Methodenartikel

Einsatz eines Linearbeschleunigers zur Durchführung von In-Vitro-Radiobiologieexperimenten

DOI:

10.3791/59514

⸱

26. Mai 2019

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1Department of Cancer Biology, Cleveland Clinic, 2Department of Radiation Oncology, Cleveland Clinic

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinische Linearbeschleuniger können verwendet werden, um biologische Wirkungen einer Vielzahl von Dosisraten auf Krebszellen zu bestimmen. Wir diskutieren, wie ein Linearbeschleuniger für zellbasierte Assays und Assays für Krebsstammzellen-ähnliche Zellen eingerichtet werden kann, die als Tumorsphären in Suspensionund und Zelllinien als anhaftende Kulturen angebaut werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Strahlentherapie bleibt einer der Eckpfeiler des Krebsmanagements. Für die meisten Krebsarten ist es die effektivste, nicht-chirurgische Therapie, um Tumore zu entwirn. Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestrahlung von Krebszellen mit einem Linearbeschleuniger. Die Weiterentwicklung der Linearbeschleunigertechnologie hat die Präzision und Effizienz der Strahlentherapie verbessert. Die biologischen Auswirkungen einer Vielzahl von Strahlendosen und -dosen sind nach wie vor ein intensives Untersuchungsgebiet. Die Verwendung von Linearbeschleunigern kann diese Studien mit klinisch relevanten Dosen und Dosisraten erleichtern.

Einleitung

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Strahlentherapie ist eine wirksame Behandlung für viele Arten von Krebs1,2,3,4. Die Bestrahlung mit besonders hoher Dosisrate ist relativ neu in der Strahlentherapie und wird durch die jüngsten technologischen Fortschritte bei Linearbeschleunigernermöglicht 5. Klinische Vorteile einer extra hohen Dosisrate gegenüber der Standarddosisbestrahlung sind verkürzte Behandlungszeit und verbesserte Patientenerfahrung. Linearbeschleuniger bieten auch einen klinischen Rahmen für zellkulturbasierte strahlungsbiologische Studien. Die biologischen und therapeutischen Implikationen von Strahlendosis und Dosisraten sind seit Jahrzehnten ein Schwerpunkt von Strahlenonkologen und Biologen6,7,8. Aber die Radiobiologie der extra hohen Dosisbestrahlung und Blitzbestrahlung - eine extrem hohe Strahlendosis - muss noch gründlich untersucht werden.

Gammastrahlenbestrahlung ist weit verbreitet in der zellkulturbasierten Strahlungsbiologie9,10,11. Strahlung wird durch Gammastrahlen erreicht, die aus zerfallenden radioaktiven Isotopenquellen, typischerweise Cäsium-137, emittiert werden. Die Nutzung radioaktiver Quellen ist stark reguliert und oft eingeschränkt. Mit quellenbasierter Bestrahlung ist es eine Herausforderung, eine breite Palette von Dosisraten zu testen und seinen Nutzen bei der Analyse der biologischen Wirkungen klinisch erzielbarer Dosisraten12zu begrenzen.

Es gab mehrere Studien, die sowohl Dosis- als auch Dosisrate-Effekte veranschaulichen12,13,14,15,16,17. In diesen Studien wurden sowohl Gamma-Bestrahlungen aus radioaktiven Isotopen als auch Röntgenstrahlen aus Linearbeschleunigern verwendet. Es wurden eine Vielzahl von Zelllinien verwendet, die Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Glioblastom und Melanom darstellen. Strahleneffekte auf das Zellüberleben, Zellzyklusstillstand, Apoptose und DNA-Schäden wurden als Auslesungenausgewertet 12,13,14,15,16,17 . Hier beschreiben wir eine Methode zur Definition der biologischen Auswirkungen klinisch relevanter Strahlendosis und -dosisraten durch die Bereitstellung von röntgenbasierter Strahlung mittels eines Linearbeschleunigers. Diese Studien sollten in enger Zusammenarbeit zwischen dem Biologen, Strahlenonkologen und dem medizinmedizinischen Physiker durchgeführt werden.

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Protokoll

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1. Zellpräparat zur Suspensionszellkultur

  1. Kulturgliom-Stammzellen in Stammzellkulturmedien bei ca. 5 x 106 Zell/10 cm Platten in einem Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2, 95% relativer Luftfeuchtigkeit bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Zellkulturbedingung ist in allen Prozeduren gleich. Die im Protokoll verwendeten Medien sind vollständige Medien.
  2. Zwei Tage vor der geplanten Bestrahlung sammeln Gliom-Stammzellen von der Kulturplatte mit einer sterilen 5 ml Pipette in ein 15 ml Zentrifugenrohr in einer Kulturhaube.
  3. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 200 x g für 3 min in einer Arbeitsplatte Zentrifuge.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und verdauen Sie das Zellpellet (ca. 1 x 107 Zellen) mit 1 ml Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um eine Einzelzellsuspension in Trypsin-EDTA herzustellen. Schütteln Sie den Boden des Zentrifugenrohrs während der Verdauung alle 2 Minuten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gründlich verdaut werden.
  5. Fügen Sie 3 ml Stammzellkulturmedien (siehe Materialtabelle) hinzu, um Trypsin zu löschen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 200 x g für 3 min in einer Gegenzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Zellpellet.
  6. Setzen Sie die Zellen mit 5 ml Zellkulturmedien wieder aus und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  7. Platte 5 x 106 Zellen in zwei 10 cm Platten mit 10 ml Zellkulturmedien.
  8. Unmittelbar vor der geplanten Bestrahlung die Zellen sammeln und den Überstand nach zentrifugieren, wie in Schritt 1.3 beschrieben, entsorgen. Setzen Sie das Zellpellet mit 5 ml Zellkulturmedien wieder auf. 1 ml Zellsuspension in eine 35-mm-Platte mit 2 ml Zellkulturmedien übertragen.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Medien beträgt 3 ml in der 35 mm Platte, um die Flüssigkeit 1 cm in der Höhe in der Platte zu machen.
  9. Übertragen Sie die vergoldeten Zellen in einen sekundären Behälter, z. B. eine Kunststoff- oder Schaumstoffbox, um das Kontaminationsrisiko zu verringern und die Zellen im Behälter zur Bestrahlungsanlage auf dem Gebrauchswagen zu bringen.
  10. Bestrahlen Sie die Zellen wie in Schritt 4 beschrieben.

2. Zellvorbereitung für angeschlossene Zellkultur

  1. Entfernen Sie einen Tag vor der Bestrahlung in der Zellkulturhaube das DMEM-Medium aus der Zellkulturplatte der angeschlossenen Zelllinie, z. B. HEK-293-Zellen. Das Medium kann mit einer Pasteur Pipette abgesaugt werden, die mit einem Vakuum verbunden ist.
  2. Waschen Sie Zellen mit 5 ml sterilem PBS zur Kulturschale, um Restmedien abzuspülen.
  3. Pipette 1 ml Trypsin-EDTA in die Kulturschale und sanft kippen die Kulturplatte, um sicherzustellen, dass das gesamte Gericht mit Trypsin-EDTA bedeckt ist.
  4. Trypsinisieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. Die Trypsin-EDTA-Reaktion mit 3 ml DMEM-Medien ablöschen und Zellen mit einer 5 ml Pipette in 15 ml Zentrifugenrohr in der Kulturhaube sammeln.
  5. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 200 x g für 3 min in einer Gegenzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Zellpellet.
  6. Setzen Sie die Zellen mit 5 ml DMEM-Medien wieder aus und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  7. Platte 2 x 105 Zellen in einer 35-mm-Platte mit 3 ml Zellkulturmedien bis zu einer Höhe von 1 cm Medien.
  8. Nach 24 h Zellkultur im Inkubator bei 37 °C die plattierten Zellen in einem Sekundärbehälter (d.h. einer isolierten Schaumstoffbox) auf einem Gebrauchswagen zur Bestrahlungsanlage übertragen.
  9. Strahlen Sie Zellen, wie in Schritt 4 beschrieben.

3. Zellpräparat zur Immunfärbung nach Bestrahlung

  1. Kommerzielle extrazelluläre Proteinmatrix über Nacht bei 4 °C auf Eis auftauen. Über Nacht 200 L Pipettenspitzen und 1,5 ml Zentrifugenrohre bei 4 °C vorkühlen.
  2. Aliquot extrazelluläre Proteinmatrix mit vorgekühlten Pipettenspitzen und 1,5 ml Zentrifugenröhrchen bei 200 l pro Tube.
  3. Verdünnen Sie 200 l extrazelluläre Proteinmatrix in vorgekühlten 20 ml Zellkulturmedien, um 1% extrazelluläre Proteinmatrixmedien herzustellen.
  4. Legen Sie einen sterilisierten Deckel (22 mm x 22 mm) in eine 35-mm-Platte. Legen Sie 400 l 1% extrazelluläre Proteinmatrixmedien auf den Deckschein.
  5. Legen Sie die 35-mm-Platte bei 37 °C bei 37 °C für 1 h, damit die extrazelluläre Proteinmatrix auf dem Deckellip polymerisieren kann.
  6. Wenn Sie die Suspensionszellkultur verwenden, machen Sie eine Einzelzellsuspension, wie in den Schritten 1.1 bis 1.5 beschrieben.
  7. Platte 5 x 104 Zellen auf einem extrazellulären Proteinmatrix-beschichteten Deckslip in einer 35 mm Platte platziert. Über Nacht plattierte Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Proteinmatrix unterstützt werden. Das Gesamtvolumen der Medien in der Platte sollte 3 ml betragen, damit die Medienhöhe 1 cm im Kulturgericht erreicht.
  8. Beobachten Sie die Zellen unter einem hellfeldmikroskop mit 10-facher Vergrößerungsobjektivlinse. Die Zellen sollten sich auf dem Deckelausstrich ausbreiten, anstatt zu schweben. Übertragen Sie die Kulturschale mit plattierten Zellen in einen sekundären Behälter wie eine Schaumstoffbox zur Bestrahlungsanlage auf einem Gebrauchswagen und bestrahlen Sie die Zellen, wie in Schritt 4 beschrieben.
  9. Bei Verwendung angefügter Zellkulturen (z. B. HEK-293-Zellen) verdauen Sie Zellen, wie in den Schritten 2.1 bis 2.6 beschrieben. Legen Sie 5 x 104 Zellen einen Tag vor der Bestrahlung in eine 35-mm-Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig an der Deckbedeckungsoberfläche befestigt sind, indem Sie sie wie in Schritt 3.9 unter dem Mikroskop beobachten. Verwenden Sie 3 ml DMEM-Medien, um die Flüssigkeit 1 cm in der Höhe in der Platte zu machen.
  10. Nach dem Anbau von Zellen auf Abdeckungen über Nacht oder bis zu einem Tag, übertragen Sie die Kulturschale mit plattierten Zellen in einem sekundären Behälter zur Bestrahlungsanlage. Ein Versorgungswagen kann verwendet werden, um das Verschüttungsrisiko zu verringern. Strahlen Sie Zellen, wie in Schritt 4 beschrieben.

4. Bestrahlung mit einem Linearbeschleuniger (LINAC)

  1. Mit der Konsolensoftware des LINAC stellen Sie den Beschleunigerportal und den Kollimator auf 0° ein, öffnen Sie die X- und Y-Backen auf eine symmetrische Feldgröße von 20 x 20 cm2 und ziehen Sie die Mehrblattkollimatoren (MLCs) zurück, falls vorhanden.
    HINWEIS: LINACs können einen Abflachungsfilter-freien (FFF) Modus haben, was sehr hohe Dosisraten ermöglicht. Wie der Name schon sagt, ist diese Strahlung nicht gleichmäßig (flach), und die hohe Dosiswirdin wird nur in der Mitte des Strahls erreicht. In diesem Fall wird ein Feld von 7 x 7 cm2 verwendet.
  2. Legen Sie mindestens 5 cm wasseräquivalentes Material auf die Behandlungscouch. Legen Sie die zu bestrahlende Zellschale bei 400 MU/min (Standarddosisrate) auf das wasseräquivalente Material und zentrieren Sie sie an den FAdenkreuzen von LINAC.
  3. Legen Sie die zu bestrahlenden Zellen in einer maximalen Dosistiefe in einen 6 MV Röntgenstrahl, ca. 1,5 cm. Legen Sie weitere 1 cm wasseräquivalentes Material auf die Schale. In Kombination mit dem 1 cm Medium, in dem die Zellen aufgehängt werden, wird die Zelle in einer durchschnittlichen Tiefe von 1,5 cm platziert.
  4. Befestigen Sie den vorderen Zeiger an den Kopf des LINAC. Erweitern Sie den vorderen Zeiger, bis er die Oberfläche des Aufbaumaterials kontaktiert, und notieren Sie den Abstand. Passen Sie die Tischhöhe an, bis der Abstand von der Quelle zur Aufbaufläche 100 cm beträgt.
    HINWEIS: Der Abstand kann mit der optischen Entfernungsanzeige bestätigt werden. Alternativ kann die optische Abstandsanzeige anstelle des Frontzeigers verwendet werden, um die Quelle auf 100 cm anzuhäufen.
  5. Berechnen Sie die entsprechende Anzahl von Monitoreinheiten (MU), um die gewünschte Strahlendosis an die Zellen zu liefern, und programmieren Sie den Beschleuniger, um bei 400 MU/min zu liefern.
    HINWEIS: Für die Einstellung der Quelle-Oberflächen-Entfernung (SSD) auf einem LINAC,-Setup, das kalibriert ist, um 1 cGy/MU in der Tiefe der maximalen Dosis zu liefern, wird die erforderliche Anzahl von Monitoreinheiten mit MU = Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20) berechnet, wobei OF für Denleistungsfaktor steht. Diese Berechnung muss für LINACs mit alternativen Kalibrierungseinstellungen geändert werden.
  6. Verlassen Sie den Behandlungstresor und überprüfen Sie, ob alle anderen Personen ausgestiegen sind. Vrify, dass es keine anderen Zellen im Raum, oder sie erhalten niedrige Dosen von Strahlung. Schließen Sie die Tresortür.
  7. Bestätigen Sie die Feldgröße, MU und MU/min an der Konsole, und aktivieren Sie dann den Balken.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.8 für die Zellen, die mit höheren oder niedrigeren Dosisraten bestrahlt werden sollen.
    1. Um mit dem Beschleuniger höhere Dosisraten (z.B. 2100 MU/min oder höher) zu erreichen, verringern Sie die SSD, um die effektive Dosisrate für die Zellen gemäß dem umgekehrten quadratischen Gesetz zu erhöhen: DoseRateEffective = Dosisrate * (100 cm / SSD_New)2.
    2. Bei niedrigen Dosisraten (z. B. 20 MU/min) erhöhen Sie die Quelle zum Oberflächenabstand (SSD_New), um die Dosiszurate zu verringern. Zum Beispiel kann die Zellkulturschale auf dem Boden des Behandlungsraums platziert werden.
    3. Berechnen Sie die Einstellung der Monitoreinheit auf dem Beschleuniger neu, wenn diese Einrichtung erforderlich ist, mit MU = Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD_New)2. Weitere Informationen zu MU-Berechnungen finden Sie unter Bezugnahme von McDermott und Orton18.
  9. Bestimmen Sie die Dosisrate in Gy/Minute durch DoseRate(Gy/Min) = Dose(Gy)*(MU/min)/MU. z.B., 4 Gy geliefert bei 400 MU/min erfordert 380 MU, so 4 *400/380 = 4.2 Gy/min. Siehe Tabelle 1.

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Abbildung 1 : Einrichtung der Zellkulturschale auf Linearbeschleuniger. (A) Ein klinischer Linearbeschleuniger wird angezeigt. (B) 5 cm wasseräquivalentes Material wird auf die Behandlungscouch gelegt. (C) Eine Zellkulturschale wird auf die Oberfläche des Materials gelegt. (D) Die Schale wird mit dem Beschleuniger Fadenkreuz im Behandlungsfeld durch das quadratische Lichtfeld gezeigt zentriert. (E) 1 cm wasseräquivalentes Material wird auf die Zellkulturschale gelegt. Die Quelle zum Oberflächenabstand (SSD) wird mit einer optischen Entfernungsanzeige (F, G) oder einem Frontzeiger (H, I) überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Biologische Assays nach Bestrahlung

  1. Kehren Sie die Zellen nach der Bestrahlung auf die gleiche Weise wie oben beschrieben in den Zellkultur-Inkubator zurück (Schritt 1.9, 2.8 und 3.10).
  2. Passen Sie bei Bedarf eine Vielzahl biologischer Assays an das Forschungsprojekt an.
    HINWEIS: Hier zeigen wir eine repräsentative Zellzyklusanalyse16 als Beispiel für einen biologischen Test nach bestrahlung.

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Ergebnisse

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Um den Zellzykluseffekt der Standarddosisrate und der extra hohen Dosisrate bestrahlung durch einen Linearbeschleuniger zu untersuchen, wurden mit diesem Protokoll drei Proben von glioma-stammähnlichen Zellen erstellt und 24 h nach Bestrahlung gesammelt17: eine Kontrollprobe nicht bestrahlt wurde (Abbildung 2A), eine mit 400 MU/min bestrahlte Probe (Monitoreinheit, 4,2 Gy/min Standarddosisrate, Abbildung 2B

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strahlentherapie ist ein integraler Bestandteil des Krebsmanagements. Die laufenden Bemühungen zielen darauf ab, die Wirksamkeit und Effizienz der Strahlenbehandlung zu verbessern. Fortschritte in der Linearbeschleunigertechnologie haben die Möglichkeit geboten, Patienten mit beispielloser Genauigkeit und Sicherheit zu behandeln. Da die meisten Patienten mit hochenergetischen Röntgenstrahlen von Linearbeschleunigern behandelt werden, können Studien, die die biologischen Auswirkungen einer großen Bandbreite von Dosisraten...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der Cleveland Clinic Department of Radiation Oncology für den Einsatz der Linearbeschleuniger. Wir danken Dr. Jeremy Rich für sein großzügiges Geschenk an Gliom-Stammzellen. Diese Forschung wurde von der Cleveland Clinic unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
gliom-stammähnliche Zelle 387Geschenk von Dr. Jeremy Rich
293 ZellenATCCCRL-1573
Neuronen-Stammzell-KulturmedienThermo FisherScientific 21103049NeurobasalTM
Medien DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific16000044
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122
Rekombinantes humanes EGF-ProteinR& D Systems236-EG-01M
Rekombinante humane FGF Basis-F&Technik D Systems4114-TC-01M
B-27™ NahrungsergänzungsmittelThermo Fisher Scientific17504044
NatriumpyruvatThermo Fisher Scientific11360070
L-GlutaminThermo FisherScientific 25030164
Tripsin-EDTAThermo Fisher25200056
extrazelluläre Proten-MatrixCorning354277 MatrigelTM
EthanolFisher ChemikalieA4094
Equipment
10 cm ZellkulturschaleDenvilleT1110
3,5 cm ZellkulturschaleUSA Scientific Inc.CC7682-3340
mm GlasdeckglasElektronenmikroskopieSciences 72210-10
15 ml ZentrifugenröhrchenThomas Scientific1159M36
50 ml ZentrifugenröhrchenThomas Scientific1158R10
5 ml PipetteFisher Scientific14-955-233
PipettierhilfeFisher Scientific13-681-06
Vortex-MischerFisher Scientific02-215-414
ZentrifugeEppendorf5810R
LinearbeschleunigerVariann/a
wasseräquivalentes MaterialSun Nuclear Corporation557Festes WasserTM
>Reagenzaufbereitung
DMEM-Medien10 % fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 & Mikro; g/mL Streptomycin in 500 ml DMEM-Medien
Stammzell-Kulturmedien10 ml B27-Supplement, 20 & Mikro; g hFGF, 20 µ g hEGF, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 & Mikro; g/mL Streptomycin in 500 ml Neurobasales Medium
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Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

StrahlentherapieZellbestrahlungDosisleistungsanalyseVorbereitung der ZellkulturGliom StammzellenZellzyklusanalysedosimetrische BerechnungenEinrichtung des Bestrahlungsraumswasser quivalentes Material

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