Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay
7. Mai 2019
Die Mikroumgebung von Tumoren ist ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und-einmarsches. Um die Fortschreibung des Karzinoms zu imitieren, wird eine biologisch relevante menschliche Matrix benötigt. Dieses Protokoll führt eine Verbesserung für den in vitro dreidimensionalen spheroizider Invasionsuntergang ein, indem es eine menschliche, auf Gelotem basierende Matrix verwendet. Das Protokoll führt auch eine computergestützte Zellinvasion ein.
Wie wir bereits wissen, ist die Tumormikroumgebung ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und der Invasion. Um die Karzinomprogression nachzuahmen, benötigen wir eine biologisch relevante menschliche Tumormatrix. Dies ist die einzige menschliche Tumormatrix basierend in vitro Invasion Assay.
Im Vergleich zum klassischen Sphäroid-Assay ist diese Methode nicht so temperaturempfindlich und erfordert keine Sphäroidübertragung. Diese Technik eignet sich für vom Patienten abgeleitete festgefahrene Krebsproben wie Kopf- und Nackenkarzinom und kann sich auf personalisierte Medizin einschließlich Chemostrahlungstherapien ausdehnen. Diese menschliche tumorbasierte Matrix wurde bereits für mehrere Anwendungen verwendet, einschließlich Hochdurchsatz-Medikamententests, Live-Zell-Analyse, Wundheilung und Transfer-Assays.
Der technisch sensibelste Schritt ist die Handhabung des Fibrinogens durch die Methode, so dass Sie diesen Schritt vielleicht zuerst mit leeren Brunnen üben möchten. Es ist wichtig, den richtigen Umgang mit der Matrix zu zeigen, und es ist einfach zu analysieren, indem die Methode visuell angezeigt wird. Für die multizelluläre Tumorsphäroid-Generierung, geben Sie eine mal 10 bis zu den dritten Zellen aus der Zelllinie von Interesse in 50 Mikroliter des kompletten Mediums in jeden Brunnen einer 96-well ultra-niedrigen Befestigung rund-Bodenplatte.
Legen Sie die Platte dann vier Tage lang in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die Tumorsphäroidbildung mit einem invertierten Mikroskop visuell bestätigen. Um einen dreidimensionalen Sphäroid-Invasionstest einzurichten, tauen Sie die von Humanmyom abgeleitete Matrix auf Eis auf und tauen Sie fibrinogene Stammlösung in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Wenn die Reagenzien erwärmt haben, mischen Sie die entsprechenden Volumina der vollständigen mittleren, vom Myom abgeleiteten Matrix, Thrombin, Aprotinin und Fibrinogen, und fügen Sie das Fibrinogen kurz vor der Abgabe der Matrixmischung in die Zellen hinzu.
Fügen Sie sofort 50 Mikroliter des resultierenden Gels in jeden Brunnen der Sphäroid-Kulturplatte, die Richtung der Spitze in Richtung der Innenwand jedes Brunnens und Pipettierverlangsamung, ohne das Sphäroid aus der Mitte des Brunnens zu bewegen. Da das Fibrinogen nach wenigen Minuten zu gelieren beginnt, erfordert es eine robuste, aber präzise Umgekehrte Pipettierung und die Behandlung von nur wenigen Brunnen gleichzeitig. Geben Sie die Platte für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator zurück, damit sich das vom Humanmyom abgeleitete Matrix-Fibrin-Gel verfestigt, bevor es sanft 100 Mikroliter komplettes Medium an die Oberseite jedes Gels hinzufügt.
Dann bilde die Sphäroid-Invasion täglich. Öffnen Sie für die Bildsegmentierung mit ilastik die Open-Source-Software für die Bildklassifizierung und -segmentierung, und wählen Sie den Workflow Pixelklassifizierung aus. Speichern Sie das ilastik-Projekt auf dem Computer.
Die Pixel werden basierend auf Denkinformationen des Benutzers klassifiziert. Klicken Sie auf Daten eingeben und Neu hinzufügen, um Bilder für die Analyse auszuwählen. Klicken Sie zur Feature-Auswahl auf Feature-Auswahl und Features auswählen.
Klicken Sie auf die entsprechenden Felder, um die gewünschten Features auszuwählen. Die ausgewählten Felder werden grün. Klicken Sie für eine Schulung auf Schulung.
Im Abschnitt Schulung sollten zwei Etiketten wie Label 1 und Label 2 angezeigt werden. Markieren Sie den Hintergrund mit einer der Beschriftungen, und markieren Sie die Zellen mit der anderen Beschriftung. Wenn alle Zellen und Hintergründe im ersten Bild beschriftet wurden, wählen Sie das nächste Bild aus der aktuellen Ansicht aus, um die Zellen und den Hintergrund weiterhin zu markieren, bis 10 % der Bilder markiert wurden.
Wählen Sie dann Live Update aus, um alle Bilder zu analysieren. Wenn die Schulung abgeschlossen ist und ilastik alle Bilder analysiert hat, klicken Sie auf Vorhersageexport und wählen Sie Einfache Segmentierung aus Quelle aus. Wählen Sie dann das gewünschte Ausgabedateiformat unter Bildeinstellungen exportieren aus und klicken Sie auf Alle exportieren, um die Ergebnisse der Beschriftung zu exportieren.
Die Dateien werden in denselben Ordner mit den Originalbildern exportiert. Öffnen Sie für die Flächenanalyse zunächst das Originalbild mit einer Maßstabsleiste in Fidschi ImageJ, wobei Darauf zu achten ist, dass das Bild die gleiche Größe und Dimension wie die analysierten Bilder hat. Verwenden Sie das Linienauswahlwerkzeug, um eine Linie mit einer bekannten Länge zu zeichnen, und klicken Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen.
Legen Sie dann den bekannten Abstand im Feld "Bekannte Entfernung" fest. Legen Sie die richtige Einheit fest, und klicken Sie auf Global. Um das ilastik-Plugin zu installieren, klicken Sie im ImageJ-Updater-Fenster auf Hilfe und Aktualisieren und auf Update-Sites verwalten.
Klicken Sie neben ilastik, Schließen und Ändern anwenden. Nach einigen Minuten wird ein Informationsfenster angezeigt, in dem es heißt, dass es erfolgreich aktualisiert wurde. Klicken Sie auf OK, und starten Sie ImageJ neu.
Klicken Sie als Nächstes auf Plugins, Makros und Installieren, und wählen Sie den Zähler aus. ijm-Datei. Klicken Sie dann auf Öffnen.
Um die Flächenanalyse abzuschließen, klicken Sie auf Plugins und scrollen Sie, um ilastik auszuwählen. Wählen Sie HDF5 importieren und wählen Sie die Datei im h5-Format aus. Klicken Sie auf Öffnen und Laden und Anwenden der Nachsuchtabelle.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche A auf der Tastatur, und der Bereich wird im Zusammenfassungsfenster als Gesamtfläche angezeigt. In diesem repräsentativen Experiment, vier Tage nach der metastasierenden Laryngeal Plattenepithelkarzinom-Zelllinienaussaat, wurde Matrix auf die gebildeten Sphäroide hinzugefügt, wie gezeigt und die Invasion wurde täglich auf einem invertierten Mikroskop überwacht. Einmal eingebettet, begannen Zellen in der vom menschlichen Myom abgeleiteten Fibrinmatrix nach einem Tag schnell einzudringen und erstreckten sich in den nächsten zwei Tagen in die Matrix.
Zellen in der maussarkom-abgeleiteten Matrix dringen nicht in die umgebende Matrix ein, sondern bilden eine asymmetrische Struktur. Zellen im Kollagen drangen leicht ein, aber aufgrund der Matrixschrumpfung wurde die Analyse schwierig. In einigen Brunnen verschwanden die Sphäroide sogar nach drei Tagen.
Hier wird die Quantifizierung der Invasion einer primären und einer metastasierenden Laryngeal-Plattenkarm-Karzinom-Zelle in der vom humanen Myom abgeleiteten Fibrinmatrix dargestellt. Die Live-Zell-Analyse der vom menschlichen Myom abgeleiteten Fibrin-Matrix-Sphäroid-Invasion zeigt Zellbewegungen in Strängen in der gesamten Matrix, gefolgt von anderen Zellen im Laufe der Zeit. Denken Sie daran, darauf zu achten, das Sphäroid nicht von der Mittleren Position zu bewegen, wenn Sie die Matrix zu den Brunnen hinzufügen.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Bestrahlung und bestimmte Moleküle wie Krebsmedikamente Invasion beeinflussen. Die Zellen können für nachfolgende Studien fixiert und gebeizt werden. Im klassischen Maussarkommodell vermehren sich die Zellen hauptsächlich und der Invasionsaspekt ist minimal.
Diese menschliche tumorbasierte Matrix induziert Invasion, so dass die Hemmung Studien effizienter.
Übersicht
Diese Studie präsentiert einen neuartigen in vitro dreidimensionalen Sphäroid-Invasion-Assay unter Verwendung einer humanen Leiomyom-abgeleiteten Matrix, der die Nachahmung der Karzinomprogression verbessert. Die Methode ermöglicht eine verbesserte Analyse der Tumorzellinvasion und ist auf patientenabgeleitete solide Krebsproben anwendbar.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Krebsbiologie
- Tumor-Mikroumgebung
- In-vitro-Assays
Hintergrund
- Die Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle beim Krebswachstum und der Invasion.
- Eine biologisch relevante humane Tumormatrix ist für eine genaue Modellierung der Karzinomprogression unerlässlich.
- Diese Methode ist weniger temperaturempfindlich im Vergleich zu klassischen Sphäroid-Assays.
- Sie eignet sich für Anwendungen in der personalisierten Medizin, einschließlich Chemoradiationstherapien.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines humanen Tumormatrix-basierten Assays zum Studium der Krebszellinvasion.
- Bereitstellung eines Protokolls, das technische Herausforderungen im Zusammenhang mit herkömmlichen Methoden minimiert.
- Ermöglichung von Hochdurchsatz-Arzneimitteltests und Live-Zell-Analysen.
Verwendete Methoden
- Erzeugung multizellulärer Tumorsphäroide in Ultra-Low-Attachment-Platten.
- Vorbereitung einer humanen Myom-abgeleiteten Matrix und Fibrinogen für den Invasionsassay.
- Tägliche Bildgebung der Sphäroidinvasion mittels eines invertierten Mikroskops.
- Bildanalyse mit ilastik zur Segmentierung und Flächenquantifizierung.
Hauptergebnisse
- Zellen in der humanen Myom-abgeleiteten Matrix invadierten schnell und demonstrierten eine effektive Modellierung des Tumorverhaltens.
- Der Vergleich mit anderen Matrizen zeigte unterschiedliche Invasionsmuster und unterstreicht die Vorteile der humanen Matrix.
- Die Live-Zell-Analyse offenbarte dynamische Zellbewegungen und Invasion im Laufe der Zeit.
- Die Methode kann angepasst werden, um die Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Tumorinvasion zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Die humane Myom-abgeleitete Matrix bietet eine robuste Plattform für das Studium der Krebszellinvasion.
- Dieser Assay kann die Forschung zu therapeutischen Interventionen bei Krebs erleichtern.
- Richtiges Handhaben und Methodik sind entscheidend für die erfolgreiche Implementierung des Assays.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in preclinical cancer research by providing a human tumor-derived matrix that better recapitulates the in vivo microenvironment compared to animal-derived alternatives. It enables more predictive modeling of carcinoma invasion, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The platform is suitable for screening applications and translational continuity, particularly for head and neck carcinoma and patient-derived samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling functional validation of targets in a human-relevant extracellular matrix context.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct observation of invasion phenotypes in a biologically pertinent system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate invasion in a model predictive of human tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D system for quantitative assessment of compound effects on cell invasion.
- Operational Value: Enables high-throughput drug testing with minimal technical variability due to reduced temperature sensitivity and no spheroid transfer requirement.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, supporting assay miniaturization and multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses human leiomyoma-derived matrix to bridge discovery findings with preclinical validation in a disease-relevant system.
- Biomarker Alignment: Facilitates live-cell analysis of invasion dynamics, enabling correlation with molecular signatures or treatment responses.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying invasion inhibition, a key phenotypic endpoint in metastasis prevention.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for metastasis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of invasion drivers and pathway modifiers in a human tumor microenvironment context.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts suitable for automated analysis and compound profiling.
- Analytics: Generates invasion area measurements via ilastik and ImageJ, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a key step in metastasis using a human-derived matrix.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform applicable across solid cancer types and therapeutic modalities, including chemoradiation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing reliance on non-human matrices that poorly mimic human tumor stroma.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through a defined matrix preparation protocol and imaging workflow.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by improving early prediction of clinical translatability, reducing late-stage failure due to poor metastasis modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on invasion inhibition potency in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, matrix handling, and sterile technique for fibrin gel preparation.
- Dependent on access to inverted microscopes, ilastik, and Fiji ImageJ for imaging and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid formation and matrix dispensing to avoid positional artifacts.
- Adaptation to other model systems requires validation of matrix compatibility and invasion kinetics.
- Practical limitation: Fibrinogen initiates rapid gelation, demanding precise, timed pipetting to maintain spheroid integrity.
