Method Article

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

DOI:

10.3791/59526

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June 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.

Abstract

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Neuromodulation übt starke Kontrolle über die Gehirnfunktion aus. Dysfunktion der neuromodulatorischen Systeme führt zu neurologischen und psychiatrischen Störungen. Trotz ihrer Bedeutung, Technologien für die Verfolgung neuromodulatorischen Ereignisse mit zellulärer Auflösung sind gerade erst beginnen zu entstehen. Neuromodulatoren, wie Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin und Serotonin, lösen intrazelluläre Signalereignisse über ihre jeweiligen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aus, um neuronale Erregbarkeit, synaptische Kommunikation und andere neuronale Funktionen, wodurch die Informationsverarbeitung im neuronalen Netzwerk reguliert wird. Die oben genannten Neuromodulatoren konvergieren auf den cAMP/Proteinkinase A (PKA) Weg. Daher wurde die in vivo PKA-Bildgebung mit einzelzelliger Auflösung als Auslese für neuromodulatorische Ereignisse in einer Art und Weise entwickelt, die der Kalzium-Bildgebung für neuronale elektrische Aktivitäten entspricht. Hierbei wird eine Methode zur Visualisierung der PKA-Aktivität auf der Ebene einzelner Neuronen im Kortex von kopffixierten Benehmen von Mäusen vorgestellt. Dazu kommt ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter (AKAR), genannt tAKAR, zum Einsatz, der auf der Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) basiert. Dieser genetisch kodierte PKA-Sensor wird über die Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder die stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) in den motorischen Kortex eingeführt. FRET-Änderungen werden mit der zweiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (2pFLIM) dargestellt, die Vorteile gegenüber ratiometrischen FRET-Messungen zur Quantifizierung des FRET-Signals im lichtstreuenden Hirngewebe bietet. Um PKA-Aktivitäten während der erzwungenen Fortbewegung zu untersuchen, wird tAKAR durch ein chronisches Schädelfenster über dem Kortex von wachen, kopffixierten Mäusen abgebildet, die auf einem geschwindigkeitsgesteuerten motorisierten Laufband laufen oder ruhen. Dieser bildgebende Ansatz wird auf viele andere Hirnregionen anwendbar sein, um entsprechende verhaltensinduzierte PKA-Aktivitäten zu untersuchen, und auf andere FLIM-basierte Sensoren für die In-vivo-Bildgebung.

Introduction

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Neuromodulation, auch bekannt als langsame synaptische Übertragung, erzwingt eine starke Kontrolle über die Gehirnfunktion während verschiedener Verhaltenszustände, wie Stress, Erregung, Aufmerksamkeit, und Fortbewegung1,2,3, 4. Trotz seiner Bedeutung steckt die Untersuchung, wann und wo neuromodulatorische Ereignisse stattfinden, noch in den Kinderschuhen. Neuromodulatoren, einschließlich Acetylcholin, Dopamin, Noradrenalin, Serotonin und viele Neuropeptide, aktivieren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wiederum intrazelluläre zweite Botenwege mit einem breiten Zeitskala-Spektrum auslösen von Sekunden bis Stunden. Während jeder Neuromodulator eine reihe von Signalereignissen auslöst, ist der cAMP/Proteinkinase A (PKA) Signalweg ein gemeinsamer downstreamer Weg für viele Neuromodulatoren1,5. Der cAMP/PKA-Signalweg reguliert die neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und Plastizität6,7,8,9, und stimmt daher die neuronale Netzwerkdynamik an. Da verschiedene Neuronen oder neuronale Typen unterschiedliche Typen oder Ebenen von Neuromodulatorrezeptorrezeptoren10ausdrücken, können die intrazellulären Wirkungen desselben extrazellulären Neuromodulators über verschiedene Neuronen hinweg heterogen sein und müssen daher mit zellulärer Auflösung untersucht. Bis heute, Es bleibt schwierig, neuromodulatorische Ereignisse in einzelnen Neuronen in vivo während des Verhaltens zu überwachen.

Um die raumzeitliche Dynamik der Neuromodulation zu untersuchen, ist eine geeignete Aufzeichnungsmodalität erforderlich. Mikrodialyse und schnell-scanzyklische Voltammetrie werden häufig verwendet, um die Freisetzung von Neuromodulatoren zu untersuchen, aber sie haben keine räumliche Auflösung, um zelluläre Ereignisse zu überwachen11,12. Analog zu Kalzium-Dynamik als Proxy für neuronale elektrische Aktivität in der Population Bildgebung verwendet werden13,PKA-Bildgebung kann verwendet werden, um neuromodulatorische Ereignisse über eine neuronale Bevölkerung bei zellulärer Auflösung auszulesen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung eines verbesserten A-Kinase-Aktivitätsreporters (AKAR), um PKA-Aktivitäten in vivo während des Verhaltens von Tieren zu überwachen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung neuronaler Populationen mit subzellulärer Auflösung mit einer zeitlichen Auflösung, die physiologische neuromodulatorische Ereignisse nachverfolgt.

AKARs bestehen aus einem Spender und einem Akzeptor fluoreszierenden Proteinen, die durch ein PKA-Phosphorylierungssubstratpeptid und eine Gabelkopf-assoziierte Domäne (FHA) miteinander verbunden sind, die an das phosphorylierte Serin oder Threonin des Substrats14,15bindet. Bei Aktivierung des PKA-Signalwegs wird das Substratpeptid von AKAR phosphoryliert. Dadurch bindet die FHA-Domäne an das phosphorylierte Substratpeptid und bringt so die beiden Fluorophore in die Nähe, die als geschlossener Zustand von AKAR bezeichnet werden. Der geschlossene Zustand eines phosphorylierten AKAR führt zu einer erhöhten Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) zwischen Spender und Akzeptorfluorophoren. Da der Anteil der phosphorylierten AKARs mit dem Niveau der PKA-Aktivität16zusammenhängt, kann die Menge an FRET in einer biologischen Probe verwendet werden, um das Niveau der PKA-Aktivität16,17,18, 19,20.

Frühe Versionen von AKARs wurden in erster Linie für zweifarbige ratiometrische Bildgebung14entwickelt. Bei der Tieferung der Bildgebung in das Hirngewebe leidet die ratiometrische Methode unter Signalverzerrungen durch wellenlängenabhängige Lichtstreuung17,18,21. Wie unten erläutert, beseitigt die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) dieses Problem, da FLIM nur Photonen misst, die vom Spenderfluorophor18,21emittiert werden. Daher ist die FLIM-Quantifizierung von FRET nicht von der Gewebetiefe17betroffen. Darüber hinaus kann eine "dunkle" (d.h. niedrige Quantenausbeute [QY]) Variante des Akzeptorfluorophors verwendet werden. Dies befreit einen Farbkanal, um die Multiplexmessung orthogonaler neuronaler Eigenschaften durch gleichzeitige Abbildung eines zweiten Sensors oder eines morphologischen Markers17,19,20zu erleichtern.

FLIM Imaging quantifiziert die Zeit, die ein Fluorophor im angeregten Zustand verbringt, d.h. die Fluoreszenzlebensdauer18. Die Rückkehr eines Fluorophors in den Bodenzustand, also das Ende des aufgeregten Zustandes, koncomitiert oft mit der Emission eines Photons. Obwohl die Emission eines Photons für ein einzelnes angeregtes Molekül stochastisch ist, ist in einer Population die mittlere Fluoreszenzlebensdauer ein Merkmal dieses bestimmten Fluorophors. Wenn eine reine Population von Fluorophoren gleichzeitig angeregt wird, folgt die resultierende Fluoreszenz einem einzigen exponentiellen Zerfall. Die Zeitkonstante dieses exponentiellen Zerfalls entspricht der mittleren Fluoreszenzlebensdauer, die bei fluoreszierenden Proteinen in der Regel zwischen einer und vier Nanosekunden liegt. Die Rückkehr eines angeregten Spenderfluorophors in den Bodenzustand kann auch durch FRET erfolgen. In Gegenwart von FRET wird die Fluoreszenzlebensdauer des Spenderfluorophors reduziert. Die nichtphosphorylierten AKARs weisen eine relativ längere Spenderfluoreszenzlebensdauer auf. Nach der Phosphorylierung durch PKA weist der Sensor eine kürzere Lebensdauer auf, da Spender- und Akzeptorfluorophore nahe beieinander gebracht werden und FRET erhöht wird. Die Quantifizierung der Fluoreszenzlebensdauer in einer Population von AKARs stellt daher das Niveau der PKA-Aktivität dar.

Frühe Versionen von AKARs wurden nicht erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung bei einzelliger Auflösung eingesetzt. Dies ist vor allem auf die geringe Signalamplitude der AKAR-Sensoren zu physiologischen Aktivierungen17zurückzuführen. Kürzlich wurde durch den systematischen Vergleich verfügbarer AKAR-Sensoren für die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Mikroskopie (2pFLIM) ein Sensor namens FLIM-AKAR gefunden, der alternative Sensoren übertrifft. Darüber hinaus wurde eine Reihe von FLIM-AKAR-Varianten, die als gezielte AKARs (tAKARs) bezeichnet werden, entwickelt, um die PKA-Aktivität an bestimmten subzellulären Standorten zu visualisieren: Mikrotubuli (tAKAR), Cytosol (tAKAR), Actin (tAKAR), fadenförmiges Actin (tAKAR), Membran (tAKAR), postsynaptische Dichte (tAKAR). Bei den tAKARs erhöhte tAKAR die Signalamplitude, die durch Noradrenalin ausgelöst wurde, um das 2,7-fache. Dies steht im Einklang mit dem Wissen, dass die Mehrheit der PKA in Neuronen in Mikrotubuli im Ruhezustand verankert sind22,23. tAKAR war der beste Performer unter den bestehenden AKARs für 2pFLIM. Darüber hinaus erkannte tAKAR-Funktion physiologisch relevante PKA-Aktivität, die von mehreren Neuromodulatoren ausgelöst wurde, und die Expression von tAKAR-Funktion verändert enden keine neuronalen Funktionen17.

Kürzlich wurde tAKAR- erfolgreich eingesetzt, um PKA-Aktivitäten bei kopffixierten Benahmemäusen17zu visualisieren. Es wurde gezeigt, dass erzwungene Fortbewegung DIE PKA-Aktivität im Soma der oberflächlichen Schichtneuronen (Schicht 1 bis 3, bis zu einer Tiefe von 300 m von Pia) im Motor, Fass und visuellen Kortiken auslöste. Die durch Fortbewegung ausgelöste PKA-Aktivität war zum Teil von der Signalisierung über adrenerge Rezeptoren und D1-Dopamin-Rezeptoren abhängig, wurde aber nicht von einem D2-Dopamin-Rezeptor-Antagonisten beeinflusst. Diese Arbeit veranschaulicht die Fähigkeit von tAKARs, Neuromodulationsereignisse in vivo mit 2pFLIM zu verfolgen.

Im aktuellen Protokoll wird die gesamte Methode zur PKA-Aktivitätsbildgebung bei kopffesten Wachmäusen während eines erzwungenen Fortbewegungsparadigmas in sechs Schritten beschrieben. Erstens, die Hinzufügung von 2pFLIM-Fähigkeiten zu einem herkömmlichen Zwei-Photon-Mikroskop (Abbildung 1). Zweitens der Bau eines motorisierten Laufbandes (Abbildung 2). Drittens, die Expression des tAKAR-Sensors im Mauskortex durch Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV). Ausgezeichnete Protokolle für Operationen für IUE24,25 und stereotaxic Injektion von Viruspartikeln26 wurden bereits veröffentlicht. Die wichtigsten Parameter, die wir verwendet haben, werden unten beschrieben. Forth, die Installation eines Schädelfensters. Ausgezeichnete Protokolle wurden bereits für die Schädelfensterchirurgie veröffentlicht27,28. Es werden mehrere Schritte beschrieben, die aus den Standardprotokollen geändert wurden. Fünftens, Durchführung in vivo 2pFLIM. Sechstens, die Analysen von 2pFLIM-Bildern (Abbildung 3 und Abbildung 4). Dieser Ansatz sollte leicht auf viele andere kopffixierte Verhaltensparadigmen und Gehirnbereiche anwendbar sein.

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Protocol

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University genehmigt.

1. 2pFLIM Mikroskop-Setup

  1. Installieren Sie ein Photonen-Timing-Zählmodul (PTCM, Materialtabelle) und verbinden Sie sich gemäß herstellerhandbuch mit dem Computer (Abbildung 1).
    HINWEIS: Das PTCM ist in der Regel eine Computerplatine, die einen "Sync"-Eingang für das Laserpuls-Timing und einen Photoneneingang aus dem Photomultiplier-Rohr (PMT) erhält. Es empfängt auch Takt-Timing für Pixel, Linien und Frames, von Zwei-Photon-Imaging-Steuerungssoftware. Der PTCM verwendet die Taktsignale, um einzelne Photonen in verschiedene Pixel und Frames zu unterteilen.
  2. Fügen Sie eine Photodiode mit >200 MHz Bandbreite hinzu, um das Laser-Timing zu messen. Legen Sie einen Standard-Glasdeckel in den Lichtpfad, um einen kleinen Bruchteil des Laserlichts in die Photodiode zu reflektieren, die senkrecht zum Lichtpfad platziert ist (Abbildung 1). Schließen Sie den Photodiodenausgang an den "Sync"-Eingang des PTCM an.
    HINWEIS: Viele moderne Laser geben auch das Laser-Timing aus. Für diese Laser ist die Photodiode nicht notwendig, und man kann den Laser-Timing-Ausgang direkt an den Sync-Eingang des PTCM anschließen.
  3. Tauschen Sie das PMT, im Falle des tAKAR, des grünen Kanals PMT, mit einem geräuscharmen, schnellen GaAsP PMT (Abbildung 1) aus. Schließen Sie den PMT-Ausgang an den Signaleingang des PTCM an.
    1. Fügen Sie einen optionalen Signalsplitter hinzu (Abbildung 1), wenn eine gleichzeitige Erfassung der Intensität über den herkömmlichen Zwei-Photon-Bildkanal gewünscht wird. Schließen Sie den PMT-Ausgang an den Signalteiler an und verbinden Sie den Splitterausgang mit dem PTCM und dem herkömmlichen Zwei-Photon-Bildgebungsmodul.
      HINWEIS: GaAsP-PMTs geben schnellere Single-Photon-Signale als herkömmliche Bialkali-PMTs und ermöglichen eine genauere Bestimmung des Photonen-Timings. Bestimmte Modelle von GaAsP PMTs können auf 10 bis 35 °C unter der Umgebungstemperatur gekühlt werden, so dass die Unterdrückung von Dunkelzahlen auf ein Niveau unter einigen hundert pro Sekunde (in der Regel 200 Zählungen/s) möglich ist. Dieser niedrige Geräuschpegel ist wichtig für die präzise Messung der Fluoreszenzlebensdauer, da die Anzahl der Rauschenphotonen nicht einfach von der Fluoreszenzlebensdauerkurve unterschieden oder subtrahiert werden kann.
  4. Fügen Sie einen Bandpass-Fluoreszenz-Emissionsfilter hinzu, der die Spektralkontamination, falls vorhanden, durch das Akzeptorfluorophor minimiert. Zum Beispiel wird für tAKAR- ein 500 nm x 20 nm Barrierefilter für den grünen Kanal verwendet, um die Kontamination durch den Akzeptor sREACh zu reduzieren, das ein dunkles (QY 0,07) gelbes fluoreszierendes Protein (YFP)29,30ist. Verbinden Sie Timing-Signale, wie z. B. die Uhren für einzelne Bildpixel, Linien und Frames, entsprechend der Steuerungssoftware, die im PTCM-Benutzerhandbuch beschrieben ist. Installieren Sie die entsprechende Datensteuerungs- und Erfassungssoftware.
    HINWEIS: Einige PTCM-Hersteller (Tabelle der Materialien) bieten ihre Software für 2pFLIM Bildgebung. Hier kommt eine benutzerdefinierte Software namens FLIMimage zum Einsatz, die vom Yasuda Lab (Max-Planck-Florida, über persönliche Kommunikation) entwickelt wurde. Diese Software fungiert als Add-on-Benutzerfunktion zu bestimmten Zwei-Photonen-Erfassungssoftware (Tabelle der Materialien). Es steuert und kommuniziert mit dem PTCM zu dem geeigneten Zeitpunkt während der Zwei-Photon-Bildgebung, um 2pFLIM-Bilder zu erfassen.

2. Bau eines motorisierten Laufbandes

HINWEIS: Das Design des kundenspezifischen motorisierten Laufbandes ist in Abbildung 2dargestellt.

  1. Mit einer feinen Hacksäge eine Schaumstoffwalze (ca. 200 mm) auf 150 mm Länge schneiden. Alternativ können Sie die beiden Hälften einer Schaumkugel zusammenkleben und Klebeband über die Naht legen. Optional kleben Sie eine Gummimatte mit Profil auf der Rolle, um die Traktion auf der Walze zu erhöhen.
  2. Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1,4 Zoll durch die Mitte der Walze an der flachen Seite der Walze oder bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1,4 Zoll durch die Mitte jeder Kugelhälfte, wenn die Schaumkugel verwendet wird.
  3. Installieren Sie eine Stahlachse mit einem Durchmesser von 1/4 Zoll durch das Loch. Kleben Sie die Schaumstoffwalze/Kugel mit schaumkompatiblem Kleber an die Achse. Optional können Sie zwei flexible Wellenkupplungen (1/4 Zoll Innendurchmesser) modifizieren, um die Kopplung der Achse an die Schaumwalze/Kugel zu verstärken.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass viele gängige Klebstoffe Schaum auflösen können.
    1. Positionieren Sie die Wellenkupplung für jede Wellenkupplung auf ihrer flachen Seite und in der Mitte der Rechteck-Metallplatte (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Schweißen Sie die Platte an die Wellenkupplung. Bohren Sie ein 1/4 Zoll Loch in der Mitte der Platte, um den Einbau der modifizierten Wellenkupplung auf die Achse und zwei Schraublöcher in die Metallplatte seitlich von der Mitte zu ermöglichen.
    2. Installieren Sie die Wellenkupplung auf der Achse gegen die Schaumstoffwalze/Kugel. Wenn Sie letztere verwenden, biegen Sie die Platte leicht, um die Krümmung des Balles zu passen. Legen Sie Schrauben in die seitlichen Löcher, um die Rolle/Kugel an der Achse zu befestigen.
  4. Bohren und tippen Sie auf ein 3/8-32 Gewinde in der Mitte einer Käfigplatte und installieren Sie den Drehgeber. Bohren Sie ein Schraubloch in die Basis der rechtwinkligen Motorhalterung, um die Befestigung des Motors am Pfostenhalter zu ermöglichen. Befestigen Sie sowohl den Drehgeber als auch den Motor mit einer flexiblen Wellenkupplung am Ende der Achse.
  5. Installieren Sie das montierte Laufband auf einer Aluminium-Brotplatine mit Pfosten für motorisch und Drehgeber (Abbildung 2). Schließen Sie die Motoreingänge an den Drehzahlregler und den Drehgeberausgang an einen analogen Eingang der Datenerfassungsplatine (DATA Acquisition).
    HINWEIS: Die Drehwinkelgeschwindigkeit wird vom Drehgeber als Spannung kodiert und mit einer benutzerdefinierten Software namens AnimalTracker in MATLAB digitalisiert.
  6. Installieren Sie den Kopfplatten-kompatiblen Halter an einer rechtwinkligen Halterung. Installieren Sie einen massiven Pfosten auf der Brotplatte vor dem Laufband und installieren Sie den montierten Kopfplattenhalter mit der rechtwinkligen Halterung am Pfosten (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass die Kopfplattenhalter an der Achse so ausgerichtet sind, dass die Maus eine angemessene und bequeme Gehposition auf dem Laufband einnehmen kann (Abbildung 2C).

3. Ausdruck des tAKAR-Sensors im Maus-Cortex

  1. In der Utero-Elektroporation
    1. Bereiten Sie eine DNA-Lösung für IUE vor, indem Sie einer Plasmid-DNA (3,4 g/l) eine Endkonzentration von 0,2 % des schnellen grünen Farbstoffs (zur Visualisierung während der Injektion) hinzufügen; der Sensor konstruktiert, die einen CAG-Promotor, eine Sensorsequenz und ein Holzhacken-Hepatitis-Virus enthält. post-transkriptionsresponse element [WPRE] translational enhancer) gelöst/verdünnt in Wasser oder Tris-EDTA.
    2. Bereiten Sie eine schwangere weibliche Maus (z. B. C57BL/6) für IUE bei E1624vor. Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (4% für Dieduktion und 1,5%für die Wartung, auf 95% O2 mit 5% CO2 ) und subkutane Injektion von perioperativen Analgetika mit 5 mg/kg Meloxicam und 4 mg/kg Bupivacaine anwenden. Die Bauchhöhle mit einem Skalpell und einer Schere aufschneiden und die Uterushörner vorsichtig aussetzen.
    3. Injizieren Sie 1 L DNA-Lösung pro Embryo in den lateralen Ventrikel einer Hemisphäre, wie zuvor beschrieben24.
    4. Führen Sie regelmäßige IUE24 für kortikale Neuronen durch, indem Sie den positiven Elektrodenendfuß am Kortex platzieren und fünf 100-ms-Quadratimpulse (38 V) bei 1 Hz mit einem Elektroporator verwenden.
      HINWEIS: Verschiedene kortikale Bereiche können für die Elektroporation gezielt werden, indem die Platzierung des Elektrodenendfußes relativ zum seitlichen Ventrikel geändert wird.
  2. Stereotaxic-Injektion
    1. Bereiten Sie eine Maus am postnatalen Tag 30 für stereotaxic Chirurgie26. Anästhesisieren Sie die Maus wie in Schritt 3.1.2 beschrieben, und wenden Sie subkutane Injektion von perioperativen Analgetika mit 5 mg/kg Carprofen an.
    2. Verdünnung des AAV-Serotyps 2/1 (AAV2/1) mit dem Ausdruck von hSyn-tAKAR-WPRE zu einem empirisch ermittelten Titer (1 x 109x 1010 Genome/L) in spritzgefilterter (0,2 m Celluloseacetatmembran) Phosphat-gepufferter Saline.
    3. Bohren Sie ein Loch mit einem Handbohrer unter einem Stereomikroskop mit folgenden Koordinaten für den Motorkortex: 0,5 mm vordem zum Bregma, 1,2 mm seitlich bis mittelseitig.
    4. Montieren Sie einen Injektor (z. B. ölhydraulischer Manipulator, mit maßgeschneidertem Kolben-Glas-Pipette-Halter) an einem motorisierten Manipulator. Legen Sie die Injektionsnadel in einem 15°-Winkel relativ zur Bregma-Lambda-Ebene. Programmieren Sie eine diagonale Bewegung über die x- und z-Achsen, die einer Progression von 700 m bzw. 200 m entlang der vorderen-posterioren bzw. dorsal-ventralen Achsen entspricht.
      HINWEIS: Um Schäden am Gewebe direkt über dem vorgesehenen Bildfeld zu vermeiden, werden AAV-Partikel in einem Winkel relativ zur Bregma-Lambda-Ebene injiziert.
    5. Positionieren Sie die Spitze der Injektionsnadel an der Pia in der Mitte des Bohrlochs, und führen Sie langsam die oben beschriebene Diagonalbewegung (ca. 25 m/s) aus. Bei diesem Verfahren wird der Injektionsmittelpunkt bei 1,2 mm vor dem Bregma, 1,2 mm seitlich bis mittelseitig, 0,2 mm unterhalb der Pia positioniert.
    6. Injizieren Sie 20 nL verdünnte Viruspartikel (ca. 10 nL/min). Warten Sie mindestens 10 min und ziehen Sie die Injektionsnadel langsam ein (ca. 12,5 m/s).
    7. Beenden Sie das stereotaxic Injektionsverfahren und kleben /nähen Sie die Haut26.

4. Installation des Cranial-Fensters

  1. Führen Sie die Platzierung des Schädelfensters an Mäusen durch, die tAKAR über IUE (Abschnitt 3.1) oder stereotaxic Injektion von Viruspartikeln (Abschnitt 3.2) zwischen den postnatalen Tagen 30 und 60 exezieren. Für Maus mit Viralpartikeln infiziert, implementieren Sie das Schädelfenster mindestens zwei Wochen nach der Virusinjektion. Installieren Sie das Schädelfenster wie zuvorbeschrieben 27,28, mit den folgenden Details. Anästhesisieren Sie die Maus wie in Schritt 3.1.2. beschrieben, und wenden Sie subkutane Injektion von perioperativen Analgetika 0,075 mg/kg Buprenex und entzündungshemmendem Mittel Dexamethason bei 4 mg/kg an.
  2. Entfernen Sie das Periosteum und ziehen Sie den Nackenmuskel zurück. Kleben Sie den Rand der Haut mit Gewebekleber an den Schädel, um eine Exposition der Halsmuskulatur nach der Operation zu vermeiden.
  3. Trocknen und entfernen Sie jedes Periost aus dem Schädel, indem Sie sanft mit einem Skalpell kratzen. Platzieren Sie die bildgebende Kopfplatte (8 mm Innendurchmesser), um das vorgesehene Bildgebungsfeld zu umgeben. Kleben Sie die Kopfplatte mit Cyanoacrylat-Kleber an den Schädel, gefolgt von zahnärztlichem Acrylzement. Für eine optimale Haftung sorgen Sie dafür, dass die Kopfplatte auf dem freiliegenden und getrockneten Schädel ruht. Kleberbeschleuniger kann verwendet werden, um die Härtung zu beschleunigen.
  4. Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer einen Kreis mit einem Durchmesser von 5 mm über dem vorgesehenen Bildfeld (Koordinaten gemäß Schritt 3.2.3) und setzen Sie die Dura mater aus.
  5. Tragen Sie eine dünne Schicht aus transparentem Polymer, auch künstliche Dura genannt, auf die Dura-Oberfläche auf, um das gesamte Schädelfenster zu bedecken. Das Polymer schützt und stabilisiert die Dura mater. Legen Sie einen sterilen kreisförmigen Abdeckslip (5 mm Durchmesser) auf die Dura mater. Sichern Sie den Deckelrutsch mit Cyanoacrylatkleber, der um die Ränder des Fensters aufgetragen wird, gefolgt von Zahnacrylzement.

5. In Vivo Zweiphotonen Fluoreszenz Lifetime Imaging Mikroskopie

  1. Beginnen Sie 2pFLIM Bildgebung bei oder darüber hinaus 2 Wochen nach der Installation des Schädelfensters (Abschnitt 4). Minimieren Sie experimentelle Interferenzen durch Stress durch häufige Handhabung und Scruffing der Maus vor Dem Beginn der Bildgebungsstudie, um die Maus zu gewöhnen.
  2. Stellen Sie die Wellenlänge des zweiphotonen Anregungslasers auf 960 nm mit der Software ein, die den Zwei-Photonen-Laser steuert.
  3. Anästhesisieren Sie die Maus mit 4% Isofluran. Bestätigen Sie die richtige Anästhesisierung durch Schwanz-Pinch und beobachten Atemfrequenzen. Das heißt, es sollte keine Reaktion auf die Schwanz-Pinch geben und die Atemfrequenz sollte auf 1 Atempro Sekunde reduziert werden. Um unnötige Verfahrenszeit zu minimieren und da die Anästhesie nur zwei bis drei Minuten dauert, werden keine Augenschmierstoffe verwendet.
  4. Übertragen Sie die anästhesierte Maus auf das motorisierte Laufband (Abbildung 2C) und montieren Sie die Kopfplatte der Maus am Kopfplattenhalter des Laufbandaufbaus (Details siehe Abbildung 2). Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensterdeckels an der Maus mit 70% Ethanol.
  5. Platzieren Sie das motorisierte Laufband mit der montierten Maus unter das 2pFLIM-Objektiv. Tragen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen dem Schädelfenster-Abdeckungsrutsch und dem Objektiv auf.
  6. Lassen Sie die montierte Maus aus der Anästhesie aufwachen und sich für mindestens 10 min an das Laufband und die Mikroskopumgebung akklimatisieren. Überwachen Sie die Beatmungsrate der Maus, während die montierte Maus aus der Anästhesie erwacht.
  7. Navigieren Sie unter Epi-Beleuchtung zur Injektionsposition. Dokumentieren Sie die handelsrechtlichen Merkmale (d. h. blutgefäße) unter hellem Feld, um die Bildgebung derselben Region von Interesse (ROI) während nachfolgender Bildgebungssitzungen zu unterstützen.
  8. Beseitigen Sie jedes eintreffende Licht außer dem emittierten Licht aus dem Gehirngewebe. Schalten Sie die Epi-Beleuchtungslichtquelle aus und schließen Sie das Gehäuse des 2pFLIM-Rigs. Aktivieren Sie den 2pFLIM PMT, indem Sie die Hardware-Befehlsspannungssteuerung einschalten.
  9. Erwerben Sie ein z-stack 2pFLIM-Bild mit der 2pFLIM Erfassungssoftware FLIMimage mit den folgenden empfohlenen Einstellungen für die Abbildung von tAKAR-positivem Somata bei wachen Mäusen. Legen Sie die Bildmittelung auf 3 Frames, die Scangeschwindigkeit auf 2 ms/Linie, die Bildgröße auf 128 x 128 Pixel und das Sichtfeld auf 90 bis 100 m fest. Passen Sie die Bildeinstellungen basierend auf der Vorbereitung s- und Hardwarekonfiguration an.
  10. Prüfen Sie das aufgenommene Bild in FLIMview (inhouse entwickelte benutzerdefinierte Software; siehe Abschnitt 6). Passen Sie die Bildeinstellungen nach Schritt 5.9 an, um die Photonenanzahl zu optimieren und photobleaching zu minimieren.
    HINWEIS: Eine praktikabelintegrierte Photonenanzahl in einem ROI für die lebensdauer Bildgebung eines tAKAR-positiven Soma in vivo beträgt 1.000 bis 10.000 Photonen, abhängig von der Signalamplitude, die sich aus einem bestimmten Stimulus ergibt (siehe Diskussion).
    1. Verwenden Sie bei Bedarf ein verringertes Sichtfeld, eine verringerte Scangeschwindigkeit, eine erhöhte Laserleistung und eine erhöhte Anzahl von Frames, die gemittelt werden sollen, um die anzahl der integrierten Photonen zu erhöhen und den Schätzfehler für die Lebensdauer zu reduzieren. Achten Sie gleichzeitig darauf, die minimale wichtige Laserleistung, Frame-Mittelung und Scangeschwindigkeit zu verwenden, um photobleaching zu minimieren.
  11. Bild in einem regelmäßigen Zeitintervall (z.B. alle 30 bis 60 s) durch Wiederholung der Z-Stack-Erfassung unter Verwendung der in Schritt 5.10 ermittelten Einstellungen. Erfassen Sie Baseline 2pFLIM-Bilder für mindestens 15 min bei Null Laufbandgeschwindigkeit.
  12. Stellen Sie die Drehgeschwindigkeit des Laufbandes für 15 min auf 15 cm/s, während Sie 2pFLIM-Bilder erfassen. Setzen Sie die Bildgebung für 20 min nach dem Abschalten der Laufbandrotation fort, um die Dauer der PKA-Aktivität nach Beendigung der erzwungenen Fortbewegung zu bewerten.

6. Analyse von 2pFLIM Bildern

  1. Öffnen Sie die erfassten Bilder in FLIMview, und legen Sie die folgenden Parameter in der FLIMview fest.
    HINWEIS:     Parameterdetails werden in DISCUSSION beschrieben.
    1. Klicken Sie in FLIMview auf die Minimal- und Maximalbereichsfelder (Single Photon Counting, SPC). Geben Sie den entsprechenden minimalen und maximalen SPC-Bereichswert ein, der in der Regel zwischen 1,2 und 10 bis 12 ns liegt.
    2. Klicken Sie in FLIMview auf das T 0-Wertfeld und geben Sie den t 0-Wert ein (in der Regel 2 ns). Klicken Sie in FLIMview auf das Feld für den Mindestschwellenwert für die Lebensdauer der Luminanz in FLIMview, und geben Sie den gewünschten Schwellenwert auf 5 bis 30 Photonen ein.
  2. Klicken Sie auf die neue Gruppenschaltfläche (N) und weisen Sie einen Versuchsgruppennamen zu. Dadurch wird eine Gruppe generiert, die Daten aus jedem hinzugefügten FLIM-Image kombiniert.
  3. Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche im Roi Controls-Modul von FLIMview und zeichnen Sie einen ROI um ein tAKAR-positives Soma. Reduzieren Sie den Z-Stack-Bereich, indem Sie die untere und obere Z-Grenze in den Z-Stack Control-Schiebereglern in FLIMview verschieben, um die Signalkontamination durch Hintergrundphotonen in anderen z-Tiefen zu minimieren.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche +, um das FLIM-Bild zur Gruppe hinzuzufügen (Schritt 6.2). Klicken Sie auf die Schaltfläche Calc, um die mittlere Lebensdauer (LT, auch als mittlere Photonenemissionszeit [MPET] bezeichnet) für den ROI und den Lebensdauerschätzungsfehler zu berechnen.
  5. Öffnen Sie die nächste Datei in der chronischen 2pFLIM Bildgebungsserie. Wiederholen Sie Schritt 6.4. Achten Sie darauf, die Position des ROI- und Z-Stack-Bereichs anzupassen, um das gleiche tAKAR-positive Soma im Laufe der Zeit zu messen, da es im Laufe der Zeit zu Gewebedriften führen kann.
  6. Wählen Sie deltaMPET/MPET0 im Dropdown-Menü des Moduls Gruppensteuerungen aus. Klicken Sie auf das Basisfeld und geben Sie den Index(es) ein (z. B. 1 2 3 4 5 für die ersten fünf Bilder in der in Schritt 6.3 erstellten Gruppe). Dadurch werden die Bilder definiert, die zur Berechnung der Basislebensdauer verwendet werden (LT0).
  7. Klicken Sie auf Plotten, um ein Diagramm zu generieren, das während des Experiments in den definierten ROIs die FLIM-Antwort (LT/LT0) von tAKAR enthält. Normalisierte Veränderungen der Lebensdauer einzelner ROIs durch die entsprechende Basislebensdauer (LT0) ermöglichen den Vergleich der PKA-Aktivität während der Fortbewegung über verschiedene ROIs hinweg.

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Results

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FRET-FLIM-Sensoren ermöglichen die Visualisierung vieler verschiedener Signalwege, einschließlich des cAMP/PKA-Signalwegs, der an der Neuromodulation beteiligt ist. Das aktuelle Protokoll nutzt den kürzlich entwickelten tAKAR-Sensor in Kombination mit 2pFLIM, um PKA-Aktivitäten bei kopffesten Benahmemäusen zu visualisieren. Die meisten vorhandenen Zwei-Photonen-Mikroskope können mit 2pFLIM-Fähigkeiten aufgerüstet werden, indem drei zu vier Komponenten hinzugefügt werden, wie in

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des FRET-FLIM-Sensors tAKAR, um neuromodulationsgesteuerte PKA-Aktivität bei kopffixierten Verhaltensmäusen zu visualisieren. Diese Anwendung basiert auf umfangreichen Tests und Charakterisierungen von tAKAR in vitro und in vivo, um zu zeigen, dass das erhaltene FLIM-Signal für physiologische neuromodulatorische Ereignisse relevant ist17. Hier wird eine In-vivo-Anwendung, die bewegungsinduzierte PKA-Aktivität im motorischen Kortex, verwendet, um die Ver...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Frau Tess J. Lameyer, Frau Ruth Frank und Dr. Michael A. Muniak für die Bearbeitungen und Kommentare und Dr. Ryohei Yasuda von Max Planck Florida für 2pFLIM Akquisitionssoftware. Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei BRAIN Initiative Auszeichnungen U01NS094247 (H.Z. und T.M.) und R01NS104944 (H.Z. und T.M.), ein R01 Stipendium R01NS081071 (T.M.) und ein R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle Auszeichnungen stammen vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, USA.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m Spritzenvorsatzfilter aus CelluloseacetatNalgene190-2520Schritt 3.2.2.
16x 0,8 NA Wasser-ImmersionsobjektivNikonMRP07220Step 5.5.
3-poliges KabelUS digitalCA-MIC3-SH-NCSchritt 2.5. Zum Anschluss des Rotationssensors an den Datenerfassungseingang des Mikroskops
Aluminium-BrotbrettThorlabsMB1012Schritt 2.5.
AnimalTracker MATLAB SoftwareN/AN/ASchritt 2.5 und Abschnitte 5 - 6. Wird auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt
Bandpass-BarrierefilterChromaET500-40mSchritt 1.4.
KäfigplatteThorlabsCP01Schritt 2.4. Wird als Halterung für Rotationssensor verwendet
Kohlenstoffstahlfräser für Mikrobohrer, 0,5 mm SpitzendurchmesserFST19007-05Schritte 3.2.3. und 4.4.
Zirkuläres Deckglas (5 mm Durchmesser)VWR101413-528Stufe 4.5.
Maßgeschneiderter InjektionsnadelhalterN/AN/ASchritt 3.2.4. Technische Details, die auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt werden:
DentalacrylYates Motloid44114Schritte 4.3. und 4.5.
Zahnbohrer; Microtorque iiRam Produkte66699Schritte 3.2.3. und 4.4.
Dowsil transparentes PolymerThe Dow Chemical Company3-4680Schritt 4.5. Künstliche Dura
ElektroporationselektrodeBexLF650P5Schritt 3.1.4.
ElektroporatorBexCUY21Schritt 3.1.4.
Schnell grün FCFSigma-aldrichF7258-25GSchritt 3.1.1.
FLIMimage MATLAB SoftwareN/AN/AAbschnitt 5. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB-SoftwareN/AN/AAbschnitte 5. und 6. Wird auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt
Schaumverträglicher Kleber (Gorilla White Glue)Gorilla5201204Schritt 2.3.
KopfplatteN/AN/ASchritt 4.3. Technische Details werden auf Anfrage dem Hauptautor zur Verfügung gestellt
KopfplattenhalterN/AN/ASchritt 2.6. Technische Details auf Anfrage Hauptautor, verwendet in Kombination mit Montagepfostenhalterung und rechtwinkliger
Halterung Hydraulischer MikromanipulatorNarishigeMO-10Schritt 3.2.4.
Krazy KleberKrazy KleberKG82648RSchritt 4.3. Kleber auf Cyanacrylat-Basis
Geräuscharme schnelle Photomultiplier-RöhreHamamatsuH7422PA-40 oder H10769PA-40Schritt 1.3.
MATLAB 2012bMathworksN/ASchritte 2.6 und Abschnitte 5 und 6. Wird verwendet, um die Mikroskoperfassungs- und Datenanalysesoftware
MotorZhengkeZGA37RGSchritt 2.4 auszuführen.
MotordrehzahlreglerElenkerEK-G00015A1-1Stufe 2.5.
Motorisierter MikromanipulatorSutterMP-285Schritt 3.2.4.
MontagesockelThorlabsBA1SStufe 2.5. Wird für Stifte für Motor und Sensor in Kombination mit PH4 und TR2
MontagepfostenThorlabsP14Step 2.6 verwendet. Wird für den Kopfplattenhalterpfosten in Kombination mit PB2
MontagepfostenbasisThorlabsPB2Step 2.6 verwendet. Wird für den Kopfplattenhalterpfosten in Kombination mit der P14
MontagepfostenhalterungThorlabsC1515Step 2.6 verwendet. Wird in Kombination mit dem rechtwinkligen Bügel und dem Kopfplattenhalter
Optical postThorlabsTR2Step 2.5 verwendet. Wird für Stifte für Motor und Sensor in Kombination mit BA1S und PH4
Phosphatgepufferter KochsalzlösungverwendetΝ/ΑΝ/ΑSchritt 3.2.2. Protokoll: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
PhotodiodeThorlabs FDS010Schritt 1.2.
Photonen-Timing-ZählmodulBecker und HicklSPC-150Schritt 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)Addgene119913Schritt 3.1.3.
PfostenhalterThorlabsPH4Schritt 2.5. Wird für Pfosten für Motor und Sensor in Kombination mit BA1S und TR2
Rechtwinkliger WinkelThorlabsAB90Step 2.6 Wird in Kombination mit Montagepfostenhalter und Kopfplattenhalter
verwendet RotationsgeberUS digitalMA3-A10-250-NSchritt 2.4.
GummimatteRubber-CalB01DCR5LUGStufe 2.1.
Wellenkupplung (1/4 Zoll x 1/4 Zoll)McMaster6208K433Schritte 2.3. und 2.4.
ScanImage 3.6Svoboda Lab/Vidrio TechnologyN/ASchritte 5.9. und 6.1.
SignalsplitterBecker und HicklHPM-CON-02Schritt 1.3.1.
Edelstahlachse (Durchmesser 1/4 Zoll, L = 12 Zoll)McMaster1327K66Stufe 2.3.
Stereotaktisches AusrichtungssystemDavid Kopf1900Schritte 3.2. und 4.1. modifiziert; Sutter-Mikromanipulator, maßgefertigter Injektionsnadelhalter, hydraulischer Mikromanipulator
Zwei-Photonen-MikroskopN/AN/ASektion 5. Basierend auf dem modularen In-vivo-Multiphotonenmikroskopiesystem (MIMMS) des HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond Gewebekleber3M14006Schritt 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)Addgene119921Schritt 3.2.2.
Weiße PE-Schaumstoffrolle (8 Zoll x 12 Zoll)Fabrication Enterprises INC.30-2261Schritt 2.1.1.
Weißes Polystyrol für KugelhälftenGrahamSweet200mm Durchmesser 2 HohlhälftenSchritt 2.1.1.
ZipkickerPACERPT29Schritt 4.3. Beschleuniger zum Härten
, verwendet

References

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