Methodenartikel

Bewertung von Zebrafischen Lens Nukleus-Lokalisierung und Suturenintegrität

DOI:

10.3791/59528

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6. Mai 2019

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Morphologie der kortikalen Linsen, die strukturelle Integrität der Nähte von Zebrafischen in festen und lebenden Linsen zu analysieren und die Position des Zebrafischlinsennkerns entlang der Anterior-nachträglichen Achse zu messen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Zebrafisch eignet sich eindeutig für die Genmanipulation und die In-vivo-Bildgebung und ist damit ein immer beliebter werdendes Modell für umgekehrte genetische Studien und für die Generierung von Transgenik für die In-vivo-Bildgebung. Diese einzigartigen Fähigkeiten machen den Zebrafisch zu einer idealen Plattform, um die Entwicklung und Physiologie der Augenlinsen zu untersuchen. Unsere jüngsten Erkenntnisse, dass ein Aquaporin-0, Aqp0a, für die Stabilität der vorderen Linsennaht sowie für die Verschiebung des Linsenkerns in das Linsenzentrum mit zunehmendem Alter erforderlich ist, haben uns dazu gebracht, Werkzeuge zu entwickeln, die besonders geeignet sind, die Eigenschaften von Zebrafischlinsen zu analysieren. Hier skizzieren wir detaillierte Methoden für die Linsenabtration, die sowohl auf Larven-als auch auf erwachsene Linsen angewendet werden können, um sie auf histologische Analysen, Immunhistochemie und Bildgebung vorzubereiten. Wir konzentrieren uns auf die Analyse der Linsen-Naht-Integrität und der kortikalen Zellmorphologie und vergleichen Daten, die aus zerschnittenen Linsen generiert werden, mit Daten, die aus der in vivo-Bildgebung gewonnenen Bildgebung der Linsenmorphologie gewonnen werden, die durch eine neuartige transgene Zebrafischlinie mit einer genetischen Kodiert fluoreszierenden Marker. Die Analyse von zersplitterten Linsen, die senkrecht zu ihrer optischen Achse stehen, ermöglicht eine Quantifizierung der relativen Position des Linsenkerns entlang der anterior-nachträglichen Achse. Die Bewegung des Linsenkerns von einer anfänglichen vorderen Position in die Mitte ist für die normale Linsenoptik bei erwachsenen Zebrafischen erforderlich. So korreliert eine quantitative Messung der nuklearen Position der Linse direkt mit ihren optischen Eigenschaften.

Einleitung

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Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und Physiologie aufgrund der anatomischen Ähnlichkeiten mit Säugetierlinsen, der relativen Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation, der Geschwindigkeit der embryonalen Augenentwicklung, der geringen Größe und Transparenz. In der Anfangsphase , die es in vivo der Bildgebung erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um die Morphologie der Zebrafischlinse in Embryonal-und Erwachsenenstadien zu analysieren, wobei der Schwerpunkt auf der heilsamen Integrität, der kortikalen Membranmorphologie in vitro und in vivoliegt, sowie die Lage der nuklearen Position der Linse entlang der Anterior-nachträgiere Achse ex vivo. Diese Methoden dienen als Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für umgekehrte genetische Bildschirme für Linsenphänotypen in Zebrafischen.

Bildgebung Zebrafisch-Linsenmorphologie

Aquaporin 0 (AQP0) ist das am häufigsten vorkommende Linsenmembranprotein und ist sowohl für die Entwicklung der Linsen als auch für die Klarheit der Linsen von entscheidender Bedeutung, da es bei Säugetieren viele wesentliche Funktionen gibt. Zebrafische haben zwei Aqp0s (Aqp0a und Aqp0b) und wir haben Methoden entwickelt, um den Verlust ihrer Funktionen sowohl in embryonalen als auch in erwachsenen Linsen zu analysieren. Unsere Studien zeigen, dass aqp0a---Mutanten aufgrund der Instabilität der vorderen Naht eine vordere polare Deckkraft entwickeln, und aqp0a/b Doppelmutanten die nukleare Deckkraft 1 entwickeln. AQP0 hat sich als eine Rolle im Wassertransport 2,Haftung3,4, Zytoskelett-Verankerung 5 und Erzeugung des Brechungsindex Gradienten6, aber diese Studien wurden weitgehend inder vitro. Der Zebrafisch bietet eine einzigartige Gelegenheit, zu untersuchen, wie Funktionsverlust, oder gestörte Funktion von Aqp0a oder Aqp0b die Morphologie und Funktion in einer lebenden Linse beeinflussen würde. Um die Morphologie der Linsenzellen und die Integrität der Sutural während der Entwicklung zu beurteilen, haben wir die bestehenden In-vitro-immunhistochemischen Methoden 7 für den Einsatz in embryonalen und erwachsenen Linsen modifiziert und Transgenik erzeugt, um diesen Prozess in vivo zu überwachen. .

Die immunhistochemische Analyse der Plasma-Membranstruktur und der sutural integtären Struktur wurde in ganzen festen Embryonen und erwachsenen Linsen durchgeführt. Zebrafischlinsen sind extrem klein (der Linsendurchmesser beträgt ~ 100 μm bei Embryonen und bei Erwachsenen bis zu 1 mm) im Vergleich zu ihren Säugetier-Pendants und haben Punktzahl8, die in Kryoschnitten selten erfasst werden. Daher sind ganze Objektive für die Analyse der Integrität des uturalen. Denn in vivo-Analyse der vorderen Nahtbildung und Abbildung der präzisen Linsenzellen-Architektur haben wir Transgenik erzeugt, die mApple-spezifisch kennzeichnende Linsenmembranen ausdrückt.

Die Vorteile der Live-Bildgebung von Objektivmembrantransgenik sind: 1) Vermeidung von Fixierungsarten, 2) das Studium dynamischer morphologischer Veränderungen in Zeitraffer-Filmen und 3) die Möglichkeit länglicher Studien, in denen frühere Ereignisse mit späteren Phänotypen. Die Pigmentierung der Iris verhindert in der Regel eine klare Abbildung der Linsenperipherie. Die Zugabe von 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) vor der Primordia-5 (Prim-5) Stufe9 verhindert Melanogenese und Augenpigmentierung bis zu etwa 4 Tagen Postfertilisation (dpf). Nach 4 dpf wird die Linsenperipherie jedoch in vivoverdeckt, besonders in älteren Stadien. Darüber hinaus verdeckt die Dichte der Linse selbst die Abbildung des hinteren Pols. Um die Morphologie der Linsenperipherie oder der hinteren Naht nach 4 dpf zu studieren, müssen die Linsen daher exzessiv und fixiert werden.

Mit transgenen Zebrafischlinien wurden die embryonalen Linsenmembranstrukturen in vivo10analysiert. Das transgene Q01 drückt ein cyan fluoreszierendes Protein aus, das zu einer Membranzielsequenz, Gap43, verschmolzen ist, angetrieben vom EF1 α-Promoter und einem Hexamer des DF4 pax6-Enhancer-Elements, das in Linsenfaserzellen 11 allgegenwärtig ist. Q01 hat einen extra-Lentikelausdruck, einschließlich Amacrin-Zellen in der Netzhaut, was Hintergrundsignal hinzufügt, wenn das primäre Interesse die Linse ist. Wir haben eine neuartige transgene Linie entwickelt, die einen Membran-gebärten mApple speziell in der Linse ausdrückt, mit dem Ziel, jedes extra-linsenförmige Signal zu vermeiden.

Lens nucleus Lokalisierung

Wir entdeckten, dass sich der Linsenkern von einer anfänglichen vorderen Position in Larvenzebrafischen zu einem zentralen Ort in der anterior-nachträglichen Achse in erwachsenen Linsen bewegt. Diese Verschiebung der Position des hochbrechenden Indexlinsenkerns gilt als Voraussetzung für die normale Entwicklung der Zebrafischlinsen-Optik1. Unsere Methoden ermöglichen die Quantifizierung der nuklearen Zentralisierung der Linse in Bezug auf den Linsenradius. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Aqp0a für die Atomzentralisierung1benötigt wird, und diese einfache Methode kann auf andere Studien zur Entwicklung und Physiologie des Objektivs und seiner optischen Eigenschaften im Zebrafischmodell angewendet werden.

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Protokoll

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Die in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle halten sich an das ARVO-Statement für die Verwendung von Tieren in der Augen-und Sehforschung und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Irvine, genehmigt.

1. Zebrafisch Husbandry und Euthanasie

  1. Zebrafische (AB-Stamm) unter normalen Laborbedingungen zu züchten und zu pflegen12. Embryonen im Embryomedium (EM) 12erhöhen. Fügen Sie 0,003% PTU ab 20-24 h Postfrulisation (vor der Prif-5-Phase) zu EM hinzu, um die Pigmentbildung in Embryonen zu verhindern, die fürdie Bildgebung in den Embryonalstadien verwendet werden. Erhöhen Sie Larven von 6-30 Tagen Postfertilisation (dpf) auf eine Diät von lebenden Rotiferen bis 14 dpf, und leben Artemianach 14 dpf 12.
    CAUTION: PTU ist sehr giftig
  2. Fische mit Trikaine anästhetisieren, bis sie nicht ansprechbar sind.
    1. Bereiten Sie den Tricainbestand vor, indem Sie 400 mg 3-Aminino-Benzoikacidethylester mit 2,1 mL von 1 M Tris (pH 9), in 100 mL von ddH2O. PH 7,0.
      CAUTION: Tricaine ist giftig.
    2. Zonieren Sie 4,2 ml Trikaine-Bestand in 100 ml Tankwasser, um Larvae/Erwachsene zu betäuben oder in EM, um Embryonen zu betäuben (endgültige Konzentration von Trikaine bei 0,165% w/v).

2. Fixierung von Embryonen und Larven

NOTE: Immunhistochemische Protokolle wurden aus den zuvor veröffentlichten Materialien 7 angepasst.

  1. Fix dechorionierte Embryonen oder Larven bis zu 2 Wochen Postfertilisation in 4% (v/v) Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferten Saline (PBS) über Nacht bei 4 ° C auf einem Rocker.
    CAUTION: PFA ist brennbar und krebserregend.
  2. Embryonen dreimal für 10 min in PBS waschen und in PBS mit 10% Triton und 1% DMSO (PBS-T) über Nacht bei 4 ° C durchdringen.
    CAUTION: DMSO ist giftig, durch Einnahme oder Hautaufnahme schädlich, trägt gefährliche Stoffe durch die Haut und ist brennbar. Triton ist giftig, korrosiv und gefährlich für die aquatische Umwelt.

3. Dissection of Larval and Adult Zebrafish Linsen

  1. Anästhesieren Sie Fische von 6 dpf-Larven bis zum Erwachsenenalter mit Trikain bis hin zum Anfassen, aber dennoch mit einem starken Herzschlag. Messen Sie die Standardlänge des Fisches nach Schilling (2002)für die Inszenierung 13.
  2. Sofort mit Mikrodissektionschere die Augen abwechseln und in eine Sektionsschüssel in PBS (Abbildung 2 für erwachsene Augen) geben.
    1. Machen Sie eine individuelle 35-mm-Schale mit Silikon für Linsenabschnitte gefüllt. Sobald Silikon gesetzt ist, wird ein Divot mit einem Durchmesser von etwa 2-3 mm und einer Tiefe von 0,5 mm für die Immobilisierung erwachsener Eyeses/Linsen während der Trennung angeziert.
  3. Dissektion der erwachsenen Zebrafischlinsen
    1. Legen Sie ein erwachsenes Auge in das Gericht divot hintere Seite mit PBS gefüllt. Das Auge durch das Einsetzen von Zangen bei & lt;45 ° Winkel durch die Optikscheibe zu mobilisieren. Achten Sie darauf, das Objektiv nicht zu nicken oder zu komprimieren. Machen Sie zwei oder drei radiale Schnitte durch Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe in die Ziliarzone mit Sektionsschere.
    2. Die Netzhaut schälen und die Blütenblätter schälen und das Auge umdrehen, die Hornhaut nach oben. Wenden Sie die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und Hornhaut mit der flachen Seite der Schere, während Sie die Netzhaut und befestigte Gewebe mit Zangen wegziehen. Überschüssiges Gewebe vorsichtig aus der Linse schneiden.
      NOTE: Es ist wichtig, sorgfältig zu zerlegen, um durchweg gesunde Linsen zu erhalten.
  4. Dissektion der Larvenzebrafischlinsen
    1. Legen Sie eine Larval-Augenhinterseite nach oben auf den flachen Teil der Silikon-Schale mit PBS gefüllt und verwenden Sie eine geschärfte Wolfram-Nadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und Sklera zu machen, während die Immobilisierung des Auges mit einer anderen Wolfram-Nadel oder Zangen.
      NOTE: Achten Sie darauf, dass Sie das Objektiv nicht beschädigen.
      1. Schärfen Sie die Spitze einer 2 cm langen Länge von 0,1 mm Wolframdraht elektrolytisch, indem Sie die Drahtspitze in 10% (w/v) NaOH aufsetzen und einen Niederspannungs-Wechselstrom14anwenden. Sichern Sie sich die Nadel in eine Pasteur-Pipette, indem Sie das Glasende mit einem Bunsenbrenner schmelzen.
        NOTE: Es können auch alternative Feinschnittswerkzeuge verwendet werden.
        CAUTION: NaOH ist korrosiv.
    2. Die Linse vorsichtig mit einer stumpfen Nadelseite aus dem distanzierten Auge ausstechen und das angeschlossene Gewebe vorsichtig wegziehen.

4. Fixierung von verseuchteten Linsen

  1. Die zerlegten Linsen in 1,5% (v/v) PFA in PBS für 24 h bei Raumtemperatur (RT) sofort fixieren. In PBS dreimal Linsen für jeweils 10 min waschen.
  2. Permeabilisize-Linsen für die gesamte Montageanalyse oder Kryooprotekte zur Kryosektion (siehe Abschnitt 8).
    1. Durchlässigkeit der Linsen in PBS-T über Nacht bei 4 ° C.

5. Lens Immunhistochemie

  1. Etikettenmembranen von festen Embryo/Larvalen oder erwachsenen Linsen durch Inkubation in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) und Zellkernen mit DAPI (1:1000 von 5 mg/mL Stock) in PBS-T-Übernachtung bei 4 ° C.
    CAUTION: DAPI ist ein Haut-und Augenräuzstoff.
  2. Mit PBS-T dreimal für jeweils 10 min waschen. Klargewebe durch Inkubation in 30%, 50% und 70% Glycerin in PBS-T (v/v) für mindestens 1 h bei RT, oder über Nacht bei 4 ° C.
  3. Montieren Sie Fisch in 70% Glycerin in PBS-T (v/v) auf Glasboden 35 mm Mikrowell-Geschirr mit Augen so flach und gerade gegen den Deckel rutschen wie möglich. Bei jüngeren Fischen kann eine leichte Anterior-seitliche Neigung helfen, die Linsennaht parallel zum Kitzelzug zu orientieren.

6. Analyse von Zebrafischen Vorderlinsen Sutures Mit einer transgenen Linie in Vivo

  1. Erzeugen Sie Tg-Linien (βB1cry: mAppleCAAX) mit dem Tol2-Kit15. Das met2-transposable Elementsystem15 ermöglicht eine stabile Integration des Konstrukts, bei dem mApple von 300 bp des menschlichen βB1-kristallin-Promoters 16 angetrieben wird, der durch die CAAX-Sequenz an die Membran gebunden wird, was zum Ausdruck führt. Speziell in Linsenfaserzellmembranen.
    NOTE: Dieses Konstrukt (ID:122451) ist zum Kauf erhältlich.
    1. Am Morgen der Injektion, bereiten Sie die Injektionsmischung und halten Sie auf Eis. Um einen endgültigen Volumen von 10 μL mit RNase-und DNasefreien H2 O zuerreichen, Fügen Sie hinzu: 1,5 μL von hu βB1-Schrei: mAppleCAAX DNA-Konstrukt bei 50 ng/μL-[0,375-0,75 pg/Ende-Injektion], 1,5 μL von Tol2 Transposase mRNA bei 300 ng/μL (Tol2 Kit) 15 [15-30 pg/ Die Endspritze und 1 μL Phenol-roter Indikator bei 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/finale Injektion].
    2. Einspritzung 50-100 pL Injektionsgemisch in 1-Zell-Stage-Embryonen12.
  2. Messung der Transgenesis-Effizienz in F0 injizierten Embryonen durch Messung der Häufigkeit von Embryonen mit mApple-Positivlinsen bei 3 dpf.
    NOTE: Rechnen Sie damit, dass mit dieser Methode eine% gt;80 Transgenese-Effizienz erfolgen wird. F0-Mosaike ermöglichen eine detaillierte Analyse der Membranmorphologien einzelner Zellen. Die unterschiedlichen Ebenen des Mosaikismus erlauben es, die Morphologien einzelner oder kleiner Gruppen von Zellen darzustellen, während eine globalere Linsenexpression die Analyse von multizellulären Strukturen wie Linsennächten in vivo erlaubt.
  3. Outcross F0-Mosaikfische zur Erzeugung stabiler Linien, die alle Faserzellmembranen kennzeichnen. F0-Gründer mit dem in die Keimbahn integrierten Transgen generieren Nachkommen mit stabilen Integrationen, die als transgene Linien erhalten bleiben können.

7. Analyse von Zebrafischen Vorderlanden Sutures Mit einer transgenen Linie in Vivo

  1. Anästhesium 3 dpf oder erwachsene Mosaik oder stabile transgene Fische und montieren Sie in 1% niedriger Schmelzfläche (LMA) mit Tricaine mit dem Auge flach gegen den Deckungsrutsch von Glasboden Mikrowell-Gerichte.
    1. 1 g LMA in 100 mL EM (ohne Methylenblau) auflösen, um 1% LMA zu machen. Langfristig als 15 mL Vorrat bei 4 ° C. Mikrowelle, um den Vorrat aufzulösen und bei 42 ° C zu speichern, bis jedes Rohr verwendet wird.
  2. Bedecken Sie Fische bis zu 6 dpf mit EM mit Trikaine, oder mit Tankwasser mit Trikaine für Erwachsene, wenn LMA gesetzt wird.
    1. Mischen Sie 5 ml EM ohne Methylenblau oder Tankwasser mit 250 μL Tricainvorrat und 7 μL PTU, wenn PTU behandelten Fisch abgebildet.

8. Lens Cryosectioning und Immunhistochemie

  1. Cryoprotect fixe Embryonen oder erwachsene Linsen, indem sie in 10% Saccharose in PBS (w/v), 20% Saccharose für 1 h bei RT je (oder über Nacht bei 4 ° C) und über Nacht in 30% Saccharose bei 4 ° C.
  2. Das Gewebe in das OCT einbetten und dann mit OCT auf die Chucks einfrieren. Warme Abschnitte auf Rutsche für 10 Minuten auf einem Rutschwärmer auf ~ 35 ° C vorgewärmt.
  3. Mit PBS dreimal abwaschen, jeweils 10 min. Label-Abschnitte mit Phalloidin-Alexa Mehl 546 (1:200) mit DAPI (1:1000) oder WGA-Alexa Mehl 594 (1:200), gefolgt von drei PBS-Waschungen. Mit Anti-Fade-Beflademittel und Dichtkeillippe mit Nagellack montieren.

9. Bildgebung

  1. Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Erwerben Sie Z-Stapel oder optische Scheiben mit einem 60x N/A 1.2 Wassereintauchobjektiv oder ähnlichem an bestimmten Regionen vom vorderen bis zum hinteren Linsenpol. Verwenden Sie die folgenden Akquisitionseinstellungen: 1,2 luftige Disc mit dem 561 nm-Laser, Texas Rotfilter für Phalloidin-Alexa Mehl 546 oder mApple, oder der 405-Laser mit dem UV-Filter für DAPI.
  2. Die richtige Laserleistung der z-Intensität, um dem Signalverlust mit der Tiefe in die Linse entgegenzuwirken. Dies ermöglicht ein starkes Signal am hinteren Pol der fixen und lebenden 3 dpf-Embryonen und ein starkes Signal in äquatorialen optischen Scheiben in erwachsenen Fischlinsen.
  3. Kompilieren und betrachten Sie Bilder mit Hilfe von Bildbearbeitungssoftware.

10. Messung der Lens Nukleus-Lokalisierung in der Anterior-nachträglichen Achse

  1. Orient frisch ausgescannte Linsen axial in PBS in einer 35-mm-Schale mit einem Deckglasboden, mit Stöcken und Nähten, die parallel zur Fokusebene ausgerichtet sind. Suchen Sie nach einem Unterschied im Brechungsindex, der normalerweise an der Schnittstelle von Linsenkortex und Linsenkern auftritt, um den Linsenkern zu identifizieren.
    NOTE: Gesunde, wilde, wilde Objektive vom Typ Erwachsene sind extrem transparent, so dass es schwierig ist, die Nähte und den Kern der Linse zu sehen oder die Orientierung des Objektivs zu bestimmen. In diesem Fall verursacht ein leichtes Nicken mit Zangen an der Linsenkapsel kleinere Schäden, was die Nähte und den Linsenkern in etwa 10 Minuten sichtbar macht und hilft, das Objektiv für diese Messung zu orientieren. Allerdings werden die Objektive für nachgelagerte Anwendungen unbrauchbar, da sie nun beschädigt sind.
  2. Nehmen Sie Bilder von Objektiven mit dem Linsenkern im Fokus unter heller Feldbeleuchtung mit oder ohne DIC-Optik mit einem Trennmikroskop mit einer angehängten Kamera. Bilden Sie einen Mikrometer unter der gleichen Vergrößerung für die Kalibrierung.
    1. Klicken Sie auf die Live-View-Button, passen Sie die Belichtungseinstellungen an, um den Linsenkern und die Linsenperipherie zu visualisieren, und nehmen Sie ein Bild, indem Sie auf den Schnappschuss-Button klicken. Speichern Sie als Motiv-Datei.
    2. Verwenden Sie die Bildbearbeitungssoftware, um die erfassten Objektivbilder zu kalibrieren. Wählen Sie das geradlinige Werkzeug und zeichnen Sie eine Linie von bekannter Länge auf dem Mikrometer-Bild, klicken Sie auf Analyse | Die Skala. Geben Sie bekannte Distanz, Einheiten und wählen Sie "globale" Kalibrierung, und klicken Sie auf OK.
  3. Messen Sie den Abstand der Mitte des Linsenkerns zum vorderen Pol (a-r).
    1. Verwenden Sie das geradlinige Werkzeug in der Bildverarbeitungssoftware, um eine Linie über das abgebildete Zentrum des Linsenkerns in einer axialen Ausrichtung zu ziehen. Nehmen Sie die Mitte dieser Linie als die Mitte des Linsenkerns.
    2. Ziehen Sie eine weitere Linie von diesem Punkt auf den vorderen Pol des Objektivs und wählen Sie "Maß" im Menü "analysieren", um den Abstand (a-r) zu messen, wobei a der Radius der Linse ist und r ist der Abstand von der Mitte des Objektivs zur Mitte des Objektivs der Kern.
    3. Ziehen Sie eine weitere Linie von der Vorderseite bis zu den hinteren Polen und messen Sie diesen Abstand als Objektivdurchmesser (2a). Kopieren Sie diese Längen aus dem "Ergebnisfenster" und übertragen Sie auf ein Tabellenkalkulations-oder Statistikprogramm.
      NOTE: Es ist einfacher, von der Mitte des Kerns bis zum vorderen Pol präzise zu messen, als von der Mitte des Linsenkerns bis zur Mitte der Linse. Diese Messung wird durch die Formel in Schritt 10.3.5 umgewandelt, um den Abstand der Mitte des Objektivkerns zur Mitte des Objektivs zu melden. Verwenden Sie den erwachsenen Kern immer für Messungen, auch wenn der embryonale Kern offensichtlich ist.
    4. Teilen Sie den Durchmesser durch 2, um den Linsenradius zu berechnen, a.
    5. Berechnen Sie r/,da figure-protocol-1 es sich um die normalisierte Lokalisierung des Objektivkerns in Bezug auf den Linsenradius handelt.
      NOTE: Für einen Kern, der näher an den vorderen Pol gelegt wird, wird r/und gt;0.0, während ein zentral lokalisierter Kern eine r/a von 0.0 haben wird.
  4. Graphen Sie das Protokoll der normalisierten Axialkernmessung als Funktion der Standardlänge, um Veränderungen in der Linsenkernlokalisierung während der Zebrafischentwicklung zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Erwachsene Zebrafische Augenanatomie ähneln der von Säugetieren (Abbildung 1A). Trotz einiger Unterschiede zwischen Zebrafischen und Säugetieren Augen, wie mit einer Ziliarzone statt mit einem Ziliarkörper 17,Unterschiede in den optischen Eigenschaften18, und Unterschiede in der Morphogenese während der Embryonalentwicklung 19, die Zebrafischauge ist ein ausgezeichnetes Modell für die Unt...

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Diskussion

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Die Analyse der Zebrafisch-Linsenmorphologie ist der erste Schritt, um Phenotypen bei Mutanten zu verstehen, oder die Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe, die auf die Erforschung der Biologie der Augenlinse abzielen. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Linsennähten, kortikalen Faserzellmorphologie und Aspekten des Linsenkerns. Diese Ansätze sind eine Kombination von in vitro und in vivo (im Vergleich in Tabelle 1). Die In-vitro-Methoden ermöglichen eine größere Detailg...

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Offenlegungen

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Wir haben keine Enthüllungen.

Danksagungen

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Wir möchten unsere Finanzierungsquelle würdigen: NIH R01 EY05661 an J.E.H, Ines Gehring für die Unterstützung bei der Generierung der aqp0a/b Doppelmutanten und Zebrafischhaltung, Dr. Daniel Dranow für Diskussionen, die zur Generierung der Transgenik führen, Dr. Bruce Die Labore von Blumberg und Dr. Ken Cho für die Verwendung ihrer sektoralen Mikroskope und Dr. Megan Smith für die Hilfe bei der statistischen Analyse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)SigmaP7629VORSICHT – sehr giftige
4%ige wässrige Paraformaldehyd-LösungElektronenmikroskopie SciencesRT 157-4VORSICHT – Gesundheitsgefahr, brennbar
KonfokalmikroskopNikonEclipse Ti-E
KryostatLeicaCM3050SObjektiv- und Kammertemperatur auf -21 & Deg; C
DAPIInvitrogenD1306VORSICHT – reizt Augen und Haut
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher ScientificD128VORSICHT – brennbar, dringt in die Haut ein  
Einweg-BasisformVWR Scientific15154-631
Einweg-Pasteur-GlaspipettenFisherbrand13-678-20A
Dumont #5 PinzetteDumont & HaltenSie die Pinzette geschärft
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain)Sigma-AldrichA5040VORSICHT - giftige
Mikrotiterschale mit Glasboden (35 mm Petrischale, 14 mm Mikrowelle, #1,5 Deckglas)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlycerinSigmaG2025
huβ B1cry:mAppleCAAX DNA-KonstruktAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR SoftwareNikon
Olympus  mit einem Modell 2.1.1.183 ControllerOlympus CorpDP70
Olympus Mikroskop Olympus CorpSZX12
Phalloidin-Alexa Mehl 546Thermo FisherA22283
Phenolrot-Indikator (1% w/v)Ricca Chemical Company5725-16
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Photoshop SoftwareAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD ObjektivNikon
StromquelleWild HeerbruggMTr 22Oder gleichwertige Stromquelle 
Objektträgerwärmer Modell Nr. 26020FSFisher Scientific12-594
NatriumhydroxidkügelchenFisher ScientificS612-3VORSICHT - ätzend/reizend für Augen und Haut, Zielorgan - Atemwege, korrosiv gegenüber Metallen
Superfrost/Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 Silikon Dow CorningWorld Prevision Instruments
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284VORSICHT – Giftig, wassergefährdend, ätzend
Vannas MikrodissektionschereTed Pella Inc1346Scharfe/scharfe gerade Spitzen
Vectashield Antifading-MontagemediumVector LaboratoriesH-1000
Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-Alexa Mehl-594Life TechnologiesW11262
SYLG184

Referenzen

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