Ein präzises Pathogen-Liefer- und Wiederherstellungssystem für murine Modelle der sekundären bakteriellen Pneumonie

Zusammenfassung

Hier stellen wir Methoden zur Verbesserung der sekundären bakteriellen Lungenentzündungsstudien vor, indem wir einen nicht-invasiven Weg der Instillation in die unteren Atemwege bereitstellen, gefolgt von der Genesung von Krankheitserregern und der Transkriptanalyse. Diese Verfahren sind reproduzierbar und können ohne spezielle Ausrüstung wie Kanülen, Führungsdrähte oder Glasfaserkabel durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Sekundäre bakterielle Lungenentzündungen nach Influenza-Infektionen gehören in den Vereinigten Staaten immer wieder zu den Top Ten der häufigsten Todesursachen. Bis heute, murine Modelle der Ko-Infektion waren das primäre Werkzeug entwickelt, um die Pathologien der primären und sekundären Infektionen zu erforschen. Trotz der Prävalenz dieses Modells sind in den Studien erhebliche Diskrepanzen in Bezug auf Instillationsverfahren, Dosisvolumina und Effizienzen vorherrschend. Darüber hinaus waren diese Bemühungen weitgehend unvollständig, um zu untersuchen, wie der Erreger das Fortschreiten der Krankheit nach der Infektion direkt beeinflussen kann. Hierbei bieten wir eine präzise Methode zur Errekung, Genesung und Analyse, die in murinen Modellen der sekundären bakteriellen Lungenentzündung verwendet werden kann. Wir zeigen, dass die intratracheale Instillation eine effiziente und genaue Abgabe kontrollierter Volumina direkt und gleichmäßig in die unteren Atemwege ermöglicht. Lungen können ausgeschnitten werden, um die Krankheitserregerbelastung zu erholen und zu quantifizieren. Nach der Exzision der infizierten Lunge beschreiben wir eine Methode zur Extraktion hochwertiger Pathogen-RNA für die nachfolgende Transkriptionsanalyse. Dieses Verfahren profitiert von einer nicht-chirurgischen Methode der Lieferung ohne den Einsatz von spezialisierten Laborgeräten und bietet eine reproduzierbare Strategie, um Krankheitsbeiträge zur sekundären bakteriellen Lungenentzündung zu untersuchen.

Einleitung

Sekundäre bakterielle Lungenentzündung nach Influenza-Infektion ist eine führende Todesursache in den Vereinigten Staaten und ein aktives Forschungsgebiet^1,2. Trotz zahlreicher Studien mit murinen Modellen der sekundären bakteriellen Lungenentzündung, Inkonsistenzen in Bezug auf Pathogen-Instillation und Verhör bleiben^3,4,5. Darüber hinaus haben sich viele frühere Bemühungen auf die immunmodulatorischen Wirkungen der Influenza konzentriert, die zu einer erhöhten anfälligen sekundären bakteriellen Infektion führen, doch deuten neuere Daten darauf hin, dass die Virulenzregulation des bakteriellen Erregers gleich hoch ist. Beitrag zur Etablierung der Krankheit^6,7,8,9. Diese neuen Daten erfordern eine genauere Methode zur Untersuchung der sekundären bakteriellen Lungenentzündung in murinen Modellen der Koinfektion, die die Untersuchung der Pathogenreaktion erleichtern.

Einzigartig bei Influenza-Koinfektionsmodellen werden Wirtsorganismen vor der Verabreichung des sekundären bakteriellen Wirkstoffs absichtlich durch eine primäre Influenza-Infektion immungeschwächt. Um die bei menschlichen Wirten beobachtete Krankheitspathogenese optimal zu replizieren, ist es zwingend erforderlich, die Pathogenbelastung sowohl von primären als auch von sekundären Erregern zu kontrollieren, um die individuellen und kombinatorischen Wirkungen jedes Infektiers zu beobachten. Am häufigsten, Atemwegsinfektionen bei Mäusen wurden durch eine intranasale Verabreichung etabliert^3,4,5,6,10. Da dieser Weg als technisch einfach bekannt ist und in einigen Anwendungen für Infektionen mit einem Einzigen Initiativ geeignet sein kann, ist er für Koinfektionsmodelle ungeeignet, da Instillationsverfahren, Dosisvolumina und Wirksamkeit innerhalb von veröffentlichte Literatur^3,4,5,6.

Um ein vollständigeres Verständnis der sekundären bakteriellen Lungenentzündung pathogenese zu gewinnen, müssen Beiträge sowohl des Wirts als auch des Erregers berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck haben wir einen einfachen und reproduzierbaren Ansatz für die Wiederherstellung lebensfähiger Bakterien und Erreger-RNA aus infizierter Lunge entwickelt. Diese Methode verwendet ein vereinfachtes, nicht-invasives intratracheales Instillationsverfahren, gefolgt von einer anschließenden Isolierung der bakteriellen RNA. Das hier beschriebene intratracheale Instillationsverfahren ähnelt den zuvor beschriebenen Methoden und ist nicht auf die Erregerabgabe^11,12,13beschränkt. Die Verwendung dieses speziellen Verfahrens profitiert von kostengünstigen Kosten und erfordert nicht die Verwendung von speziellen Geräten wie Kanülen, Führungsdrähten oder Glasfaserkabeln; darüber hinaus, weil dieses Verfahren nicht-invasiv ist, versichert es minimale Belastung auf murine Probanden, minimiert eine Entzündungsreaktion von der Impfmechanik und bietet einen effizienten Verabreichungsweg für die Infektion mehrerer Probanden. Kurz gesagt, werden isoflurane anesthetisierte Mäuse von den Schneidezähnen suspendiert. Zangen werden verwendet, um die Zunge sanft zu greifen, gefolgt von dem Einsetzen einer vorbelasteten gebogenen, stumpfgekippten 21-Spur-Nadel in die Luftröhre und der Lieferung von Krankheitserregerlast. Die Validierung dieses Verfahrens wird durch die visuelle Bestätigung des Farbstoffs demonstriert, der gleichmäßig in das Lungenfach verteilt ist, und die Wiederherstellung der bakteriellen Belastung. Wir zeigen dann, wie man lebensfähige Staphylococcus aureus (S. aureus) aus infizierten Lungen zurückgewinnt und beschreiben eine reproduzierbare Methode, um hochwertige Erregern RNA zu isolieren.

Protokoll

Alle Methoden entsprechen den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Montana State University genehmigt.

1. Intratracheale Instillation

1. Bereiten Sie einen Arbeitsbereich mit folgenden Vorräten vor: eine Intubationsplattform, eine sterile 1 ml Spritze, sterile stumpfe Zangen, sterile 21-Spur stumpfe Nadel und zwei konische Schläuche, um die Spritze und die Zange zu lagern.
   HINWEIS: Intubationsplattformen können kommerziell erworben oder im eigenen Haus gebaut werden. Die hier verwendete Intubationsplattform wurde aus 0,25 Zoll Plexiglas gebaut. Kurz gesagt, wurde Die Wärme auf das Plexiglas aufgebracht und das Brett ist auf einen etwa 65° Innenwinkel gebogen. Auf der Außenseite der Intubationsplattform wurden zwei Maschinenschrauben im Abstand von 3 Zoll gesät und ein Gummiband zwischen den beiden Schrauben aufgehängt.
2. Bereiten Sie den Erreger Inokulum vor, indem Sie die Probe seriell verdünnen, so dass die gewünschte Endkonzentration in einem Gesamtvolumen von 50 l erreicht wird. Lagern Sie das Inokulum auf Eis.
3. Mit sterilen Handschuhen eine 21 G stumpfe Nadel auf ca. 35° biegen.
   HINWEIS: Für jede Maus wird eine separate Nadel benötigt.
4. Befestigen Sie die gebogene 21 G stumpfe Nadel an einer 1 ml Spritze. Ziehen Sie ein Luftkissen von 100 l in die Spritze, gefolgt von 50 l des Infektiöseers. Legen Sie die geladene Nadel und Spritze an einer Stelle, die von der dominanten Hand leicht zugänglich ist.
5. Eine Maus mit einem 4% Isofluran/Sauerstoffgemisch oder einer ähnlichen IACUC-zugelassenen Anästhesiemethode tief anästhesisieren. Die richtige Anästhesietiefe wird in der Regel erreicht, wenn die Atmungsraten langsam auf etwa 1 Inhalation pro 5–8 s ansteigen und durch Kneifen eines Anhängsgutes und beobachten keine Reaktion von der Maus bestätigt werden können.
   HINWEIS: Diese Anästhesiemethode bot eine ausreichende Anästhesisierungsdauer von ca. 1,5 min. Dies reichte aus, damit die Mitglieder in unserem Labor dieses Instillationsverfahren erlernen und durchführen können. andere institutionell zugelassene Anästhesiemethoden können jedoch^11,12,13eingesetzt werden.
6. Entfernen Sie die anästhesierte Maus aus der Anästhesiekammer und hängen Sie die Maus auf der Intubationsplattform von den Oberkieferschneidezähnen aus.
7. Um einen klaren Durchgang in die Luftröhre zu öffnen, verwenden Sie die stumpfgekippten Zangen, um die Zunge außerhalb des Mundes sanft zu greifen und auszudehnen. Übertragen Sie die Zunge von der Zange in den Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand.
8. Halten Sie die Zunge in der nicht-dominanten Hand und nehmen Sie die vorinstallierte Spritze auf. Richten Sie das gebogene Ende der Nadel vom Körper weg und legen Sie die Nadel in die Mundhöhle an die Basis der Zunge.
9. Mit der Nadel an der Basis der Zunge, winkeln Sie das Handgelenk vorsichtig, um einen leichten Druck der Nadel weg vom Körper zu verursachen. Dieser Schritt versichert, dass die Nadel in die Luftröhre und nicht in die Speiseröhre eingeführt wird.
10. Führen Sie die Nadel langsam in die Luftröhre; oft wird eine leichte Zecke gefühlt, wenn die Nadel durch die Stimmfalte geht. Passieren Sie die Nadel durch die Luftröhre, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist, wenn die Nadel auf die Karina trifft.
11. Heben Sie die Nadel leicht in proximale Richtung an, um die Nadel über der Karina aufzuhängen. Dies ermöglicht die Abgabe in die beiden primären Bronchien. Drücken Sie den Kolben der Spritze vollständig, um die infektiöse Last zu liefern. Entfernen Sie die Nadel aus der Luftröhre, indem Sie nach oben heben und entsorgen.
12. Entfernen Sie die Maus von der Intubationsplattform, indem Sie das Gummiband drücken, aber halten Sie die Maus in einer aufrechten Position. Versperren Sie die Nasenwege, indem Sie einen Finger direkt über die Nares legen. Halten Sie diese Position für ca. 1 min oder bis mehrere tiefe Atmungen beobachtet werden.
    HINWEIS: Dieser letzte Schritt stellt sicher, dass das gesamte Inokulumvolumen in die unteren Atemwege abgegeben wird.
13. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und beobachten Sie eine vollständige Erholung von der Anästhesie.

2. Exzision infizierter Lungen

1. Arbeiten Sie in einer laminaren Strömungshaube, um die Sterilität aufrechtzuerhalten, bereiten Sie einen Arbeitsbereich mit folgenden Elementen vor: ein Waagen- und steriles Wägeboot, eine Sezierplattform, ein Sezierset mit Schere und Zange, steriles, RNAse-freies PBS und sterile Gaze.
2. Euthanisieren Sie eine infizierte Maus mit_CO2 oder einer ähnlichen IACUC-zugelassenen Euthanasie-Methode.
3. Platzieren Sie eine infizierte Maus auf einer Sezierplattform und sichern Sie die Maus mit Pins am Ende jedes Anhängselns. Sprühen Sie die Maus mit Ethanol, um die Sterilität der Arbeitsflächen zu erhalten.
4. Beginnend am Nabel, verwenden Sie ein Paar Zange, um die Haut zu heben und einen Schnitt bis zur Basis der Luftröhre zu machen. Greifen Sie die Haut auf beiden Seiten des anfänglichen Schnitts, ziehen Sie die Haut weg vom Körper und schneiden Sie die Gewebeverbindungen.
   HINWEIS: Es kann hilfreich sein, mehrere seitliche Schnitte über die Haut zu machen, um mehr von der Brustregion zu offenbaren.
5. Beginnend an der Basis des xiphoiden Prozesses, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Absicht, das Zwerchfell zu punktieren. Dies führt zu einer Erhöhung des Drucks in der Brusthöhle, die dazu führt, dass sich die Lunge zurückzieht. Wenn die Lunge zurückgezogen wird, setzt der Schnitt fort, um das Zwerchfell zu befreien.
6. Entfernen Sie die Rippen, indem Sie einen Schnitt auf beiden Seiten des Rippenkäfigs machen. Dadurch werden die Brusthöhle und die Lunge vollständig freizulegen sein.
7. Um die Lunge zu verbrauchen, greifen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und heben Sie nach oben. Legen Sie die Schere hinter die Lunge und beginnen Sie, kleine Schnitte durch die Gewebeverbindungen zu machen, während Sie das Herz weiter nach oben heben.
8. Sobald die Lunge ausgeschnitten wurde, legen Sie sie auf die sterile Gaze und entfernen Sie das Herz. Das Herz kann leicht entfernt werden, indem man es mit der Zange von der Lunge weghebt und die restlichen Gewebeverbindungen schneidet.
9. Übertragen Sie die Lunge auf ein vorgetetes Wägeboot und erfassen Sie das Gewicht.
10. Nachdem die Lunge gewogen wurde, übertragen Sie sie in sterile Phosphatgepufferte Saline (PBS) und lagern Sie sie vorübergehend auf Eis, bis sie sich auf die Genesungs- und Analyseschritte des Erregers konzentrieren.

3. Pathogen-Recovery und -Analyse

1. Während Der weiteren Arbeit in einer laminaren Strömungshaube, bereiten Sie einen Arbeitsbereich mit folgenden Vorräten vor: eine Gewebemühle, sterile RNAse-freie PBS, Puffer RLT, ergänzt mit ß-Mercaptoethanol (1:100), und 1,5 ml RNAse-freie Mikrozentrifugenröhren.
   VORSICHT: ß-Mercaptoethanol kann bei Hautkontakt, Einnahme, Augenkontakt oder Einatmen gefährlich sein. Die Verdünnung von ß-Mercaptoethanol in Puffer RLT sollte in einer Dunstabzugshaube erfolgen.
2. Beginnen Sie, indem Sie zuerst 1 ml sterile RNAse-freie PBS in den Gewebeschleifer hinzufügen. Nach dem Befüllen die Gewebemühle auf Eis aufbewahren.
3. Bereiten Sie eine Reihe von sterilen RNAse-freien seriellen Verdünnungsröhrchen vor, die verwendet werden, um die bakterielle Belastung zu quantifizieren, die aus der infizierten Lunge zurückgewonnen wurde. Dies wird am einfachsten erreicht, indem 900 l steriles Wasser in jedes Mikrozentrifugenrohr geleitet werden, gefolgt von einer seriellen Verdünnung des Erregers Inokulum.
   HINWEIS: Die Anzahl der Verdünnungsröhrchen, die für eine genaue Pathogenaufzählung erforderlich sind, variiert je nach anfänglichem Erregereinsatz und Infektionsdauer. Dies muss empirisch bestimmt werden.
4. Mit sterilen Zangen die Lunge in den vorbereiteten Gewebeschleifer übertragen und das Gewebe gründlich homogenisieren, indem sie beim Drehen auf den Sockel drücken.
5. Öffnen Sie den Gewebeschleifer und aliquot 100 l der homogenisierten Probe in die erste der vorbereiteten seriellen Verdünnungsrrohre. Die Proben seriell verdünnen und KBE aufzählen, indem sie sich auf den Närgar verstauen. KBE können als KBE/ml oder KBE/ml/mg Lungengewebe erfasst werden.
   ANMERKUNG: In diesem Schritt können zur Reinigung viraler RNA zusätzliche 200 l der homogenisierten Probe entnommen (siehe Materialtabelle)oder bei -80°C für zukünftige Analysen gespeichert werden.
6. Nachdem die Aliquoten zur KBE-Bestimmung und/oder viralen RNA-Isolierung entfernt wurden, ersetzen Sie das Mahlsockel und pellet das homogenisierte Gewebe durch Zentrifugation bei 4.000 U/min (3724 x g) für 10 min bei 4 °C.
7. Mit einer Pipette den Überstand aus der pelletierten Probe entfernen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
   HINWEIS: Der Überstand ist frei von Bakterien und kann bei -80 °C zur Analyse von löslichen Wirts- und sezernierten Krankheitsfaktoren gelagert werden.
8. Das homogenisierte Gewebepellet durch Pipettieren oder Wirbeln in 700 l Puffer RLT-ß-Mercaptoethanol aussetzen und die Probe in ein steriles RNAse-freies 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
   HINWEIS: An dieser Stelle können die Proben mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.
9. Reinigen Sie rna mit leichten Modifikationen am Herstellerprotokoll eines Reinigungskits (siehe Materialtabelle); siehe Voyich et al. 2008¹⁴.
   1. Die homogenisierte Lungenschlämme in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit 0,1 mm Kieselsäureperlen geben und über einen Perlenschlag für 20 s bei 6 m/s verarbeiten.
   2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.500 U/min für 3 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr pipette.
   3. Fügen Sie der Probe 350 l 96%–100% Ethanol hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren oder Inversion.
   4. Übertragen Sie 700 l der Probe in eine Reinigungskolonne, die in einem 2 ml Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie die Probe bei 8.000 x g für 15 s und entsorgen Sie den Durchfluss. Führen Sie alle überschüssigen Stichproben durch dieselbe Spalte wie oben beschrieben aus.
   5. Waschen Sie die Säule mit 700 l Puffer RW1 und Zentrifugenprobe bei 8.000 x g für 15 s. Entsorgen Sie den Durchfluss und übertragen Sie die Kieselsäure-Membransäule in ein neues 2 ml-Sammelrohr.
   6. Wenden Sie 500 L Puffer-RPE auf die Spalte an. Waschen Sie die Säule durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 15 s. Entsorgen Sie den Durchfluss.
   7. Tragen Sie für 2 min einen zusätzlichen Puffer-RPE von 500 l auf die RNeasy-Säule und -Zentrifuge bei 8.000 x g auf. Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrieren Sie die Säule bei 10.000 x g für 1 min.
   8. Um gereinigte RNA zu löschen, übertragen Sie zunächst die Säule auf ein neues 1,5 ml RNAse-freies Mikrozentrifugenrohr. Pipette 50 l RNase-freies Wasser direkt auf die Kieselgelmembran der Säule und Zentrifuge bei 8000 x g für 1 min.
      HINWEIS: Die eluierte RNA kann wieder über dieselbe Säule laufen, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen.
   9. Fügen Sie der gereinigten RNA 50 l RNase-freies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 l zu erhöhen. Aliquot 350 l RLT-ß-Mercaptoethanol, gefolgt von 250 l 96%–100% Ethanol in die Probe und gründlich durch Pipettieren oder Inversion mischen.
   10. Tragen Sie die Probe auf eine Reinigungskolonne auf, die in einem Sammelrohr und einer Zentrifuge bei 8000 x g für 15 s platziert ist. Entsorgen Sie den Durchfluss und ersetzen Sie das Sammelrohr.
   11. Waschen Sie die Säule, indem Sie 350 l Puffer RW1 hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 8000 x g für 15 s.
   12. Bereiten Sie eine DNase-Lösung vor, die ca. 27 Kunitz-Einheiten enthält, indem Sie 10 L DNase-Bestand (750 Kunitz-Einheiten/ml) zu 70 L Puffer-RDD hinzufügen. Fügen Sie die DNase-Lösung direkt auf die Kieselgelmembran und inkubieren Sie die Probe 15 min bei Raumtemperatur.
   13. Waschen Sie die Säule mit 350 l Puffer RW1 und Zentrifuge bei 8000 x g für 15 s und entsorgen Sie den Durchfluss.
   14. Wiederholen Sie die Schritte 3.9.6–3.9.8, um die RNA zu reinigen.
       HINWEIS: Es wird empfohlen, das RNA-Bereinigungsverfahren zu wiederholen, indem Sie die Schritte 3.9.9–3.9.10 und 3.9.6–3.9.8 befolgen (DNase-Schritte 3.9.11–3.9.13 überspringen). Diese zusätzliche Reinigung führt zu einer sehr hochwertigen RNA.
10. Die RNA-Ausbeute kann mit einem Spektralphotometer mit Messwerten bei 260 nM zur Bestimmung der Konzentration und 260:280 nM für Reinheit quantifiziert werden. Nach dem Erzielung der RNA-Ausbeute die Konzentration jeder RNA-Probe auf 50 ng/l standardisieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, mehrere Aliquots in einer Konzentration von 50 ng/l zu machen, um Frost-/Tauzyklen zu vermeiden, die zu einem RNA-Abbau führen können.
11. Bewahren Sie die gereinigte RNA bei -80 °C auf oder verwenden Sie sie sofort für die Transkriptanalyse.
    HINWEIS: In früheren Veröffentlichungen wurde RNA von 3–5 Mäusen für die Transkriptanalyse gepoolt. Durch die Optimierung der obigen Technik wurde die RNA von 1 Maus empirisch als ausreichend für die Transkriptanalyse ermittelt (80–120 ng/l).

Ergebnisse

Abbildung 1 nutzt eine 0,1% Gewicht/Volumen Coomassie brillante blaue Lösung zu zeigen, dass eine intratracheale Instillation liefert das Inokulum direkt und gleichmäßig innerhalb der unteren Atemwege. Abbildung 2 zeigt, dass sich die Bakterien (S. aureus) KBE direkt aus homogenisiertem Lungengewebe erholt haben. Abbildung 3 zeigt die Verwendung dieses Systems zur präzisen Abgabe und Rückgewinnung von Inokulum in den unteren Atemwegen, indem die Ein- und Rückgewinnungs-KBE von einzelnen Mäusen dargestellt werden. Abbildung 4 zeigt die qRT-PCR-Verstärkungskurve des bakteriellen Housekeeping-GengyrB, um zu zeigen, dass bakterielle RNA direkt aus infiziertem Lungengewebe mit minimaler DNA-Kontamination extrahiert werden kann. Abbildung 5 zeigt die Konstruktion einer Standardkurve mit qRT-PCR-Verstärkung des Influenza-A-Virus M-Segment, um zu demonstrieren, dass virale RNA direkt aus infiziertem Lungengewebe extrahiert werden kann.

Abbildung 1: Die intratracheale Instillation ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung in die unteren Atemwege. (A, B) Nicht infizierte Lungen wurden von einer gesunden Maus nach intratrachealer Instillation von sterilem PBS entfernt und aus (A) dorsalen und (B) ventralen Perspektiven fotografiert. (C, D) 50 l einer 0,1% Coomassie brillanten blauen Lösung wurden einer anästhesierten Maus über intratracheale Verabreichung verabreicht. (C) Dorsal. (D) Ventral. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Rückgewinnung von bakteriellen KBE aus infiziertem Lungenhomogenat. Lungen wurden eines Tages nach der Herausforderung mit S. aureus entfernt. Nach der Homogenisierung wurden 100 l der Lungenschlämme seriell durch 10^-6verdünnt. Um die wiedergewonnenen KBE aufzuzählen, wurden 10 L-Tropfen aus den Verdünnungen 10^-5 und^10-6 auf tryptischen Soja-Agar (TSA) plattiert und bei 37 °C mit 5%_C02 über Nacht inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Präzise Abgabe und Rückgewinnung des Erregers Inokulum nach intratrachealer Verabreichung. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen mit drei Mäusen pro Gruppe eingeteilt. Mäuse wurden einer intratrachealen Instillation von S. aureus bei 1 x 10⁸ (niedrig) und 2 x 10⁸ (hoch) CFU/ml unterzogen. Eine Stunde nach der Infektion wurden Mäuse eingeschläfert und die Lunge ausgeschnitten, um die Präzision der Instillation und Genesung zu demonstrieren. Bakterielles Inokulum und Bakterien, die aus dem Lungenhomogenat gewonnen wurden, wurden auf TSA (tryptic soy agar) plattiert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen bakteriellem Input und Erholung berichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative bakterielle RNA-Wiederherstellung und Reinheit. Sechs Stunden nach der intratrachealen Instillation mit 1 x 10⁸ CFU/50 L S. aureuswurden Mäuse eingeschläfert. Die Lunge wurde ausgeschnitten und homogenisiert, gefolgt von einer Resuspension der Lungenschlämme im Puffer RLT-ß-Mercaptoethanol. Die RNA wurde wie in Schritt 3.9¹⁴beschrieben gereinigt. qRT-PCR wurde verwendet, um Transkripte des bakteriellen Housekeeping-GengyrB zu detektieren. Eine Kontrolle, die keine Reverse-Transkriptase (nRT) enthielt, wurde aufgenommen, um die Reinheit der zurückgewonnenen RNA nachzuweisen. Bei einem Schwellenwert von 0,1 wurden GyrB-Transkripte bei einem durchschnittlichen Zyklus von 21,1, 20,3 und 20,5 nachgewiesen. nRT-Kontrollen wurden erst bei den Zyklusdurchschnitten 35,9, 35,5 und 35,0 erkannt. n = 3 biologische Replikationen, die 3 technische Replikationen/biologische Replikationen enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative virale RNA-Wiederherstellung. Sechs Tage nach der intratrachealen Instillation mit 100 PFU/50 L Influenza A/PR/8/1934(H1N1) wurden Mäuse eingeschläfert. Die Lunge wurde ausgeschnitten und homogenisiert, und 200 l der homogenisierten Gülle wurden gesammelt und vor der viralen RNA-Reinigung durch ein 70-m-Zellsieb geleitet. Die gereinigte RNA wurde seriell verdünnt (10^-1-10^-4), gefolgt von einer Verstärkung des Influenza-A-M-Segments. (A) Amplifikationsdiagramm der Influenza-A-RNA, die aus einer infizierten Lunge gewonnen und 10^-1-10^-4verdünnt wurde. (B) Standardkurve der Influenza A M-Segment. Schwellenwert = 0,2, R² = 0,994, Steigung = -3,46. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Verwendung dieses Modells bietet eine hocheffiziente und reproduzierbare Methode zur Untersuchung sekundärer bakterieller Infektionen. Die Fähigkeit, die Zufuhr des Erregers Inokulum streng zu kontrollieren, ermöglicht genauere Beobachtungen der individuellen und kombinatorischen Wirkungen jedes Erregers. Ineffizienzen in der häufigeren intranasalen Instillationsroute haben wahrscheinlich zu den Diskrepanzen in den Dosismengen und Konzentrationen in der Literatur beigetragen. Es ist vernünftig, dass das Fehlen eines präzisen murinen Systems zur Untersuchung der sekundären bakteriellen Lungenentzündung Ergebnisse verzögert hat, die bakterielle spezifische Reaktionen identifizieren, die zur Schwere der Lungenkoinfektionen beitragen. Die Entwicklung eines reproduzierbaren Modells zur Untersuchung der Virulenzexpression bei sekundären bakteriellen Infektionen könnte zur Identifizierung von Impfstoff- oder Medikamentenzielen führen, um diese Infektionen zu mildern.

Der intratracheale Instillationsschritt ist entscheidend, um erfolgreich eine Infektion der unteren Atemwege und jede Stromanalyse der Erreger zu etablieren. Beim Erlernen dieser Technik kann es hilfreich sein, die Verwendung eines Farbstoffs (wie in den Methoden beschrieben) vor der Verabreichung von infektiösem Material zu üben. Die Verwendung eines Farbstoffs ermöglicht die direkte Visualisierung des Inokulums in die Atemwege. Ein häufiger Fehler, der auftreten kann, ist das Einsetzen der stumpfen Nadel in die Speiseröhre und nicht die Luftröhre. Dies führt zur Abgabe des Inokulums in den Magen und nicht in die Lunge. Um diesen Fehler zu korrigieren, winkeln Sie die Nadel weiter vom Körper weg und geben Sie sie in die Luftröhre. Einmal gemeistert, ist dieses Verfahren sehr effizient und kann verwendet werden, um Experimente mit einer großen Anzahl von Mäusen durchzuführen. In Chargen zur Anästhesisierung von Mäusen kann die intratracheale Instillation in ca. 30 Sekunden pro Maus abgeschlossen werden. Darüber hinaus kann die Exzision der Lunge in 2 bis 3 Minuten pro Maus abgeschlossen werden.

Die Wiederherstellung lebensfähiger und reiner bakterieller RNA aus infizierten Geweben ist für die Transkriptanalyse von entscheidender Bedeutung. RNasen sind allgegenwärtig und können ein Experiment schnell ruinieren¹⁵. Einige Methoden umfassen die Verwendung von RNase-Inhibitoren; Wir haben jedoch festgestellt, dass das Einfrieren der Probe bei -80 °C in RLT-ß-Mercaptoethanol oder die sofortige Verarbeitung der Probe für die RNA-Isolierung mit allen RNase-freien Röhrchen und Reagenzien wirksam zur Verringerung der RNase-Kontamination ist. Darüber hinaus empfehlen wir, maximal sechs Proben gleichzeitig zu reinigen. Das Einschließen von mehr als sechs Proben kann zu längeren Latenzen zwischen Protokollschritten führen, die in einem RNA-Abbau gipfeln können. Einmal gereinigt, sollte auch darauf geachtet werden, unnötige Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Wenn also mehrere Analysen an einer Probe durchgeführt werden, wird empfohlen, gereinigte RNA zur Speicherung bei -80 °C zu aliquotieren.

Zusätzlich zu den hier untersuchten Techniken kann diese Methode durch die Durchführung von Bronchialalveolar-Lavage vor der Exzision und Homogenisierung der Lunge¹⁶ergänzt werden. Dies kann durch Eine Spülung der gesamten unteren Atemwege oder durch die Verwendung von Nahtgewinde erreicht werden, um einen verzweigten Arm des Bronchialbaumes zu beschränken, gefolgt von einer Lavage durch den verbleibenden Ast. Oft führt dies zu einer Verringerung der Erholung der Pathogenlast, bietet aber eine Probe, woraufhin Informationen wie Laktatdehydrogenase-Aktivität, Zellpopulationsidentität und Zytokinprofile erhalten werden können¹⁶. Zusammen können diese Daten ein vollständigeres Verständnis der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen bilden, die während einer sekundären bakteriellen Lungenentzündung auftreten.

Während die diskutierten Methoden im Zusammenhang mit sekundärer bakterieller Lungenentzündung waren, sind sie geeignet, auf jedes murine Modell der Infektion der unteren Atemwege ausgedehnt zu werden; insbesondere diejenigen, die von einer streng kontrollierten Lieferung und Wiederherstellung des installierten Inokulums profitieren würden. Darüber hinaus kann die intratracheale Instillation, wie viele andere Infektionswege, in nicht-infektiösen Anwendungen wie der Verabreichung von Therapeutika und Umweltverbindungen¹²eingesetzt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lysing Matrix B	MP Biomedicals	6911100	Im Text als "0,1 mm Silica Beads" bezeichnet
stumpfe Nadel mit 21 Gauge	SAI	B21-150	1,5" empfohlen.
RNase-freies DNase Set	Qiagen	79254	DNase, das im Begleittext verwendet wird.
FastPrep-24 Classic Instrument	MP Biomedicals	116004500	FastPrep FP120 ist nicht mehr verfügbar. Im Text als "Bead Beater" bezeichnet
TaqMan AIV-Matrix Reagenzien	Angewandte Biosysteme	4405543	Influenza A M-Segment qRT-PCR-Kit.
Intubationsständer	Kent Scientific	ETI-MES-01	Im Text als "Intubationsplattform" bezeichnet. Die Intubationsplattform, die im begleitenden Video verwendet wird, wurde im eigenen Haus hergestellt.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA-Aufreinigungskit; enthält RNeasy-Säulen, Puffer RLT, Puffer RW1 und Puffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904	Aufreinigungskit für virale RNA.
Tissue-Grinder	Thermo Fisher Scientific	02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol)	Calbiochem	UN2966