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Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59535

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3. Juli 2019

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1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren mehren sich die Hinweise, dass alle Organismen und die Umwelt hormonähnlichen Chemikalien ausgesetzt sind, die als endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) bekannt sind. Diese Chemikalien können das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern und zu negativen Auswirkungen führen, sowie eine zunehmende Anzahl von hormonellen Störungen in der menschlichen Bevölkerung oder gestörtes Wachstum und verminderte Fortpflanzung in den Wildtierarten. Für einige EDCs gibt es dokumentierte gesundheitliche Auswirkungen und Einschränkungen für ihre Verwendung. Für die meisten von ihnen gibt es jedoch immer noch keine wissenschaftlichen Beweise in diesem Sinne. Um mögliche endokrine Wirkungen einer Chemikalie im vollwertigen Organismus zu überprüfen, müssen wir sie in geeigneten Modellsystemen sowie in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster,testen. Hier berichten wir über detaillierte In-vivo-Protokolle zur Untersuchung endokriner Störungen in Drosophila, die edC-Effekte auf die Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, den Entwicklungszeitpunkt und die Lebensdauer der Fliege angehen. In den letzten Jahren haben wir diese Drosophila-Lebensmerkmale verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber 17-Ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA) und Bisphenol AF (BPA F) zu untersuchen. Insgesamt deckten diese Assays alle Drosophila-Lebensstadien ab und ermöglichten es, endokrine Störungen in allen hormonvermittelten Prozessen zu bewerten. Fecundity/Fertility und Developmental Timing Assays waren nützlich, um die Auswirkungen des EDC auf die Reproduktivleistung der Fliege bzw. auf die Entwicklungsstadien zu messen. Schließlich umfasste der Lebensdauertest chronische EDC-Expositionen bei Erwachsenen und maß deren Überleben. Diese Lebensmerkmale können jedoch auch durch mehrere experimentelle Faktoren beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden mussten. In dieser Arbeit schlagen wir daher eine Reihe von Verfahren vor, die wir für das richtige Ergebnis dieser Assays optimiert haben. Diese Methoden ermöglichen es Wissenschaftlern, endokrine Störungen für jedes EDC oder für eine Mischung verschiedener EDCs in Drosophila festzustellen, obwohl zur Identifizierung des für die Wirkung verantwortlichen endokkrinen Mechanismus weitere Essays erforderlich sein könnten.

Einleitung

Menschliche Aktivitäten haben eine enorme Menge an Chemikalien in die Umwelt freigesetzt, die ein ernstes Problem für Organismen und für natürliche Ökosysteme darstellen1. Von diesen Schadstoffen wird geschätzt, dass etwa 1.000 verschiedene Chemikalien das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern können; nach dieser Eigenschaft werden sie als endokrine störende Chemikalien (EDCs) klassifiziert. Insbesondere auf der Grundlage einer kürzlichen Definition der Endokrinen Gesellschaft sind die EDCs "eine exogene Chemikalie oder eine Mischung von Chemikalien, die jeden Aspekt der Hormonwirkung beeinträchtigen können"2. In den letzten drei Jahrzehnten hat es immer mehr wissenschaftliche Beweise dafür gegeben, dass EDCs die Fortpflanzung und Entwicklung von Tieren und Pflanzen beeinflussen können3,4,5,6,7, 8. Darüber hinaus wurde die EDC-Exposition mit der zunehmenden Prävalenz einiger menschlicher Krankheiten zusammen, einschließlich Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Schilddrüsenerkrankungen und Verhaltensstörungen9,10,11.

Allgemeine Mechanismen der EZ

Aufgrund ihrer molekularen Eigenschaften verhalten sich EDCs wie Hormone oder Hormonvorläufer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In diesem Sinne, Sie können an einen Hormonrezeptor binden und stören endokrine Systeme entweder durch Nachahmung der Hormonaktivität oder durch Blockierung endogene Hormone Bindung. Im ersten Fall, nach der Bindung an den Rezeptor, Sie können es aktivieren, wie sein natürliches Hormon tun würde. Im anderen Fall verhindert die Bindung des EDC an den Rezeptor die Bindung seines natürlichen Hormons, so dass der Rezeptor blockiert ist und auch in Gegenwart seines natürlichen Hormons3nicht mehr aktiviert werden kann. Infolgedessen können EDCs mehrere Prozesse beeinflussen, wie die Synthese, Sekretion, Transport, Stoffwechsel oder periphere Wirkung von endogenen Hormonen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase, Fortpflanzung, Entwicklung und/oder Verhalten von den Organismus. Die Rezeptorbindung ist nicht die einzige bisher beschriebene Wirkungsweise für die EDCs. Es ist jetzt klar, dass sie auch handeln können, indem sie Koaktivatoren oder Corepressoren in enzymatischen Bahnen rekrutieren oder epigenetische Marker modifizieren, die die Genexpression10,11,12,13 deregulieren. ,14, mit Folgen nicht nur für die aktuelle Generation, sondern auch für die Gesundheit der kommenden Generationen8.

Drosophila-Hormone

Die potenziellen Auswirkungen ausgewählter EDCs wurden umfassend untersucht, sowohl bei Tierarten als auch in mehreren Modellsystemen, in denen endokrine Mechanismen einigermaßen gut bekannt sind. Bei wirbellosen Tieren wurden endokrine Systeme, die Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, bei Insekten aus mehreren Gründen stark charakterisiert, was ihre umfangreiche Verwendung im Bereich der biologischen Forschung, ihre wirtschaftliche Bedeutung und schließlich die Entwicklung von Insektiziden, die in der Lage sind, speziell in das Hormonsystem von Schädlingsinsekten einzugreifen.

Insbesondere unter Insekten hat sich die Fruchtfliege D. melanogaster als ein sehr leistungsfähiges Modellsystem zur Bewertung der möglichen endokrinen Wirkungen von EDCs erwiesen. Bei D. melanogaster, sowie bei Wirbeltieren, Hormone spielen eine wichtige Rolle über den gesamten Lebenszyklus. In diesem Organismus gibt es drei Haupthormonsysteme, die das Steroidhormon 20-Hydroxyecdyson (20E)15,16, das sesquiterpenoide Juvenile Hormon (JH)17, und die Neuropeptide und Peptid/Protein beinhalten Hormone18. Diese dritte Gruppe besteht aus mehreren Peptiden, die in jüngerer Zeit entdeckt wurden, aber eindeutig an einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensprozessen beteiligt sind, wie Langlebigkeit, Homöostase, Stoffwechsel, Reproduktion, Gedächtnis und Bewegungssteuerung. 20E ist homologe zu Cholesterin-abgeleiteten Steroidhormonen wie Estradiol, während JH einige Ähnlichkeiten mit Retinsäure teilt; beide sind die bekannteren Hormone in Drosophila19,20. Ihr Gleichgewicht ist entscheidend für die Koordination von Molting und Metamorphose sowie für die Steuerung mehrerer postentwicklungsmäßiger Prozesse, wie Fortpflanzung, Lebensdauer und Verhalten21, und bietet somit verschiedene Möglichkeiten zur Erprobung endokriner Störung in Drosophila. Darüber hinaus sind Ecdysteroidhormone und JHs die Hauptziele der sogenannten Insektizide der dritten Generation, die entwickelt wurden, um entwicklungs- und reproduktive endokrine Prozesse bei Insekten zu stören. Die agonistische oder antagonistische Wirkungsweise dieser Chemikalien ist bekannt und kann daher als Referenzstandards für die Bewertung der Auswirkungen potenzieller EDCs auf das Wachstum, die Fortpflanzung und die Entwicklung von Insekten dienen22. Zum Beispiel, Methopren, das weit verbreitet bei der Bekämpfung von Mücken und anderen Wasserinsekten23,24, arbeitet als JH-Agonist und unterdrückt 20E-induzierte Gentranskription und Metamorphose.

Neben Hormonen ist auch die Superfamilie des Nuklearrezeptors (NR) in Drosophila bekannt; Es besteht aus 18 evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren, die an der Kontrolle hormonabhängiger Entwicklungspfade sowie Reproduktion und Physiologie25beteiligt sind. Diese Hormon NRs gehören zu allen sechs NR-Überfamilie Subtypen, einschließlich der an der Neurotransmissionbeteiligt 26, zwei für Retinsäure NRs, und diejenigen für Steroid NRs, die bei Wirbeltieren, eines der primären Ziele von EDCs27darstellen.

Drosophila als Modellsystem zum Studium von EDCs

Derzeit führen mehrere Umweltagenturen auf der ganzen Welt auf der Grundlage molekularer Eigenschaften das Potenzial, die endokrinen Systeme zu stören, verschiedenen vom Menschen hergestellten Chemikalien zu. Da die EDC ein globales und allgegenwärtiges Problem für die Umwelt und für Organismen darstellen, besteht das übergeordnete Ziel der Forschung auf diesem Gebiet darin, ihre Krankheitslast zu verringern und lebende Organismen vor ihren nachteiligen Auswirkungen zu schützen. Um das Verständnis über die möglichen endokrinen Wirkungen einer Chemikalie zu vertiefen, ist es notwendig, sie in vivo zu testen. Zu diesem Zweck stellt D. melanogaster ein gültiges Modellsystem dar. Bis heute wurde die Fruchtfliege ausgiebig als In-vivo-Modell verwendet, um die Auswirkungen mehrerer Umwelt-EDCs zu bewerten; Es wurde berichtet, dass die Exposition gegenüber mehreren EDCs, wie Dibutylphthalat (DBP)28, Bisphenol A (BPA), 4-Nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP)33, und 17-a-ethinylestradiol (EE2)34, beeinflusst den Stoffwechsel und die endokrinen Funktionen wie bei Wirbeltiermodellen. Mehrere Gründe haben dazu geführt, dass er als Modell in diesem Forschungsbereich verwendet wurde. Neben der hervorragenden Kenntnis seiner endokrinen Systeme sind weitere Vorteile sein kurzer Lebenszyklus, niedrige Kosten, leicht zu manipulierbares Genom, eine lange Forschungsgeschichte und mehrere technische Möglichkeiten (siehe FlyBase-Website, http://flybase.org/). D. melanogaster bietet auch ein leistungsfähiges Modell für die einfache Untersuchung der transgenerationalen Effekte und Der Population Reaktionen auf Umweltfaktoren8 und vermeidet ethische Fragen, die für In-vivo-Studien an höheren Tieren relevant sind. Darüber hinaus teilt die Fruchtfliege ein hohes Maß an Generhaltung mit menschenweisen, was es Drosophila EDC-Assays ermöglichen könnte, bei der Vorhersage oder Demindizierung möglicher Auswirkungen dieser Chemikalien auf die menschliche Gesundheit zu helfen. Neben der Erweiterung des Verständnisses über die Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit kann Drosophila dazu beitragen, die Risiken einer EDC-Exposition gegenüber der Umwelt, wie den Verlust der biologischen Vielfalt und die Umweltzerstörung, zu bewerten. Schließlich bietet die Fruchtfliege den zusätzlichen Vorteil, in Laboratorien eingesetzt zu werden, in denen die Faktoren, die ihre Entwicklung, Fortpflanzung und Lebensdauer beeinflussen, unter Kontrolle gehalten werden können, um jede Variation dem zu prüfenden Stoff zuzuschreiben.

Vor diesem Hintergrund haben wir einfache und robuste Fitness-Assays optimiert, um EDC-Effekte auf einige Drosophila-Hormonmerkmale wie Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Erwachsenenlebensdauer zu bestimmen. Diese Assays wurden weit verbreitet für einige EDCs23,24,25,26,27verwendet. Insbesondere haben wir die folgenden Protokolle verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber dem synthetischen Östrogen EE234 und BPA und Bisphenol AF (BPA F) (unveröffentlichte Daten) zu bewerten. Diese Protokolle können leicht geändert werden, um die Auswirkungen eines bestimmten EDC zu einem Zeitpunkt zu untersuchen, sowie die kombinierten Wirkungen mehrerer EDCs in D. melanogaster.

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Protokoll

1. Lebensmittelzubereitung

  1. Für die Bestandspflege und das Larvenwachstum ein Maismehlmedium verwenden, das 3 % Pulverhefe, 10 % Saccharose, 9 % vorgekochtes Maismehl, 0,4 % Agar, danach Maismehlmedium (CM) enthält.
    1. 30 g Hefe in 100 ml Leitungswasser geben, zum Kochen bringen und 15 min kochen lassen.
    2. Getrennt gut 90 g vorgekochtes Maismehl, 100 g Zucker und 4 g Agar in 900 ml Leitungswasser mischen.
    3. Bringen Sie die Lösung zum Kochen, senken Sie die Hitze und kochen Sie für 5 Minuten unter ständigem Rühren.
    4. Nach 5 Minuten die heiße Hefelösung hinzufügen und weitere 15 min köcheln lassen.
    5. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie die Lösung auf ca. 60 °C abkühlen.
    6. 5 ml/L 10% Methyl4-Hydroxybenzoat in Ethanol geben, gründlich mischen und 10 min sitzen lassen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Methyl 4-Hydroxybenzoat, da eine hohe Konzentration von Fungizid für Larven tödlich sein könnte.
    7. Geben Sie das Medium in Fläschchen/Flaschen: 8 ml in jede Fliegenfläschchen (25 mm x 95 mm), 3 ml in jede Fliegenfläschchen (22 mm x 63 mm) und 60 ml in jede Flugflasche (250 ml).
    8. Fläschchen mit Käsetuch abdecken und bei Raumtemperatur (RT) 24 h vor der Lagerung trocknen lassen.
    9. Kalibrieren Sie experimentell die richtige Konsistenz und Hydratation des CM, indem Sie entweder die Menge des verwendeten Agars und/oder die Kühl-/Trocknungszeiten ändern.
      Hinweis: Unplugged, boxed und gewickelte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  2. Für Drosophila Erwachsene, verwenden Sie ein Medium mit 10% pulverisierte Hefe, 10% Saccharose, 2% Agar, danach genannt Adult Medium (AM).
    1. 10 g Pulverhefe, 10 g Saccharose, 2 g Agar in 100 ml destilliertes Wasser mischen.
    2. Bringen Sie diese Mischung zum Kochen zwei Mal, mit einem 3 Minuten Intervall, oder bis Agar gelöst ist, mit einer Mikrowelle.
    3. Sobald die Lösung auf 60 °C abkühlt, 5 ml/L 10% Methyl 4-Hydroxybenzoat in Ethanol hinzufügen, gründlich mischen und in Fläschchen (10 ml pro Durchstechflasche) abgeben.
    4. Fläschchen mit Käsetuch bedecken und bei RT 24 h trocknen lassen, bevor sie gelagert werden.
      HINWEIS: Unplugged, boxed und verpackte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  3. Für Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeitstest verwenden Sie Drosophila Tomatensaft-Maismehl-Medium.
    1. 70 ml warmes Maismehl in ein 100 ml Becherglas geben und 30 ml Tomatensaft (30% v/v) hinzufügen.
    2. Mit einer Küchenmaschine und einer Pipte 3 ml in kleinen Fläschchen gründlich mischen.
    3. Fläschchen mit Käsetuch abdecken und bei RT 24 h vor der Lagerung trocknen lassen.
      HINWEIS: Unplugged, boxed und verpackte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  4. Für die Embryo-Sammlung verwenden Sie Agar-Platten, die 3% Agar, 30% Tomatensauce und 3% Zucker enthalten.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Blasen zu machen, wenn Sie das Medium in die Platten gießen.

2. Drosophila EDC Dosieren

  1. Bereiten Sie eine geeignete Stofflösung vor, die das ausgewählte EDC in dem geeigneten Lösungsmittel auflöst. Für den EE2 (Molekulargewicht 296.403) 1,48 g in 10 ml 100% Ethanol auflösen, um eine 0,5 M Lagerlösung herzustellen und bei -80 °C aufzubewahren.
    ACHTUNG: EDC gelten als Umweltschadstoffe, und es sollten Vorsichtsmaßnahmen bei deren Handhabung getroffen werden.
  2. Verdünnen Sie die EE2-Stammlösung in 10% Ethanol in Wasser (v/v), um eine 100 mM-Lösung zu erhalten. Stellen Sie die nächsten Verdünnungen (0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) in CM-Lebensmitteln her, beginnend mit der niedrigsten Konzentration und der gleichen Endkonzentration an Lösungsmitteln für jede Behandlungsgruppe. Für die Steuerung verwenden Durchstechflaschen das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Endkonzentration des Lösungsmittels so gering wie möglich zu halten, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Endkonzentration von Ethanol 2 % in Flugfutter nicht überschreiten sollte.
  3. Fügen Sie die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, vor der Erstarrung in das Maismehl-basierte Lebensmittel ein, mischen Sie sie gründlich mit einer Küchenmaschine, geben Sie 10 ml in Fläschchen, decken Sie sie mit Wattese ab und lassen Sie sie bei RT 16 h trocknen, bevor Sie sie verwenden.
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Medium sofort nach seiner Herstellung.
  4. Für die Erwachsenenaufzucht verschiedene EE2-Lösungen (10 mM, 50 mM bzw. 100 mM) in 10% Ethanol in Wasser (v/v) und Schicht 100 l von jeweils auf die Oberfläche des AM vorbereiten, um die gewünschte Konzentration des EE2 (0,1 mM) zu erhalten 0,5 mM und 1 mM). Für die Steuerung verwenden Sie das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
    ANMERKUNG: Alternativ fügen Sie die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, einer kleinen Menge von AM in einem 50 ml konischen Rohr hinzu, wirbeln Sie gründlich und schichten Sie 1 ml davon auf die Oberfläche der AM-Fläschchen.
    1. Fläschchen mit Watte bedecken, bei RT 12-16 h unter sanftem Rühren trocknen lassen und sofort verwenden.
      HINWEIS: Der Trocknungsprozess sollte experimentell eingestellt werden, da er von der Umgebungsfeuchtigkeit abhängt.
  5. Zum Fütterungstest sowohl die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) enthält, als auch ein Färbefutter (z. B. den roten Farbstoff Nr. 40 bei 1 mg/ml)35 in den CM vor der Erstarrung, stark mit einem e in Fläschchen.

3. Rearing Fliegen

  1. Verwenden Sie einen robusten isogenen Stamm, wie Oregon R, der von mehreren Generationen im Labor gehalten wird.
  2. Halten Sie Fliegen in einem befeuchteten, temperaturgeregelten Inkubator mit einem natürlichen 12 h Licht: 12 h dunkle Photoperiode bei 25 °C in Fläschchen mit CM-Lebensmitteln.
  3. Verwenden Sie in jedem Test Fläschchen bei RT.

4. Fütterung assay

HINWEIS: Dieser Test wird empfohlen, um zu testen, ob das Vorhandensein des ausgewählten EDC im Medium die Fütterung von Fliegen beeinflussen könnte.

  1. Legen Sie 15 junge Fliegen in Fläschchen mit CM, ergänzt mit unterschiedlichen Konzentrationen des ausgewählten EDC und einem Färbefutter. Lassen Sie Fliegen für 1 Tag von den Medien ernähren.
    HINWEIS:Verwenden Sie z. B. den roten Farbstoff Nr. 4035 (1 mg/ml).
  2. Legen Sie 15 junge Fliegen in Fläschchen mit CM, die nur mit dem Lösungsmittel und einem Färbefutter zur Kontrolle ergänzt werden. Lassen Sie Fliegen für 1 Tag von den Medien ernähren.
  3. Anästhetisieren Sie einzeln jede Gruppe von Fliegen mit Äther.
    1. Übertragen Sie fliegen von jeder Gruppe auf einen zylindrischen Glasbehälter (Äther) mit einem Trichter in das offene Ende eingeführt, invertiert die Durchstechflasche über den Trichter und sanft tippen die beiden Behälter zusammen, um die Fliegen in den Äther fallen.
      HINWEIS:  Der Trichter verhindert, dass sie aus dem Äther herauskommen.
    2. Knock fliegt nach unten, indem man sanft auf den Äther auf einer weichen Oberfläche, wie z. B. einem Mauspad, tippt, und ersetzt den Trichter schnell durch einen ethergetränkten Baumwoll- und Gaze-Stecker.
    3. Warten Sie ca. 1 min, bis die Fliegen auf den Boden fallen und aufhören sich zu bewegen.
      HINWEIS: überschreiten Sie nicht die Zeit oder die Fliegen sterben.
  4. Setzen Sie immobilisierte Fliegen unter ein Stereomikroskop und vergleichen Sie die Bauchfärbung jeder Behandlungsgruppe in Bezug auf die Kontrollgruppe.

5. Fecundity/Fertility Assay

  1. Für jede EDC-Konzentration 3 Fläschchen fliegen, danach Elternfläschchen genannt, mit 8 Weibchen und 4 Männchen in 10 ml CM/EDC-Lebensmitteln; zur Kontrolle bereiten 6 Fläschchen von Fliegen mit 8 Weibchen und 4 Männchen in 10 ml CM Lebensmittel mit Lösungsmittel ergänzt. Hinterfliegen in einem Inkubator bei 25 °C.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überbelegung von Larven während ihrer Entwicklung und versuchen Sie, konsistente Larvendichten in allen Behandlungen zu verwenden.
  2. Nach 4 Tagen, entfernen Sie die Eltern und geben Sie die Fläschchen für 5 weitere Tage in den Inkubator zurück.
  3. Am späten Nachmittag des Tages 9 alle neuen Fliegen von den Fläschchen entfernen und die Fläschchen über Nacht bei 18 °C in einen Brutkasten stellen.
    HINWEIS: Diese Entfernung muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, überprüfen Sie die Oberfläche des Mediums gut.
    1. Am Morgen des 10. Tages sammeln Für jede Behandlungsgruppe jungfräuliche Weibchen und junge Männchen in zwei Gruppen unter leichter CO2-Anästhesisierung. Unterteilen Sie jede Gruppe von Fliegen zufällig in kleine Untergruppen (10 Weibchen und 20 Männchen pro Durchstechflasche) in unabhängigen Durchstechflaschen, die mit frischen entsprechenden CM gefüllt sind.
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.3.1 mit Vorsicht, um sorgfältig alle Fliegen von den Fläschchen 8-10 h vor der Sammlung zu entfernen und lassen Sie Fläschchen bei 18 °C, bis mindestens 30 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen für jede EDC-Konzentration und mindestens 90 jungfrauen Weibchen und 90 Männchen für die Kontrolle zu erhalten.
    2. Beherbergen Sie diese Gruppen von Fliegen bei 25 °C, bis sie 4 Tage nach der Eclosion alt sind, und übertragen Sie sie alle zwei Tage in neue Fläschchen mit frischem entsprechendem Medium.
      Hinweis: 4 Tage ist ausreichend Zeit für die Fliegen, um reife Erwachsene zu werden, aber es ist sehr weit vom Anfang der Seneszenz.
    3. Nach zwei Tagen stellen Sie sicher, dass es keine Larven in den Fläschchen von Frauen. Wenn sie das tun, sind die Fliegen nicht verwendbar, weil sie keine Jungfrauen sind und verworfen werden müssen.
  4. Verwenden Sie 20 Einzelfliegen jedes Geschlechts für jede Behandlungsgruppe, um 20 einzelne Kreuze in kleine Durchstechflaschen mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC zu setzen, wie unten beschrieben.
    1. Weisen Sie jeder Behandlungsgruppe eine andere Reihe von fortlaufenden Nummern zu, die sie eindeutig identifiziert und die jeweiligen Durchstechflaschen kennzeichnet; z. B. Gruppe1 (allein Lösungsmittel) von 1 bis 20, Gruppe 2 (EDC-Konzentration x) von 20 bis 40 usw.
    2. Erstellen Sie eine Fruchtbarkeitstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen, die jeweils einer Behandlungsgruppe entsprechen.
    3. Für jedes Geschlecht anästhesieren alle Fliegen, die zu jeder Behandlungsgruppe unter Licht CO2 gehören, und übertragen Sie sie nach dem Zufallsprinzip wie folgt.
      1. Übertragen Sie ein lösungsmittelbehandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC und fügen Sie ein lösungsmittelbehandeltes Männchen für das Kontrollkreuz hinzu.
        Hinweis: Tomatensaft sollte während seiner Zubereitung dem Medium zugesetzt werden, da dunkles Medium den Kontrast zu den weißen Embryonen erhöht.
      2. Übertragen Sie ein EDC behandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischer CM-Tomate ohne EDC und fügen Sie für jede Behandlung ein lösungsmittelbehandeltes Männchen hinzu.
      3. Übertragen Sie ein mit EDC behandeltes Männchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC und fügen Sie für jede Behandlung ein lösungsmittelbehandeltes Weibchen hinzu.
    4. Beherbergen Sie alle diese einzelnen Kreuze bei 25°C.
  5. Übertragen Sie jedes Paar in frische CM-Tomaten-Fläschchen ohne EDC jeden Tag für die folgenden zehn Tage. Beschriften Sie die replizierten Durchstechflaschen jeder Serie sequenziell; z.B. 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c und melden Sie diese Zahl auf der Fruchtbarkeitstabelle.
  6. Überprüfen Sie jede Durchstechflasche jeden Tag visuell auf die Eier und melden Sie ihre Nummer auf der Fruchtbarkeitstabelle.
  7. Speichern Sie jede Durchstechflasche und, wenn neue Fliegen beginnen zu entstehen, erfassen Sie auch die tägliche Anzahl der erwachsenen Progenies über den 10-Tage-Zeitraum. Nach 10 Tagen nach der ersten Paarung, entfernen Sie die Eltern.
    ANMERKUNG: Durchwahl von Durchstechflasche, in der ein oder beide Elternteile gestorben sind; im Falle der Flucht eines oder beider Elternteile alle Daten bis zum Tag des Verlusts in die Analyse einzubeziehen.
  8. Summieren Sie die tägliche Anzahl der Eier und die tägliche Anzahl der erwachsenen Vorfahren aus jeder Behandlungsgruppe, um die Gesamtfruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, die mittlere Ei- und Nachkommenproduktion durch eine Fliege für zehn Tage und das Verhältnis der Gesamtnachkommen schaft zur Gesamtzahl der gelegten Eier zu erhalten. Berechnen Sie die prozentualen Unterschiede der einzelnen Behandlungswerte in Bezug auf das Steuerelement.
  9. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Gruppe von Fliegen durch, wobei mindestens 10 Fliegen für jede Behandlungsgruppe verwendet werden.
  10. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

6. Entwicklungszeitpunkt

HINWEIS: In den beiden folgenden alternativen Protokollen wird der Entwicklungszeitpunkt bewertet, indem sowohl die Anzahl der Welpen, die sich pro Tag bilden, als auch die Anzahl der erwachsenen Nachkommen pro Tag gezählt wird.

  1. Eclosion Assay Protokoll 1
    1. Für jede Behandlungsgruppe 10 Fläschchen junger (<2 Tage), gesunde Fliegen mit jeweils 6 Weibchen und 3 Männchen in 10 ml Maismehl-Nahrung ohne EDC einrichten.
    2. Lassen Sie Fliegen auf Nahrung für 24 h, und lassen Sie sie zu paaren.
    3. Bereiten Sie 10 parallele Durchstechflaschen pro Behandlungsgruppe mit je 10 ml frischem Maismehlfutter vor, das mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen oder dem Lösungsmittel allein zur Kontrolle ergänzt wird. Transfer-Partnerfliegen auf diese neuen Fläschchen.
      HINWEIS: Weisen Sie für jede Behandlungsgruppe eine andere Reihe von fortlaufenden Nummern zu, die sie eindeutig identifiziert und die jeweiligen Durchstechflaschen kennzeichnet.
    4. Erstellen Sie eine Entwicklungstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen.
    5. Lassen Sie Fliegen Eier für 16 h legen. Dann entfernen Sie die Eltern von Fläschchen.
      HINWEIS: Die übergeordneten Fliegen können verwendet werden, um den Schritt 6.1.5 zu wiederholen, indem sie auf andere entsprechende Durchstechflaschen übertragen werden.
    6. Inkubieren Sie Durchstechflaschen für 3-4 Tage bei 25 °C, oder bis keine Welpen mehr bilden. Zählen Sie jeden Tag die Anzahl der neu pupae in jeder Durchstechflasche und melden Sie es auf der Entwicklungstabelle. Um zu vermeiden, dass die gleiche Pupa zweimal gezählt wird, schreiben Sie eine Zahl nacheinander an jeder Pupa mit einem permanenten Marker auf der Außenseite der Durchstechflasche.
    7. Ab dem Tag 9, zählen Sie täglich die Anzahl der aufstrebenden Erwachsenen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchten, und melden Sie es auf der Entwicklungstabelle.
    8. Aus diesen Rohdaten berechnen Sie die mittlere Larvenperiode, die mittlere Pupalperiode sowie die prozentualen Unterschiede in der jeweiligen Behandlung in Bezug auf die Kontrolle.
    9. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Gruppe von Fliegen durch, indem Sie mindestens 5 Durchstechflaschen für jede Behandlungsgruppe verwenden.
    10. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu vergleichen.
  2. Eclosion Assay Protokoll 2
    1. Junge und gesunde Weibchen (ca. 150) und Männchen (ca. 50) fliegen auf einem Sammelkäfig(Materialtabelle) mit Agar-Tomaten-Medium, ergänzt mit frischer Bäckerhefepaste (3 g Bäckerhefe in 5 ml Wasser), danach als Legeschale bezeichnet, für 2 Tage bei 25 °C.
    2. Während dieser 2 Tage lassen Sie fliegen, um den Käfig an einem dunklen, ruhigen Ort zu akklimatisieren, bevor Sie mit der Eiersammlung beginnen, und wechseln Sie das Legetablett zweimal täglich.
    3. Wechseln Sie am dritten Tag frühmorgens die Legeschale. Nach 1 h die Legeschale ersetzen und diese gelegten Eier entsorgen.
    4. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 h legen und ersetzen Sie durch frische Lege Tablett.
      HINWEIS: Am 3. Tag sollte ein gutes Legetablett 100-200 Eier in 2 h produzieren.
    5. Bereiten Sie für jede Behandlungsgruppe eine Reihe von drei 60-mm-Gerichten vor, die Tomatenmaismehl enthalten, die mit der entsprechenden EDC-Konzentration oder allein mit Lösungsmittel ergänzt werden, und melden Sie jede Serie in der Entwicklungs-Timing-Tabelle. Alternativ, wenn gewünscht, verwenden Sie Fläschchen anstelle von Geschirr.
    6. Nehmen Sie die Eier vorsichtig unter dem Mikroskop auf, indem Sie einen Pinsel oder eine Sonde verwenden und in jeder Schale/Durchstechflasche auf die Oberseite des Mediums übertragen. Um das Zählen zu erleichtern, auf dem Legetablett, ordnen Eier in 5 Gruppen von je 10 und übertragen sie eine nach der anderen.
      HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 6.2.4 so oft wie nötig, um genügend Embryonen zu erhalten.
    7. Beherbergen Sie alle diese Gerichte / Fläschchen bei 25 °C. Bewahren Sie auch jedes Legetablett bei 25 °C auf und zählen Sie die Gesamtzahl der gelegten Eier.
    8. Nach 24-30 h, überprüfen Sie jede Schale / Durchstechflasche unter einem Stereomikroskop und zählen Sowohl die Anzahl der weißen, unbefruchteten Eier als auch die Anzahl der dunkeltoten Embryonen.
    9. Subtrahieren Sie die Anzahl der weißen, unbefruchteten Eier von den 50 übertragenen Eiern, um den Wert "Gesamtembryonen" pro Schale/Durchstechflasche zu erhalten. Die Anzahl der dunkeltoten Embryonen kann verwendet werden, um mögliche toxische Wirkungen des EDC während der Embryogenese zu bestimmen.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.6-6.1.10 des Eclosion Assay Protocol 1.

7. Lifespan-Protokoll

  1. Richten Sie 20 Fläschchen mit 8 Weibchen und 4 Männchen auf und beherbergen Sie bei 25 °C in CM (jeweils 10 ml).
  2. Nach 4 Tagen fliegen entsorgen und Fläschchen wieder in den Inkubator legen.
    HINWEIS: Diese Fliegen können verwendet werden, um wieder zu beginnen, um andere alterssynchronisierte Kohorten der Fliegen zu erhalten.
  3. Am späten Nachmittag des Tages 9, entfernen Sie alle neuen Fliegen von den Fläschchen und kehren Sie Fläschchen zum Inkubator zurück.
    Hinweis: ein paar Erwachsene sollten schon am neunten Tag anfangen zu schließen; Das Wegwerfen dieser Fliegen ermöglicht es, eine maximale Anzahl synchronisierter Fliegen zu sammeln, wodurch die sorglose Auswahl des frühen Auftauchens vermieden wird.
  4. 16-24 h später die erwachsenen Fliegen (1 Tage alt) beider Geschlechter in vier Gruppen von 250 ml Flaschen mit AM-Lebensmitteln, die mit drei verschiedenen EDC-Konzentrationen und eine mit dem Lösungsmittel allein ergänzt werden. Sammeln Sie bei Bedarf am nächsten Tag eine weitere Charge.
  5. Halten Sie Fliegen bei 25 °C für 2-3 Tage, damit sie sich paaren können.
    HINWEIS: Der Tag der Überführung auf AM Food-Fläschchen entspricht dem ersten Tag des Erwachsenenalters.
  6. Nach zwei-drei Tagen sortieren Sie jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen unter leichter CO2-Anästhesisierung. Unterteilen Sie jedes Geschlecht zufällig in fünf Durchstechflaschen pro Behandlung mit einer Dichte von 20 Individuen pro Durchstechflasche, bis es drei Wiederholungen von 5 parallelen Durchstechflaschen für jedes Geschlecht pro Behandlung gibt.
    HINWEIS: Arbeiten Sie mit kleinen Gruppen von Fliegen, um mögliche lang anhaltendeGesundheitsprobleme aufgrund der langen Expositionszeit mit CO2 zu verhindern.
  7. Bereiten Sie eine Lebensspanne Tabelle, in der die Anzahl der toten Fliegen wird von der Anzahl der überlebenden Fliegen auf den vorherigen Transfer subtrahiert, so dass automatisch die Anzahl der Überlebenden bei jedem Transfer zu erhalten.
  8. Transferfliegen in neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter alle 3 Tage zur gleichen Zeit und überprüfen auf Tod.
    HINWEIS: Der Transfer muss ohne Anästhesie erfolgen, was sich langfristig negativ auf die Lebensdauer des Fliegens auswirken könnte.
    1. Notieren Sie bei jedem Transfer das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen.
      HINWEIS: Die Anzahl der überlebenden Fliegen wird automatisch in der Kalkulationstabelle berechnet, aber es wird empfohlen, sie visuell zu überprüfen. Fliegen, die während des Transfers versehentlich entkommen oder sterben, sollten nicht berücksichtigt werden. Achten Sie darauf, nicht zu zählen zweimal tote Fliegen auf die neue Durchstechflasche, die diese Notiz in der Tabelle berichtet.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 7.8 und 7.8.1, bis alle Fliegen sterben.
  9. Erstellen Sie für jede Behandlungsgruppe eine Überlebenskurve, wie in Abbildung 6dargestellt, um die Überlebenswahrscheinlichkeit einer Fliege zu einem bestimmten Zeitpunkt anzuzeigen.
  10. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Behandlungsgruppe von Fliegen durch, indem Sie 100 neu geschlossene Fliegen für jedes Experiment verwenden.
  11. Bereiten Sie eine Tabelle vor, in der die mittlere Lebensdauer (mittlere Überlebenstage aller Fliegen für jede Gruppe), die Halbzeittodeszeit (Zeitraum in Tagen erforderlich, um 50 % Sterblichkeit zu erreichen) und die maximale Lebensdauer (maximale Anzahl von Tagen, die benötigt werden, um 90 % Sterblichkeit zu erreichen) gemeldet werden soll.
  12. Berechnen Sie die prozentualen Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die Kontrollgruppe.
  13. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Behandlungsgruppen zu vergleichen.

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Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Schritte der oben genannten Protokolle in Form vereinfachter Schemata beschrieben. Da Fliegen dazu neigen, ungenießbare Verbindungen zu vermeiden, ist das erste, was zu tun ist, den Geschmack des ausgewählten EDC zu überprüfen. Dies kann durch Mischen einer Lebensmittelfärbung (z. B. roter Lebensmittelfarbstoff Nr. 40)35 mit dem Lebensmittel erfolgen, das mit dem ausgewählten EDC in verschiedenen Dosen oder mit dem Lösungsmittel allein ergänzt wird. Flieg...

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Diskussion

Die Fruchtfliege D. melanogaster wurde ausgiebig als In-vivo-Modellsystem eingesetzt, um die potenziellen Auswirkungen von Umwelt-EDCs wie DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33und EE234. Mehrere Gründe haben seine Verwendung als Modell in diesem Forschungsbereich geführt. Abgesehen von seinen unbestrittenen Vorteilen al...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Orsolina Petillo für die technische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) für die bibliographische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Gustavo Damiano Mita für die Einführung in die EDC-Welt. Die Autoren danken Leica Microsystems und Pasquale Romano für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde vom Projekt PON03PE_00110_1 unterstützt. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
17α-EthinylestradiolSigmaE4876-1G
Agar für Drosophila MediumBIOSIGMA789148
Bisphenol ASigma239658-50G
Bisphenol AFSigma90477-100MG
MaismehlCA' BIANCA
DiethyletherSigma
Drosophila-FläschchenBIOSIGMA78900825 mm x 95 mm
Drosophila-FläschchenBIOSIGMA78900929 mm x 95 mm
Drosophila-FläschchenKaltek18722 mm x 63 mm
Käfig für die EmbryonenentnahmeCraftsPlexiglaszylinder (12,5 mm x 7 cm) mit offenem Ende und dem anderen Ende, das durch einen rechteckigen Boden verschlossen ist, in den ein Schlitz das Einführen von spezielle Tabletts zum Verlegen
von EthanolFLUKA2860
EtherizerCraftszylindrischer Glasbehälter mit einem Wattestopfen
Glasflasche250 mL Flaschen
GlasfläschchenMicrotechST 10024Röhrchen mit flachem Boden 100 x 24
Stabmixer PimmyArieteKüchenmaschine
Instant Erfolg HefeESKAHefepulver
LegeschaleCraftsPlexiglasschalen (11 cm x 2,6 cm) zum Einfüllen von Medium zum Verlegen
von Methyl4-hydroxybenzoatSIGMAH5501
PetrischaleFalke35101660x5
Roter Farbstoff Nr. 40SIGMA16035
Stereomikroskop mit LED-LeuchtenLeicaS4E
SaccharoseHIMEDIAMB025
TomatensauceCirio

Referenzen

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