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Methodenartikel

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

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DOI:

10.3791/59536

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13. August 2019

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Klinisch, Östrogenmangel bei Frauen in der Wechseljahre kann die Inzidenz von Lipidstörungen und Arteriosklerose verschlimmern. Wir etablierten ein In-vivo-Östrogen-Mangelmodell durch bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen. Das Mausmodell ist für das Screening exogener Östrogenbehandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren anwendbar.

Zusammenfassung

Postmenopausale Frauen haben ein höheres Risiko, an Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erkranken als prämenopausale Frauen. Weibliche Mäuse ovariectomisiert (OVX) bei Entwöhnung Sanierung atherosklerotische Läsionen in der Aorta im Vergleich zu weiblichen Mäusen mit intakter Eierstockfunktion. Es fehlen jedoch Labormodelle mit Östrogen-mäusen mit arteriosklerose-anfälligem Status. Dieses Defizit ist entscheidend, weil klinischer Östrogenmangel bei Frauen in der Wechseljahre die Inzidenz von vorbestehenden oder anhaltenden Lipidstörungen und Arteriosklerose verschlimmern kann. In dieser Studie stellen wir ein In-vivo-Östrogen-defizitier-defizitierte Mausmodell durch bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei Apolipoprotein E (apoE)-/- Mäusen fest. Anschließend vergleichen wir die Wirkungen von 17-Estradiol und Pseudoprotodioscin (PPD) (ein Phytoöstrogen), das peroral über Haselnussaufstrich verabreicht wird. Wir stellen fest, dass PPD zwar einen gewissen Effekt auf die Reduzierung des Endkörpergewichts und des Plasma-TG bei OVX-ApoE-/- Mäusen ausübt, aber antiatherosklerotische und kardiale Schutzfähigkeiten hat, die mit seinem 17-Estradiol-Pendant vergleichbar sind. PPD ist ein Phytoöstrogen, das berichtet wurde, Anti-Tumor-Eigenschaften auszuüben. Daher ist die vorgeschlagene Methode für das Screening von Phytoöstrogenen über perorale Verabreichung geeignet, um die traditionelle Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen zu ersetzen, von der berichtet wurde, dass sie potenziell schädliche tumorigenetische fassungsvermögen. Perorale Verabreichung über Haselnuss-Spread ist nicht-invasiv, so dass es weithin anwendbar auf viele Patienten. Dieser Artikel enthält schrittweise Demonstrationen der bilateralen Ovariektomie über den doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen und peroralem 17-Estradiol- oder Phytoöstrogenhormonersatz über Haselnuss-Spread. Plasmalipid- und Herz-Kreislauf-Funktionsanalysen mittels Echokardiographie folgen.

Einleitung

Epidemiologische und klinische Studien haben gezeigt, dass postmenopausale Frauen ein wesentlich höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben als prämenopausale Frauen1,2. Hormonersatztherapie (HRT) kann das relative Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf 0,37-0,793reduzieren. Unter anderen Komplikationen ist Arteriosklerose, die durch Herz-Kreislauf-Erkrankungen verursacht wird, die häufigste Todesursache weltweit4. Jedoch, Labormodelle mit Östrogen-mangelhafte Mäuse präsentieren Atherosklerose anfälligen Status fehlen. Dieses Protokoll bietet ein In-vivo-Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren.

Frühere Studien zeigen, dass die Anwendung von OVX bei atherosklerotischen Nagetieren, die mit einer cholesterinreichen Ernährung gefüttert werden, postmenopausale Frauen nachahmen kann, die an Arterioskleroseleiden 5,6,7,8. Ein reproduzierbares und praktisches Tiermodell, das dem atherosklerotischen Zustand bei Frauen in der Wechseljahre ähnelt, ist die Grundlage der exogenen Östrogenforschung. Hier wurde ein doppelter dorsal-lateraler Schnitt der bilateralen Ovariektomie bei atherosklerose-anfälligen Apolipoprotein E Knockout (ApoE-/-) Mäusen9,10angewendet. Im Vergleich zu mittelabdominalen oder dorsalen Einschnitten ist der doppelte dorsal-laterale Schnitt eine einfachere, weniger zeitaufwändige Methode, die eine schwere Bauchhöhlenhaftung und Entzündungen vermeiden kann. Perorale Verabreichung über Haselnuss-Spread (siehe Tabelle der Materialien) ist nicht invasiv und bequem, so dass es weithin anwendbar als eine langfristige Administrationsmodus11. Slow-Release-Pellet-Implantation ist auch beliebt6. Implantate können jedoch die Inzidenz von Infektionen verschlimmern, insbesondere bei Mäusen, die OVX ausgesetzt sind. Andere nichtinvasive Verabreichungsmodi, wie oral gavage und Wasserverwaltung, haben auch viele Nachteile. Oralgavage in der Regel Stress Mäuse und kann Ösophakenverletzungen verursachen. Die Verabreichung des Hormons über Trinkwasser ist sehr vorteilhaft; die Zugabe von DMSO als Emulgator ist jedoch unvermeidlich, da exogene Östrogene in Wasser unlöslich sind. Hier haben wir uns für perorales 17-Estradiol- oder Phytoöstrogenhormonersatz mittels Haselnussaufstrich für die Langzeitverabreichung entschieden.

Kürzlich wurde die positive Wirkung von HRT auf das Herz-Kreislauf-System von postmenopausalen Frauen in Studien der Frauengesundheitsinitiative (WHI) bestritten12. Auf der einen Seite, exogenes Östrogen allein übt eine positive Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System; auf der anderen Seite, Es kann mit Metohydroxyprogesteron Acetat kombinieren, um das Risiko von kardiovaskulären Ereignissen zu erhöhen. Ernster, HRT kann zu Brust- und Gebärmuttertumorprogression führen, und dieser Effekt hat seine Verwendung deutlich eingeschränkt13,14. Mehr Interesse wurde auf die kardiovaskuläre-schützende Wirkung von exogenen Östrogenen ohne mitotische Aktivität in Tumorzellen15,16,17konzentriert. Mehrere Studien an Menschen und Tieren deuten darauf hin, dass Phytoöstrogene mit Strukturen ähnlichdenen von Östrogenen eine vorteilhafte Rolle im Kardiovaskulären Schutz 15,18spielen können.

Die Ziele der vorliegenden Arbeit sind daher (i) der Aufbau eines In-vivo-Östrogen-Mangel-Mausmodells durch bilaterale Eialistomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt beiApoE-/- Mäusen und (ii) der Vergleich der kardiovaskulären Schutzwirkungen peroraler 17-Estradiol und Pseudoprotodioscin (PPD) über Haselnussaufstrich verabreicht. 17-Estradiol ist eine Art von exogenem Östrogen, das zu den weiblichen Sexualhormonen6,11,19gehört. PPD, ein Steroid Saponin und Phytoöstrogen aus Dioscorea Pflanzen, wurde zuvor berichtet, Anti-Tumor-Eigenschaften ausüben20.

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Protokoll

Alle Tierpflege- und Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chinese Academy of Medical Sciences und dem Peking Union Medical College (Genehmigungsnummer: SYXK (Peking) 2013-0023) genehmigt. Der Ursprung von ApoE-/- Mäusen ist C57BL/6J9,10.

1. Bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt in ApoE-/- Mäuse

  1. Bei der Entwöhnung (Alter 28 Tage) beanten weiblicheApoE-/- C57BL/6J-Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal).
    HINWEIS: 32 ApoE-/- Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen eingeteilt: SHAM, OVX, OVX/E2 und OVX/PPD-Gruppe (n = 8 pro Gruppe).
  2. Legen Sie das Tier in anfälliger Position auf einem Heizkissen. Tragen Sie Augenschmierstoff für den Augenschutz während der Anästhesie auf.
  3. Halten Sie die Körpertemperatur innerhalb von 36 °C bei 0,5 °C. 5 mg/kg Körpergewicht des analgetischen Karprofensubkutanen subkutan zum seitlichen Aspekt des Maushalses.
  4. Rasieren Sie einen 3 x 5 cm2 Mausbereich cephalisch aus dem Iliaskamm. Bevor Sie das Tier mit einem 3 x 5 cm2 Blenden-OP-Opus abdecken, reinigen Sie den rasierten Bereich gründlich mit Jod und dann 70% Ethanol. Verwenden Sie während des Experiments sterile Instrumente und Handschuhe.
  5. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen Schnitt 1 cm seitlich zur Mittellinie und 1 cm seitlich zu den Zahnrippen zu machen.
  6. Sezieren Sie das subkutane Gewebe mit Zangen.
  7. Verwenden Sie eine SezierenderBrille (siehe Materialtabelle), um das weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle zu identifizieren.
  8. Verwenden Sie Mikroschere und Mikrozangen, um einen 0,5-1 cm Schnitt durch die Faszien zu machen, bis die Bauchhöhle erreicht ist.
    HINWEIS: Schließen Sie die Wunden für die scheinbetriebene Gruppe direkt. Die Muskelschicht und die Haut separat mit einer Monofilament-Naht befolgen.
  9. Wenn das weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle zu sehen ist, greifen Sie das Fettgewebe mit Mikrozangen und ziehen Sie es vorsichtig heraus. Ein rosa maulbeerförmiger Eierstock, der von Fettgewebe in der Bauchhöhle umwickelt ist, ist zu sehen.
  10. Ligate das 0,5-1 cm proximale Gefäß und das Uterushorn mit einer Monofilament-Naht. Entfernen Sie den Eierstock mit mikroscheren und legen Sie das restliche Gewebe wieder in die Bauchhöhle.
    HINWEIS: Die wichtigsten negativen Symptome für die OVX-Operation ist die Harnleiterligation, die zu einer hohen Sterblichkeit bei OVX-betriebenen Mäusen führt. Dies kann vermieden werden, indem das Gewebe mit einer SezierenderBrille identifiziert wird.
  11. Schließen Sie die Wunden. Die Muskelschicht und die Haut separat mit einer Monofilament-Naht befolgen.
  12. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen weiteren Schnitt 1 cm seitlich zur Mittellinie und 1 cm seitlich zu den Zahnrippen auf der anderen Seite zu machen. Wiederholen Sie den obigen Vorgang (1.5 bis 1.11).
  13. Lassen Sie das Tier aus der Anästhesie erwachen. Halten Sie die Maus am ersten Tag nach der Operation getrennt auf.
  14. Reinigen oder ersetzen Sie den Käfig während der Erholungsphase häufig.
  15. Ca. 24 h nach der Operation, verabreichen weitere 5 mg/kg Körpergewicht des analgetischen Carprofen subkutan.

2. Perorale Verabreichung von 17-Estradiol oder PPD über Haselnuss-Spread

  1. 17-Estradiol oder PPD in Sesamöl gründlich auflösen und dann das Sesamöl mit Haselnussaufstrich vermischen (siehe Materialtabelle). Eine tägliche Portion für jede 30 g-Maus enthält 3 g 17-Estradiol oder 15 g PPD, 4 l Sesamöl und 60 mg Haselnussaufstrich. Bereiten Sie ein Placebo für jede 30 g Maus enthält 4 l Sesamöl und 60 mg Haselnuss-Spread.
    HINWEIS: Der tägliche Verabreichungsanteil von 17-Estradiol oder PPD basierte auf früheren Studien6,11 und Vorversuchen.
  2. Eine Woche nach OVX, füttern sie die Mäuse mit einer high-cholesterol Diät (1,25% Cholesterin, 0% Cholat) für 12 Wochen. Ein typisches experimentelles Behandlungsschema, wie es in dieser Studie verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt.
  3. 5 Tage vor der peroralen Verabreichung der Haselnussausbreitung in Woche 4 trainieren Sie die Mäuse, das Placebo mit ca. 30 mg Haselnussaufstrich für 2-5 Mäuse für 5 Tage zu essen. Trainieren Sie die Mäuse in Gruppen in ihren heimischen Käfigen während der ersten 3 Tage. Legen Sie die Mäuse am vierten und fünften Trainingstag in getrennte Käfige und dienen Sie dem täglichen Teil, um der Versuchssituation zu ähneln.
  4. Legen Sie die Mäuse in den letzten 9 Wochen in getrennte Käfige und servieren Sie dann eine tägliche Portion der Haselnuss-Brotaufstrichsportion für jeden Fütterungsanlass.
    HINWEIS: Eine tägliche Portion mit 17-Estradiol (0,1mg-kg-1) oder PPD (0,5mg-kg-1) über Haselnussaufstrich in DER GRUPPE OVX/E2 bzw. OVX/PPD servieren; eine tägliche Portion mit hormonfreier Haselnussaufstrich in SHAM und OVX-Gruppe servieren.

3. Bestimmung der Intima-Mediendicke und Kardiondysfunktion mit einem Mikroultraschallsystem

  1. Ultrasonografische Biomikroskopie
    1. Einen Tag vor Beendigung untersuchen Sie die Dicke der Intima-Medien und die Herzfunktionsstörung mit einem Mikroultraschallsystem (siehe Materialtabelle), wie zuvor beschrieben21.
    2. Geben Sie vor der Untersuchung jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Avertin (Tribromoethanol) als Anästhesie (n = 8 Mäuse pro Gruppe).
    3. Rasieren Sie das Halshaar jeder Maus sorgfältig. Tragen Sie warmes Ultraschall-Übertragungsgel großzügig auf, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.
    4. Erhalten Sie ultrasonographische Basisbilder der Aortenwurzel und der aufsteigenden Aorta mit dem 30 MHz Scankopf mit einem Fokus von 12,7 mm und einer Auflösung von 40 m.
    5. Verwenden Sie die Elektrokardiographie mit einer Lead-II-Konfiguration zur Überwachung.
    6. Erfassen Sie rechte parasternale Langachsenbilder der aufsteigenden Aorta, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterienverzweigung in einer Ebene in Systole (Abbildung 3).
  2. Messungen der Intima-Medien und der maximalen Plaquedicke
    1. Passen Sie den Abstand zwischen dem Messumformer und dem arteriellen Ort leicht an, um klare Bilder zu erhalten.
    2. Speichern Sie eine 10 s Cine Loop digital für die Offline-Untersuchung auf einem Bildanalysesystem.
    3. Wählen Sie für weitere Messungen manuell ein optimales Ultraschallbild für Freezeframe. Überprüfen Sie die Bilder in der kleinen Krümmung der aufsteigenden Aorta. Wenn Plaque in der aufsteigenden Aorta zu sehen ist, messen Sie die maximale Plaquedicke. Wenn Plaque in der aufsteigenden Aorta nicht sichtbar ist, messen Sie das maximale IMT.
    4. Messen Sie das IMT (Abstand zwischen der vaskulären luminal-intimalen Schnittstelle und der medial-adventitialen Schnittstelle). Messen Sie die maximale Plaquedicke (der dickste Abstand zwischen der Grenze des Gefäßlumens und der adventlichen Schicht).
    5. Durchschnittliche Daten von drei Läsionsstandorten (Abbildung 3).
  3. Bestimmung der Herzfunktionsstörung mittels Echokardiographie
    HINWEIS:     Untersuchen Sie die Herzfunktion durch Echokardiographie mit einem Mikroultraschallsystem, wie zuvor beschrieben22.
    1. Richten Sie einen Ultraschallstrahl in Richtung Herz, in der Nähe der Papillenmuskeln.
    2. Erzielen Sie eine zweidimensionale Elektrokardiogramm-basierte Kilohertz-Visualisierung.
    3. Führen Sie die in vivo transthorakale Echokardiographie des linken Ventrikels mit einem 30-MHz-Scankopf durch.
    4. Messen Sie Parameter, die mit der Herzfunktion verbunden sind, digital aus M-Modus-Tracings.
    5. Durchschnitt der Daten von drei bis fünf Herzzyklen (Tabelle 1).
  4. Intra- und Interobserver-Variabilität
    1. Zur Validierung der Intraobserver-Variabilität können Sie die Daten von einem Operator bei zwei verschiedenen Gelegenheiten analysieren.
    2. Zur Bewertung der Interobserver-Variabilität können Sie die Daten von einem anderen Operator analysieren.

4. Wöchentliche Körpergewichtsmessung und Plasma-Gesamtcholesterin (TC) und Triglycerid (TG) Bestimmung

  1. Wöchentliche Körpergewichtsmessung
    1. Messen Sie die Körpergewichte einmal pro Woche von Woche -1 bis Woche 12.
      HINWEIS: n = 8 Mäuse pro Gruppe.
  2. Plasmapräparation
    1. Vor der Entnahme von Blutproben durch intrakardiale Punktion, bereiten Sie Spritzen und Tuben vor. Verwenden Sie EDTA als Antikoagulans. Fügen Sie jeder 2 ml Spritze 10 l 0,5 M EDTA hinzu und fügen Sie jedem 1,5 ml-Rohr 8 l 0,5 M EDTA hinzu.
    2. In Woche 12, nach einer Nacht schnell, beanten die Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal).
      ANMERKUNG: n = 3 Mäuse pro Gruppe.
    3. Bereiten Sie den ventralen Brustbereich mit 70% Ethanol vor.
    4. Verwenden Sie Schere und Zange, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie die Rippen, bis das schlagende Herz ausgesetzt ist.
    5. Setzen Sie die 25 G Nadel in den rechten Ventrikel ein. Langsam aspirieren, bis Blut in die Spritze zu fließen beginnt.
      HINWEIS: Wir verwenden Einwegspritzen in sterilem Zustand mit 25 G Nadeln (siehe Materialtabelle).
    6. Weiter mit stetigem, gleichmäßigem Druck. Wenn kein Blut gesehen wird, positionieren Sie die Nadel neu und wiederholen Sie die Aspiration.
    7. Halten Sie Mäuse tief beästhestisiert, bevor Sie das erforderliche Blutvolumen sammeln. Normalerweise können bis zu 1 ml Blut entnommen werden. Euthanisieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation unter diesem tiefen anästhetischen Zustand.
    8. Pipette Blutproben in 1,5 ml Tuben und invertieren das Blut gründlich, um sicherzustellen, dass EDTA in das Blut gemischt. Dann legen Sie die Blutproben sofort auf Eis.
    9. Zentrifugenproben für 20 min bei 400 x g bei 4 °C innerhalb von 30 min der Sammlung.
    10. Sammeln Sie den Überstand sorgfältig. Aliquot und speichern Sie Plasmaproben bei -80 °C.
  3. Konstruieren von Standardkurven für die TC- oder TG-Inhaltsmessung
    1. Für die TC-Standardkurve verschiedene Konzentrationen von Cholesterinstandards vorbereiten: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L und 10,34 mmol/L. Maß O.D. für jeden Cholesterinstandard. Legen Sie den durchschnittlichen O.D. für jeden Cholesterinstandard fest. Legen Sie als vertikalen (Y) Achsenwert die Konzentration als horizontalen (X) Achsenwert fest. Erstellen Sie eine Standardkurve mithilfe einer statistischen Software.
    2. Bereiten Sie für die TG-Standardkurve verschiedene Konzentrationen der TG-Normen vor: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L und 9,04 mmol/L. Messung O.D. für jede TG-Norm. Legen Sie den durchschnittlichen O.D. für jeden TG-Standard als vertikalen (Y) Achsenwert fest; Konzentration als horizontalen (X) Achsenwert festlegen. Erstellen Sie eine Standardkurve mithilfe einer statistischen Software.
      HINWEIS: Für die Standardkurvenkonstruktion wurde in der vorliegenden Studie eine vierparameter-logistische Kurvenanpassung (4-pl) verwendet. Überprüfen Sie die Standardkurve vor der Messung der Plasmaproben, und stellen Sie sicher, dass r2 größer als 0,995 ist.
  4. TC-Inhaltsmessung
    1. Beschriften Sie die Flasche Farbreagenz (25 ml) aus tc Assay Kit als "TC Working Solution".
    2. Wirbel die gekühlten Proben kurz. Bereiten Sie Verdünnungen vor: 20 l Plasma in 80 l destilliertem Wasser. Kurz Wirbelverdünnungen.
    3. Fügen Sie 2,5 l Cholesterinstandards (5,17 mmol/L) oder 2,5 l verdünntes Plasma oder 2,5 l destilliertes Wasser (leer) in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Platte ein. Triplication wird empfohlen.
    4. Zu allen Brunnen, fügen Sie 250 l des Farbreagenz.
    5. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    6. Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und lassen Sie sich 10 min aufwärmen.
    7. Entfernen Sie die Platte(n) aus dem Inkubator und lesen Sie den Mikroplattenleser bei 510 nm. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen oder Staub in den Mikrotiterbrunnen bzw. an der Unterseite der Platte vorhanden sind.
    8. Berechnen Sie die TC-Konzentration wie folgt:
      TC Cont. = Cholesterinstandards Cont. ( Plasmaprobe O.D.-blank O.D)/(Cholesterinstandards O.D.-blank O.D)
  5. TG-Inhaltsmessung
    1. Beschriften Sie die Flasche Farbreagenz (25 ml) aus dem TG-Assay-Kit als "TG Working Solution".
    2. Wirbel die gekühlten Proben kurz.
    3. Fügen Sie 2,5 l TG-Normen (2,26 mmol/L) zu oder 2,5 l verdünntes Plasma oder 2,5 l destilliertes Wasser (leer) zu den entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu. Triplication wird empfohlen.
    4. Zu allen Brunnen, fügen Sie 250 l des Farbreagenz.
    5. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    6. Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und lassen Sie sich 10 min aufwärmen.
    7. Entfernen Sie die Platte(n) aus dem Inkubator und lesen Sie den Mikroplattenleser bei 510 nm.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen oder Staub in den Mikrotiterbrunnen oder auf der Unterseite der Platte vorhanden sind.
    8. Berechnen Sie die TG-Konzentration wie folgt:
      TG-Forts. = TG-Normen Cont. (Plasmaprobe O.D.-blank O.D)/(TG-Normen O.D.-blank O.D)

5. En Gesichtsanalyse aortenatheklerotischer Läsionen

  1. Aorta-Isolation und Exzision
    1. In Woche 12, nach einer Nacht schnell, beanten die Mäuse mit Avertin (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal). Euthanisieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation unter diesem tiefen anästhetischen Zustand.
      HINWEIS: Wir verwendeten 3 Mäuse pro Gruppe.
    2. Bereiten Sie den ventralen Brustbereich mit 70% Ethanol vor. Verwenden Sie Schere und Zange, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie die Rippen, bis das schlagende Herz ausgesetzt ist.
    3. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Phosphatgepufferter Saline bei pH 7,4 (siehe Materialtabelle). Legen Sie eine 25 G Nadel in den linken Ventrikel und schneiden Sie das rechte Atrium, um hohen Druck durch Perfusion zu vermeiden.
    4. Führen Sie in situ Perfusion mit einer Durchflussrate von 0,05-0,08 ml/min. Perfusionsflüssigkeit mit Geweben absorbieren.
    5. Entfernen Sie Rippen und Lunge in der Brusthöhle mit Schere und Zange. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle und entfernen Sie die Organe im Inneren für eine bessere Sicht auf die Aorta.
    6. Entfernen Sie die Aorta, indem Sie das Herz mit den Mikrozangen halten und die Aorta von der Wirbelsäule dorsal mit Mikrosissoren bis zur Iliasverzweigung trennen.
      HINWEIS: Bei der Sezierung in der Nähe der renalen Vorhofzweige, tief schneiden mit Mikroschere, um Aorta-Schäden zu vermeiden.
    7. Fixieren Sie das Herz und die Aorta für 48 h in 4% Paraformaldehyd. Bewahren Sie die Aortas bei Raumtemperatur oder bei 2-8 °C für einige Stunden in der Kabine auf.
      HINWEIS: Dieses Verfahren erleichtert die Reinigung.
  2. Vorbereitung der Aorta
    1. Entfernen Sie das Herz. Entfernen Sie vorsichtig das adventliche Gewebe aus den Aortas mit Mikrozangen und Mikrosissoren unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie Saline, um das Gewebe während der Reinigung feucht zu halten.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Aorta und einige wichtige Zweige, wie die innomische Arterie, die gemeinsame Halsschlagader und die linke subklavische Arterie nicht zu reißen oder zu nicken.
    2. Lassen Sie 1 mm der innomischen und linken Karotisarterien und schneiden Sie die gesamte linke subklavische Arterie ab.
    3. Schneiden Sie die äußere Krümmung durch die innomische Arterie, dann auf die linke gemeinsame Halsschlagader und dann auf die linke subklavische Arterie.
    4. Schneiden Sie entlang der inneren Krümmung des aufsteigenden Teils bis zum Boden des Bauchteils.
    5. Die Aorta flach auf eine schwarze Kunststofffolie anheften und saline auftragen, damit Aortas nicht trocknen.
  3. Bild der Intimregion von Aorta
    1. Nehmen Sie Fotos von en gesicht aortas mit einem Stereomikroskop auf. Fügen Sie ein Millimeter-Skalalineal in die Bilder ein, um Messungen zu kalibrieren.
    2. Schließen Sie die Bogen- und Brustregionen in ein anderes Bild und den Bauchbereich ein. Speichern Sie Bilder als JPEG oder TIFF.
      HINWEIS: Der Bogenbereich ist von der Kreuzung des Myokards bis 3 mm distal von der linken subklavischen Arterie, die Thoraxregion ist 3 mm distal zur linken subklavischen Arterie bis zur letzten interkostalen Arterie, und die Bauchregion ist die letzte interkostale Arterie zum Iliac Gabelung.
  4. Quantifizierung der atherosklerotischen Läsion-en-Gesichtsmethode
    1. eichung
      1. Öffnen Sie das Bild mit Bildanalysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), gehen Sie zu Räumliche Kalibrierung und folgen Sie den Anweisungen.
      2. Ändern Sie Referenzeinheiten in mm, indem Sie das Lineal über der Linie positionieren.
    2. ausmaß
      1. Legen Sie für jedes Bild die richtige Kalibrierung fest.
      2. Messen Sie 3 mm auf dem Lineal.
      3. Bogen- und Thoraxbereichsmessung: Umreißen Sie den Bogenbereich von der Kreuzung des Myokards bis zu 3 mm distal von der linken subklavischen Arterie und der Thoraxregion von 3 mm distal bis zur linken subklavischen Arterie bis zur letzten interkostalen Arterie. Verfolgen Sie Läsionen im Bogen- und Brustbereich und betrachten Sie die Aorta durch das Mikroskop.
      4. Abdominalbereichsmessung: Skibauchregion vom Ende der Brustregion bis zur Iliasbifurkation umreißen. Verfolgen Sie Läsionen im Bauchbereich und betrachten Sie die Aorta durch das Mikroskop.
      5. Berechnen Sie den Läsionsbereich relativ zur inneren Oberfläche der Aorta.
      6. Überprüfen Sie die Quantifizierung durch einen zweiten Beobachter, der blind für die Studiengruppen ist.

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Ergebnisse

Ein typisches experimentelles Behandlungsschema, wie es in dieser Studie verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der Entwöhnung (Alter 28 Tage) wurden weibliche ApoE-/- C57BL/6J-Mäuse mit Avertin anästhesiert (Tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneal). Mäuse wurden bilateral OVX oder Schein durch einen 1 cm dorsalen Schnitt operiert. Eine Woche nach bilateralem OVX wurden die Mäuse 12 Wochen lang mit einer cholesterinreichen Ernährung...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode ist ein Mausmodell, das Lipidstörungen und Arteriosklerose bei Frauen in der Wechseljahre ähnelt. Es ist gut dokumentiert, dass Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen die Inzidenz von vorbestehender oder anhaltender Hypercholesterinämie mit zunehmend komplexen und weit verbreiteten atherosklerostischen Läsionen verschlimmern kann1. Um den atherosklerose-anfälligen Status in der Klinik nachzuahmen, wurden apoE-mangelhafte Mäuse, eine reproduzierbare und bequeme Que...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81202526 bis J.X.), der National Natural Science Foundation of China (81302769 bis B.S.), der Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 to B.S.), der Chinesischen Postdoktorandenstiftung unterstützt. Science Foundation (20110490325 bis J.X.) und die Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 bis B.S.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
17β-Östradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGÖstrogen
Einwegspritzen (mit 25 G Nadeln)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0,5 * 19TWLBHerzblutungen
Cholesterinreiche MausdiätHuafukang Bio-TechnologyN / A1,25 % Cholesterin, 0 % Cholat
Hochauflösendes In-vivo-MikrobildgebungssystemVisualSonicsVevo® 770Messungen der Intima-Media-Dicke und der Herzfunktionsstörung
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLVorbereitung einer Avertin
Mikrodisparierzange, gebogen 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Instrumente
Mikrodisparierzange, gerade 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Werkzeuge
Mikro-Präparierschere, gebogen/scharf 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Werkzeuge
Mikro-Präparierschere, gerade/scharf 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Werkzeuge
Monofile Naht 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Naht und Ligatur des Gewebes
Nusscreme (Nutella)FerreroN/AMedium für perorale 17β-Estradiol oder PPD
OptiVisor optische Glas-BinokularlupeDohegan Optical Company Inc.N/AAssistent bei der Identifizierung des Gewebes während der Ovariektomie
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei pH 7,4SIGMAP3813Vorbereitung von 1 l Kochsalzlösung
Pro MultiLabel Microplate ReaderTecanInfinite M1000Plasma TC- und TG-Bestimmung
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T EntwicklungW-0427CAS-Registernummer 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Postoperative Analgesie nach Ovariektomie
SesamölSigma-AldrichS3547-1LAuflösen des 17β-Östradiols oder PPD
Solcoseryl Augen-GelMenarini, Solco Basel AGAugenschutz während der Anästhesie
StereomikroskopMCALONMCL-6STVAufnahme der Intimregion der Aorta
Tischmodell HochgeschwindigkeitszentrifugeSIGMA1-14KVorbereitung einer
Plasmaschere, leichte Kurve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Instrumente
Schere, gerade flach (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Instrumente
Gewebezange, gezahnt, leicht gebogen (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Werkzeuge
Gewebezange, gezahnt, gerade Flach (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdChirurgische Werkzeuge
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5GVorbereitung von Avertin
Triglyceriden (TG) Assay-KitInstitut für Nanjing Jiancheng Biologie IngenieurwesenA110-1Plasma-TG-Bestimmung
Assay-Kit für Gesamtcholesterin (TC)Institut für Nanjing Jiancheng BiologieA111-1Plasma-TC-Bestimmung

Referenzen

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