytometrieFluoreszenzmikroskopieKonfokalmikroskopieMRC5-LungenfibroblastenDarmanalyseAnnexin-V-Färbung
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