Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Summary

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Abstract

Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.

Introduction

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse¹. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ei....

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab.

1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie

1. Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels.
2. Palpate die vastus lateralis, indem der Teilnehmer ihre Quadrizeps-Muskel straffen und den Bauch des Muskels zu finden, etwa 1/3 des Weges von der Patella zur Hüfte, und nur ventrolateral zum Obe....

Results

Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberflächenma.......

Discussion

Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind¹⁰. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwischen den.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % Trypsin, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin zur Entfernung von anhaftenden hMPCs aus Zellkulturgefäßen
10 cm Zellkulturplatte	VWR	664160	Platten zur Kultivierung von hMPCs
15 mL Falcon-Röhrchen	Falcon	352196	konische Röhrchen zur Verwendung in den hMPC-Isolations- und Kultivierungsprotokollen
24-Well-Zellkulturplatte	Grenier Bio-One	662 160	Platten für die Kultivierung von hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability Staining zur Identifizierung lebender Zellen während der FACS-Sortierung
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD29, Klon: TS2/16	BioLegend	303016	Konjugierter Antikörper für FACS
Schwarze 96-Well-Zellkulturplatte	Grenier Bio-One	655079	96-Well-Zellkulturplatte, ideal für die Fluoreszenzbildgebung mit dem Celigo
S Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging Zytometer zur Verfolgung von hMPC-Kulturen
Zellsieb	VWR	352350	Zellsieb zur Beseitigung großer Ablagerungen während der Muskelbiopsieverarbeitung
Kollagen Typ I (Ratte Corning		354236	Kollagen zum Beschichten von Zellkulturplatten
Kollagenase D	Roche	11 088 882 001	Wird für den Abbau von Kollagen und anderem Bindegewebe im Skelettmuskelbiopsiegewebe
verwendet Dimethylsulfoxid	VWR	WN182	Wird für die Kryokonservierung von hMPCs
verwendet Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	Eine Protease zur enzymatischen Verdauung von Skelettmuskelbiopsiegewebe
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose Pulver	Gibco	31600-034	Low Glucose DMEM für die Muskelbiopsie-Verarbeitung
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS für die Muskelbiopsie-Verarbeitung
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat	J.T. Baker	4040-01	Erforderlich für FACS-Puffer
Fötales Rinderserum	VWR	89510-186	Fötales Rinderserum für hMPC-Wachstumsmedien
Ham's F12	Gibco	21700-026	Basismedium für hMPCs
Hitzeinaktiviertes Pferdeserum	Gibco	26-050-070	Pferdeserum zur Herstellung von hMPC-Differenzierungsmedien
Hämozytometer	iNCyto	DHC-N0105	Wird zur Zellzählung
verwendet Winterschlaf A	Gibco	A1247501	Medien zur Konservierung der Skelettmuskelbiopsie
Gewebe Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat	Life Technologies	H21492	DNA-Farbstoff zur Identifizierung aller Zellen mit dem Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Wird für das kontrollierte Einfrieren von hMPCs
verwendet Moxi-Puffer	Orflo	MXA006	Puffer für automatisierte Zellzähler
Moxi-Kassetten	Orflo	MXC002	Cassesttes für automatisierte Zellzähler
Moxi z Mini Automatisierter Zellzähler	Orflo		Automatisierter Zellzähler
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Kommerziell erhältlicher Zellgefrierbehälter mit kontrollierter Rate
Normales Ziegenserum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Ziegenserum für FACS-Puffer
PE-Cy7 Maus Anti-humanes CD56 , Klon: B159	BD Pharmingen	557747	Konjugierter Antikörper für FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Lösung	Corning	30-002-CI	Antibiotika, die dem Nährmedium zugesetzt
Propidiumiodid	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA-Färbung zur Identifizierung toter Zellen unter Verwendung des
rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors	Promega	G5071	Supplement in hMPC-Wachstumsmedien zur Verhinderung der spontanen Differenzierung
Einfriermedium für Wiederherstellungszellkulturen	Gibco	12648-010	Medien zur Kryoperfassung von Muskelbiopsie-Schlämmen
Natriumbicarbonat	Fisher Scientific	S233-3	hinzugefügt zu Ham's F12
sterile 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden	VWR	60818-565	Röhrchen für FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Kompensationsperlen für die Kalibrierung der FACS-Einstellungen