Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4⁺ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.

Abstract

Beschrieben wird eine einfache, in vitro, auf Farbstoffen basierende Methode zur Messung der antigenspezifischen CD4⁺ T-Zellproliferation in mononukleären menschlichen Blutzellen (PBMCs). Die Entwicklung stabiler, ungiftiger Fluoreszenzfarbstoffe wie Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ermöglicht es, seltene, antigenspezifische T-Zellen von Umstehenden durch Verminderung der fluoreszierenden Färbung zu unterscheiden, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Diese Methode hat gegenüber alternativen Ansätzen folgende Vorteile: (i) Sie ist sehr empfindlich gegenüber niederfrequenten T-Zellen, (ii) es ist keine Kenntnis des Antigens oder Epitops erforderlich, (iii) der Phänotyp der reagierenden Zellen kann analysiert werden, und (iv) lebensfähig, Zellen können sortiert und für weitere Analysen verwendet werden, z. B. t Zellklonen.

Introduction

Die Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu erkennen und zu untersuchen, ist in Studien zur zellvermittelten Immunität wichtig. Dies ist jedoch besonders anspruchsvoll für autoantigenspezifische CD4⁺ T-Zell-Antworten, die sehr schwach und schwer zu erkennen sind. Eine gängige Methode zum Nachweis der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation ist [3H]-Thymidin, ein radioaktiv markiertes Nukleotid, das in die DNA von proliferierenden Zellen integriert ist. Obwohl der [3H]-Thymidin-Assay die DNA-Synthese erkennen kann, ist diese Methode ein indirektes Maß für die Zellteilung, da die DNA-Synthese unabhängig von Mitose initiieren kann (d. h. bei Genduplizie....

Protocol

Alle Probanden gaben vor der Entnahme von peripherem Blut eine informierte Einwilligung. Die ethische Zulassung für Experimente mit PBMC wurde von St. Vincent es Hosptial erteilt (HREC-A 135/08 und HREC-A 161/15).

1. Reagenz-Vorbereitung

1. HumanE T-Zell-Medien
   1. Bereiten Sie RP-5-Medien für die Kultivierung von PBMC vor, das aus RPMI 1640, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (2 mM), Penicillin (100 U/mL)/Streptomycin (0,1 mg/ml) und 5% gepooltem humanem Serum (PHS) besteht.
2. CFSE-Aktienlösungen
   1. Bereiten Sie einen Stammbestand vor,....

Results

In-vitro-Stimulation menschlicher PBMCs mit Tetanus-Toxoid-Protein: PBMCs wurden mit CFSE gefärbt und 7 Tage lang in Gegenwart von Tetanus-Toxoid stimuliert. Fast alle Spender zeigten eine starke T-Zell-Reaktion auf Tetanus-Toxoid, weil sie geimpft worden waren, was Tetanus-Toxoid zu einem nützlichen Positiv-Kontroll-Antigen macht. Abbildung 2 zeigt in dreifacher Ausfertigung, dass die CFSE-Proliferation von CD4⁺ T-Zellen aus nicht stimulierten PBM.......

Discussion

CFSE-basierte Proliferation ist eine einfache und robuste Methode zum Erkennen und Aufzählen von antigenspezifischen menschlichen CD4⁺ T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, dass die optimale Konzentration von CFSE für optimale Ergebnisse unerlässlich ist⁴. Zu viel CFSE hebt die Proliferation auf, während zu wenig nicht zulässt, dass geteilte und ungeteilte Zellen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu werden relativ hohe CfSE-Konzentrationen (5,0 m) zur Kennzeichnung gereinigter muriner .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human-CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrixprotein 1	Sino Biological	40010- V07E
Nicht-essentielle Aminosäuren (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Gepooltes Humanserum	Australisches Rotes Kreuz	N/A
Proinsulin C-Peptid PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom hergestelltes synthetisches Peptid
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus-Toxoid-Protein	Statens Serum Intitut	N/A