Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Konventionelle zweidimensionale (2D) Zellkulturstudien haben wesentlich zur Krebsforschung beigetragen. Derzeit bewegen sich die Forscher eher in Richtung dreidimensionaler (3D) Zellkultur, um die in-vivo-Bedingungen besser nachzuahmen^. Die 3D-Krebszellkultur reflektiert die komplexe Tumormikroumgebung in Bezug auf Zell-und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Genexpressionsprofile, Medikamentenempfindlichkeitund Signalweg-Aktivität 2,3.

In der Krebsforschung werden mehrere 3D-Zellkulturmodelle eingesetzt, wie Tumorgewebeforscher, Tumor auf einem Chip und multizelluläre Tumorspheroide^3,4. Multikelluläre Tumorspheroide sind heute weit verbreitet, da sie mehrere Merkmale der in vivo Bedingungen bei menschlichen Tumoren 1^,5imitieren. Wenn der Kugeldurchmesser größer als 500 μm ist, hat er sogar hypoxische Regionen und ein nekrotisches Zentrum, das somit die in vivo tumor Situation²darstellt.

Viele synthetische (z.B. Polydimethylsiloxan) und tierabgeleitete (z.B.^{Rattenschwanz-Typ}I Kollagen und Maus-Sarkom-abgeleitete Matrix, Matrigel, genannt MSDM) wurden für 3D-Zellkultur Assays 3^{, 6 entwickelt}, ^7,8. Bisher stammt keine der kommerziell erhältlichen Matrizen aus menschlichem Tumorgewebe. Daher fehlen ihnen die Merkmale der menschlichen Tumormikroumgebung, die erhebliche Auswirkungen auf die Prozesse der Krebszellen hat8.

Myogel (menschliche Myoma-abgeleitete Matrix, genannt HMDM) wird aus dem menschlichen Gebärmutter-Kärteryomyomomomyom-Tumorgewebe 9 extrahiert. Es hat sich gezeigt, dass sich der Proteingehalt von HMDM deutlich von dem von MSDM unterscheidet. Tatsächlich unterscheiden sich 66% der HMDM-Proteine von MSDM-Proteinen. Auf der anderen Seite sind in beiden Matrizen 10 Proteine wie Laminin, Typ-IV-Kollagen, Heparansulfat-Proteoglykane, Nidogen und epidermale Wachstumsfaktor vorhanden. Darüber hinaus unterscheidet sich die Maus vom Menschen im Enzym-Gehalt, wobei Menschen 78 weniger Proteasen haben als Mäuse 11.

Fibrin wurde allein oder in Kombination mit anderen Materialien als Gerüst 12 verwendet. In der 3D-Zellkultur werden die kommerziell erhältlichen menschlichen Fibrinogen und Thrombin zu einem Fibrin-Hydrogel¹²kombiniert.

Dieses Protokoll beschreibt eine Verbesserung der zuvor eingeführten 3D-Tumor-Spheroid-Invasion Assay⁷. Dieses neue Protokoll wendet menschliche Tumor-abgeleitete Matrix anstelle von Maus-abgeleiteter Tumormatrix an. Dazu gehören auch bildgebende und Analysetechniken mit Hilfe von ilastik und Fidschi ImageJ Software. Dieses Protokoll könnte für Spheroid-Test von mehreren verschiedenen Festkörperkörperspelinien verwendet werden. Es bietet ein biologisch relevantes Werkzeug, um neuartige Krebstherapien zu entwickeln und die Auswirkungen bestimmter Moleküle auf die Invasion von Krebszellen zu untersuchen.

1. Generation von Multicellular Tumor Spheroids

NOTE: Das Protokoll wird hier mit UT-SCC-42A und -42B-Zelllinien demonstriert, könnte aber auch mit anderen Zelllinien angewendet werden.

1. Waschen Sie die UT-SCC-42A und -42B Zellen mit 6 ml Phosphat-gepufferten Saline (PBS), Fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA (3 mL für 75 cm 2 Flasche) hinzu und legen Sie die Flasche in einen Zellkultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO_2,95% Luftfeuchtigkeit) für 2-5 min.
2. Überprüfen Sie, ob sich die Zellen unter einem Mikroskop gelöst haben. Dann fügen Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM)-Medium (DMEM) hinzu, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 250 ng/mL amphotericin B, 0,4 μg/mL Hydrocortison, und 50 μg/mL Ascorbinsäure), um das Enzym zu neutralisieren (6 mL für 75 cm ² Flasche) und die Zellaufhängung in ein 15 ml konisches Rohr übertragen.
   NOTE: Wählen Sie das Zellkulturmedium aus, das zu den untersuchten Zellen passt.
3. Zentrifugen Sie die Zellaufhängung auf 200 x g für 5 min.
4. Entfernen Sie den Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 2-5 ml kompletter DMEM.
5. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie die Zellaufhängung mit kompletter DMEM auf eine Endkonzentration von 20.000 Cells/mL.
   NOTE: Für jede Zelllinie muss eine optimale Zellzahl festgelegt werden.
6. Disppense 50 μL der Zellaufhängung in jede ultraniedrige Befestigung 96-gut runde Bodenplatte gut für eine endgültige Konzentration von 1.000 Zellen pro Brunnen.
7. Verlegen Sie die Platte auf den Zellkultur-Inkubator (37 ° C_,5% CO 2,95% Luftfeuchtigkeit). Vier Tage später die Tumorspheroidbildung mit einem umgekehrten Mikroskop visuell bestätigen und mit dem Test fortfahren. Achten Sie darauf, dass es nur einen Spheroid pro Brunnen gibt.
   NOTE: Die Zeit, die für die Bildung eines Wirbelsäule benötigt wird, variiert zwischen verschiedenen Zelllinien.

2. Dreidimensionale Spheroid-Invasion Assay

NOTE: Bereiten Sie eine 2x Lösung vor, da das Gel verdünnt wird 1:1, wenn es in die Brunnen gegeben wird.

1. Tauwetter HMDM auf Eis und Fibrinogen Bestandslösung in einem Wasserbad bei 37 ° C gepflegt. Stören Sie den Fibrinogen nicht, bis er vollständig gelöst ist und legen Sie die Lösung nicht auf Eis; Niederschlag wird auftreten.
2. Mischen Sie das passende Volumen jedes Reagenzes: 1 mg/mL HMDM (Endkonzentration: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL Thrombin (Endkonzentration: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (Endkonzentration: 33,3 ug/mL), und 1 mg/mL fibrinogen (Endkonzentration: 0,5 mg/mL ).
   NOTE: Fibrinogen kurz vor der Abgabe der Mischung in die Brunnen geben und schnell arbeiten; Es wird in wenigen Minuten ein Gel bilden. Behandeln Sie nur ein paar Brunnen auf einmal.
3. 50 μL des Gels in jeden Brunnen geben. Die Spitze in Richtung der Innenwand des Brunnens richten und langsam pipeln. Vermeiden Sie Luftblasen (mit der umgekehrten Pipettiertechnik) und versuchen Sie, das Kugelschreibwerk nicht aus der Mitte des Brunnens zu bewegen.
4. Bringe die Platte zurück zum Zellkultur-Inkubator und lasse die HMDM/fibrin-Matrix 30 Minuten lang verfestigen und fügt sanft 100 μL komplette DMEM in jedes Gut oben auf dem Gel ein.

3. Bildgebung

1. Bildt die Spheroide täglich mit einem umgekehrten Lichtmikroskop ab. Alternativ können Sie auch automatische Bildgebungssysteme verwenden.

4. Bildsegmentierung mit Ilastik

1. Öffnen Sie die ilastik und wählen Sie den Workflow der Pixelklassifikation (Abbildung 1A). Es klassifiziert die Pixel auf der Grundlage von Anmerkungen, die vom Benutzer gemacht werden. Speichern Sie ilastik Projekt (.ilp) auf den Computer.
2. Fügen Sie Bilder für Analysen hinzu. Klicken Sie auf Eingabedaten und fügen Sie Neues hinzu und wählen Sie dann die Bilder aus (Bild 1B).
3. Für die Auswahl der Funktionen klicken Sie auf Feature Selection und SelektionFeatures (Abbildung1 C, rotes Rechteck).
   Hinweis: Die ausgewählten Merkmale sollten in etwa den visuellen Eigenschaften entsprechen, die die Objekte vom Hintergrund trennen, und sie werden für die Ausbildung des Klassifizierers verwendet.
   1. Wählen Sie Funktionen aus, indem Sie auf die Kästchen klicken. Die ausgewählten Boxen werden grün (Abbildung 1C, blaues Rechteck).
      NOTE: Hier kann der Benutzer aus verschiedenen Funktionstypen und Skalen auswählen. Die Color/-Intensität sollte ausgewählt werden, um Objekte zu trennen, die auf Farbe oder Helligkeit basieren. Edge sollte ausgewählt werden, um Objekte zu trennen, die auf Helligkeit oder Farbverläufen basieren. Textur ist ein wichtiges Merkmal, wenn die Objekte im Bild ein besonderes texturales Aussehen haben. Für diesen Test werden Color/Intensität (Sigma 0) und Edge (Sigma 6) verwendet.
4. Für das Training, Klicktraining und im Training gibt es zwei Labels: Label 1 und Label 2 (Abbildung1 D, rotes Rechteck). Wenn es nur ein Etikett gibt, fügen Sie ein neues Etikett hinzu, indem Sie das Label Add drücken (Abbildung 1D, blaues Rechteck).
   1. Markieren Sie den Hintergrund mit einem der Etiketten (Abbildung 1D, gelb) und die Zellen mit dem anderen Etikett (Abbildung1D, blau).
   2. Trainieren Sie die Software für die ersten 10% der Bilder. Wählen Sie das nächste Bild aus der aktuellen Ansicht.
   3. Nachdem die Zellen und der Hintergrund markiert sind (des ersten Bildes), drücken Sie Live Update (Abbildung1D,lila Rechteck).
      Hinweis: Mit dem nächsten Bild führt ilastik die Analyse automatisch nach den vorherigen Bildern durch.
5. Nachdem das Training abgeschlossen ist und ilastik alle Bilder analysiert hat, klicken Sie auf Vorhersage Export. Wählen Sie die einfache Segmentierung von der Quelle; Wählen Sie keine Wahrscheinlichkeiten oder irgendetwas anderes (Abbildung 1E).
6. Wählen Sie das gewünschte Ausgabedateformat aus den Einstellungen für Exporten Export wählen ... in der Rubrik Vorhersage Export(Abbildung1E). Exportieren Sie die Ergebnisse der Beschriftung, indem Sie auf Export All klicken (Abbildung 1F). Die Dateien werden in denselben Ordner mit den Originalbildern exportiert.
   Hinweis: In diesem Experiment wird. h5-Format verwendet.

5. Flächenanalyse mit Fidschi-ImageJ

1. Skala Einstellung
   1. Öffnen Sie das Originalbild mit einem Skalenbalken in Fidschi ImageJ (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass das Bild die gleiche Größe und Dimension hat wie die analysierten Bilder. Verwenden Sie das Werkzeug für die Linienauswahl, um eine Linie mit einer bekannten Länge zu zeichnen (Abbildung 2B).
      NOTE: Dieses Protokoll wird durch die Verwendung von Fiji ImageJ 1.51 (64-Bit) und ilastik-1.3.2rc ausgeführt.
   2. Klicken Sie auf Analyse und Scale ( Abbildung2C). Stellen Sie die bekannte Distanz im Feld " Bekannte Distanz " ein und stellen Sie die richtige Einheit ein und klicken Sie auf Global (Abbildung2D).
2. Installation des Makros
   1. Wenn ein Plugin ilastik nicht installiert ist, folgen Sie diesen Schritten: Klicken Sie auf Hilfe, Update .... Auf dem geöffneten Fenster ImageJ Updater, klicken Sie auf Aktualisierungs-Websitesverwalten. Auf dem geöffneten Fenster Aktualisierungs-Websites verwalten, klicken Sie neben ilastik und klicken Sie dann auf Schließen. Dann klicken Sie auf Änderungen im Fenster ImageJ Updateranwenden. Dieser Prozess kann einige Zeit in Anspruch nehmen. Das nächste Fenster wird Informationen mit dem Text aktualisiert erfolgreich. Klicken Sie auf OK und starten Sie ImageJ neu.
   2. Klicken Sie auf Plugins, Macrosund Install (Abbildung 3A). Dann wählen Sie die Datei counter.ijm (siehe Ergänzende Informationen) und klicken Sie auf Öffnen.
      NOTE: Das Makro wurde speziell für die Messung des Bereichs geschrieben. Das Makro sollte bei jedem Öffnen der Software installiert werden.
3. Flächenanalyse
   1. Analysieren Sie Bilder, wenn alle Plugins installiert sind. Klicken Sie auf Plugins und scrollen Sie nach unten zu ilastik (Abbildung 3C). Wählen Sie Import HDF5, wählen Sie die Datei mit. h5-Format, klicken Sie auf Öffnen und Laden und wenden Sie LUT an ( Abbildung3C, D).
   2. Drücken Sie den Knopf von der Tastatur (Makro) und der Bereich wird im Summary-Fenster als Gesamtbereich (Abbildung3 E) angezeigt.

Vier Tage nach der Absagekät-Zell-Zell-Saat-Saeding UT-SCC-42B (metastasierende Kehlkopfkörper-Zelllinie) wurde die Matrix (HMDM/Fibrin, MSDM oder Kollagen) auf den gebildeten Spheroiden (Tag 0) hinzugefügt und die Invasion drei Tage lang überwacht. Die Bilder hier wurden täglich mit einem umgekehrten Mikroskop gewonnen (Abbildung 4).

Nach dem Einbetten begannen die Zellen in der HMDM/fibrin-Matrix nach einem Tag schnell einzudringen und dehnten sich in die Matrixaus (Abbildung4A). Zellen im MSDM sind nicht in die umgebende Matrix eingedrungen, sondern bildeten eine asymmetrische Struktur (Abbildung4B). Auf der anderen Seite drangen Zellen im Kollagen leicht ein, aber aufgrund der Matrixschrumpfungwardie Analyse schwierig (Abbildung 4C). In einigen Kollagenbrunnen verschwanden die Spheroide sogar nach drei Tagen (Abbildung 4C).

Abbildung 5 zeigt die Quantifizierung der Zellinvasion in HMDM/Fibrin der primären Kehlkopfnummer UT-SCC-42A und der dazugehörigen metastasierenden Zelllinie UT-SCC-42B. Das Video (Movie 1), das mit einem Live-Zell-Analysesystem des HMDM/Fibrin-Spheroids aufgenommen wurde, zeigt die Bewegung der SCC-Zellen innerhalb der Matrix, in der sie Stränge bilden, gefolgt von den anderen Zellen.

Bild 1 : Bildsegmentierung. Ausgewählte Schritte der Bildsegmentierung mit ilastik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 2 : Skaleneinstellung. Ausgewählte Schritte der Skalenseinstellung mit Fidschi ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 3 : Invasionsanalyse mit ImageJ. Ausgewählte Schritte der Bildanalyse mit Fidschi ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 4 : UT-SCC-42B Zell-Invasion in drei verschiedenen Matrizen. Repräsentative Bilder der SCC-Zellinvasion in den 3D-Spheroiden. Drei Tage lang folgte die Invasion und täglich wurden Bilder mit einem umgekehrten Mikroskop aufgenommen. (A) HMDM/fibrin, (B) MSDM, (C) collagen. Die letzte Spalte stellt eine Klärung der Invasion des Tages 3 dar. Skalierbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 5 : Quantifizierung der SCC-Zellinvasion in HMDM/Fibrin. Die primäre Kehlkopfversion UT-SCC-42A und die entsprechende metastasierende Kehlkopflinieninär-Invasion UT-SCC-42B SCC wurden mit Hilfe von ilastik und Fiji ImageJ Software analysiert. Die Ergebnisse stellen eine mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils in dreifacher Qualität sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Video 1: Die SCC-Zellbewegung innerhalb der HMDM/Fibrin für drei Tage. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download.)

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.