Methodenartikel

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

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DOI:

10.3791/59582

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8. Juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein kritisches Hinterlimb Ischämie-Experimentalmodell vorgestellt, gefolgt von einer Batterie funktioneller, histologischer und molekularer Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit angiogener Therapien.

Zusammenfassung

Kritische GliedmaßenIschämie (CLI) ist eine ernste Erkrankung, die ein hohes Risiko für eine Amputation der unteren Gliedmaßen mit sich bringt. Obwohl die Revaskularisation die Goldstandardtherapie ist, ist eine beträchtliche Anzahl von CLI-Patienten weder für chirurgische noch für endovaskuläre Revaskularisation geeignet. Angiogene Therapien entwickeln sich als Option für diese Patienten, werden aber derzeit noch untersucht. Vor der Anwendung beim Menschen müssen diese Therapien in Tiermodellen getestet werden, und ihre Mechanismen müssen klar verstanden werden. Ein Tiermodell der Hinterlimbischämie (HLI) wurde durch die Ligation und Exzision der distalen äußeren Ilias und Femoralarterien und Venen bei Mäusen entwickelt. Ein umfassendes Testgremium wurde zusammengestellt, um die Auswirkungen von Ischämie und vermeintlichen angiogenen Therapien auf funktioneller, histologischer und molekularer Ebene zu bewerten. Laser Doppler wurde für die Durchflussmessung und funktionelle Beurteilung der Perfusion verwendet. Die Gewebereaktion wurde durch die Analyse der Kapillardichte nach der Färbung mit dem Anti-CD31-Antikörper an histologischen Abschnitten des Magen-Darm-Muskels und durch Messung der Konlateralgefäßdichte nach der Diaphonisierung bewertet. Die Expression angiogener Gene wurde durch RT-PCR quantifiziert, das auf ausgewählte angiogene Faktoren ausschließlich in Endothelzellen (ECs) nach Lasererfassungsmikrodissektion von Mäusen gastrocnemius Muskeln abzielte. Diese Methoden waren empfindlich bei der Identifizierung von Unterschieden zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Gliedmaßen und zwischen behandelten und nicht behandelten Gliedmaßen. Dieses Protokoll bietet ein reproduzierbares CLI-Modell und ein Framework für die Prüfung angiogener Therapien.

Einleitung

Periphere arterielle Erkrankungen (PAD) betreffen vorwiegend die unteren Gliedmaßen. PAD wird durch Arteriosklerose verursacht, eine Arterienverstopfung, die schwere Einschränkung des Blutflusses in den unteren Gliedmaßen verursachen kann1. Intermittierende Claudication ist die erste Manifestation von PAD und bezieht sich auf Muskelschmerzen beim Gehen. CLI ist das schwerste Stadium der PAD, diagnostiziert bei Patienten, die ischämische Ruheschmerzen, Geschwüre oder Gangränzeigen 2. Patienten mit CLI haben ein hohes Amputationsrisiko, insbesondere wenn sie unbehandelt sind3. Die Revaskularisation der unteren Gliedmaßen (entweder durch offene Operation oder ein endovaskuläres Verfahren) ist derzeit der einzige Weg, um Gliedmaßenzubergung zu erreichen. Jedoch, etwa 30% der CLI-Patienten sind nicht für diese Verfahren geeignet, aus Gründen, die die Lage der Läsionen, das Muster der arteriellen Okklusion und umfangreiche Komorbidität4,5. Daher sind neue Therapien für diese ansonsten unheilbaren Patienten erforderlich, wobei die Förderung der Angiogenese die Strategie ist, die intensiver untersucht wird.

Vor tests am Menschen müssen die Wirksamkeit und Sicherheit neuer Therapien in vivo in Tiermodellen berücksichtigt werden. Mehrere Modelle wurden für die Untersuchung von CLI entwickelt, vor allem durch induzierende HinterlimbIschämie (HLI) bei Mäusen6,7,8,9,10. Diese Modelle unterscheiden sich jedoch in mehreren Aspekten, einschließlich der Art der Arterien, die ligiert und/oder ausgeschnitten sind und ob die Venen und Nerven umgeben sowie seziert werden6,7,8, 9,10. Zusammengenommen werden diese Aspekte die Schwere der Ischämie-Reperfusionsverletzung bei jedem Tier beeinflussen, was den Vergleich der Ergebnisse erschwert. Daher ist es wichtig, ein wirksames Protokoll zu entwickeln, in dem das Verfahren zur Induzieren von Ischämie und die Bewertung verschiedener Ziele standardisiert werden sollten, um zu beurteilen, ob eine bestimmte angiogene Therapie wirksam sein wird. Ein experimentelles Protokoll, das alle diese Aspekte abdeckt, würde ein umfassendes Verständnis der Mechanismen bieten, mit denen angiogene Therapien ihre Wirkung entfalten, und ein Maß für ihre Wirksamkeit bei jedem ihrer Ergebnisse. Zwei verschiedene Werke, die kürzlich von unserem Team veröffentlicht wurden, sind ein gutes Beispiel11,12, in dem verschiedene Ansätze zur Induzieren therapeutischen Angiogenese mit dem gleichen Protokoll bewertet wurden, das in diesem Abschnitt ausführlicher beschrieben wird. protokoll.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein reproduzierbares experimentelles Modell zu beschreiben, das die Auswirkungen von CLI imitieren und die experimentelle Grundlage für eine umfassende Bewertung der funktionellen, histologischen und molekularen Wirkungen vermeintlicher angiogener Agents.

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Protokoll

Alle Tierverfahren stehen im Einklang mit der Richtlinie 2010/63/EU und wurden von der Institutionellen Tierschutzstelle genehmigt und von dGAV, der zuständigen portugiesischen Tierschutzbehörde, zugelassen (Lizenznummer 023861/2013).

VORSICHT: Mehrere der in den Protokollen verwendeten Chemikalien sind giftig und schädlich. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel, Hose in voller Länge und schuhe mit geschlossenem Zehen)

1. Das murine Modell der hinteren Limbischämie

HINWEIS: Alle Experimente werden an 22 Wochen alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durchgeführt.

  1. Vorbereitung von Lösungen
    1. Vorbereitung der Anästhetikumlösung
      Hinweis: Diese Anästhesie-Kombination (Medetomidin und Ketamin) bietet bis zu 30 min Immobilisierung und ein chirurgisches Fenster von 15 min. Der Effekt kann durch die Verabreichung von Atipamezol rückgängig gegeben werden.
      1. Mit einer sauberen 1cc Spritze 1 ml Medetomidin (1 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
      2. Mit einer sauberen 1-c-Spritze 0,75 ml Ketamin (75 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und in ein 15 ml Falkenrohr mit dem Medetomidin geben.
      3. Fügen Sie 8,25 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Anästhetikum zu erhalten.
      4. Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
      5. Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
    2. Vorbereitung der antisedativen Lösung
      1. Mit einer sauberen 1-c-Spritze 1 ml Atipamezol (5 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
      2. Fügen Sie 9 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Reversionslösung zu erhalten.
      3. Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
      4. Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
    3. Vorbereitung der postoperativen Analgesielösung
      1. Mit einer sauberen 1-c-Spritze 0,5 ml Buprenorphin (100 l/15-30 g Körpergewicht) abziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
      2. Fügen Sie 9,5 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Analgesielösung zu erhalten.
      3. Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
      4. Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
  2. Chirurgische Induktion von Hinterlimbischämie
    1. Chirurgische Werkzeuge, die für diesen Eingriff benötigt werden: spitze Zange, Federschere, ophthalmologischer Nadelhalter, chirurgische Schere und nadelhalter. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge in einem Autoklaven vor der Verwendung. Verwenden Sie Wattestäbchen für die Zerlegung von subkutanem Fett.
    2. Laden Sie die Spritze mit der Anästhesielösung, bevor Sie die Maus halten.
    3. Halten Sie das Tier zurück, indem Sie Kraft hinter den Ohren auf das Gitter des Käfigs anwenden und so viel Haut wie möglich halten, um die Maus unbeweglich zu halten.
    4. Halten Sie das Tier mit gesenktem Kopf geneigt und führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Anästhesielösung durch, wobei die Spritze mit dem Körper der Maus in einem 45°-Winkel gehalten wird.
    5. Prüfen Sie, ob keine Pedalentzugsreflexe anstehen, um die Tiefe der Anästhesie zu bewerten.
    6. Entfernen Sie das Haar von der rechten Hinterbein mit einem elektrischen Rasierer. Verwenden Sie ein Chlorhexidin Desinfektionsmittel Seifenpeeling für die Hautvorbereitung. Verwenden Sie ein sauberes Papiertuch, um die Suds zu entfernen. Tragen Sie ein chirurgisches Chlorhexidin-Peeling auf und schützen Sie den Hautbereich mit einem sterilen Vorhang, bevor Sie die Mäuse in die chirurgische sterile Suite transportieren.
    7. Legen Sie das Tier in dorsalen Dekubitus und halten Sie es mit den vier Gliedmaßen auseinander gestreut und mit Klebeband gesichert.
      VORSICHT: Führen Sie das Verfahren auf einem beheizten Pad durch, um die Körpertemperatur des Tieres stabil zu halten; der chirurgische Eingriff wird mit einem Seziermikroskop bei 10- oder 20-facher Vergrößerung durchgeführt.
    8. Tragen Sie eine antiseptische Chlorhexidinlösung mit steriler Gaze auf, um die Hautzubereitung fertigzustellen. Mit einer Nummer 11 chirurgische SkalpellKlinge führen Sie einen 1-cm-Hautschnitt über dem Oberschenkel des rechten Hinterbeins.
    9. Blunt sezieren subkutanes Fett, das das neurovaskuläre Bündel freisetzt. Mit der spitzen Zange, der Federschere und dem ophthalmologischen Nadelhalter öffnen Sie die membranöse ilio-femorale Hülle, um die distalen äußeren Ilias- und Femoralgefäße freizulegen.
    10. Sezieren und trennen die Gefäße (Arterie und Vene) vom Nerv. Mit einer 7,0 nicht resorbierbaren Polypropylen-Naht ligate die distale äußere Iliac arterie und Vene und die distale femorale Arterie und Vene.
    11. Transect das Segment der ilio-femoralen Arterie und Venen zwischen den distalen und proximalen Knoten mit der Federschere.
    12. Schließen Sie den Schnitt mit einer resorbierbaren Naht (z.B. 5.0 Vicryl Naht).
    13. Laden Sie die Spritze mit der antisedativen Lösung und verwenden Sie das gleiche Verfahren gemäß 1.2.3 und 1.2.4, um eine intraperitoneale Injektion der antisedativen Lösung durchzuführen.
  3. Postoperative Überwachung
    HINWEIS: Tiere werden alle 15-20 min sorgfältig beobachtet, um sicherzustellen, dass sich alle Tiere gut vom Antisedativ erholen; anästhesierte Tiere werden nie unbeaufsichtigt gelassen.
    1. Beurteilung der Erholung von der Anästhesie: 1) Überwachung der Rate und Tiefe der Atmung; 2) Beurteilung der Tierreflexe (Pedal- und Augenposition)
    2. Führen Sie alle 8-12 h eine subkutane Injektion der postoperativen Analgesie durch.
    3. Überwachen Sie die Tiere täglich nach der Operation und zeichnen Sie eine kurze Beschreibung des Gesundheitszustands des Tieres und des Aussehens der Operationsstelle auf, stellen Sie sicher, dass alle Nähte geschlossen sind.
    4. Den Schnitt wieder veransanallen, wenn eine Dehiszenz auftritt. Wenn dies nicht gelingt, tragen Sie einen Hautbarrierefilm auf den Schnitt auf, um vor Urin, Fäkalienausscheidungen, Reibung und Scherung der Haut zu schützen und den Heilungsprozess zu unterstützen.

2. Beurteilung der angiogenen Wirkung

HINWEIS: Nach der Ischämie-Induktion das therapeutische Mittel in der Studie anwenden und die folgenden Verfahren erreichen. Die zu anderen Zeitpunkten durchgeführten Schritte werden im entsprechenden Abschnitt beschrieben.

  1. Laser Doppler Perfusionsbildgebung
    1. Entfernen Sie das Haar von beiden Hinterbeinen einen Tag vor der Analyse mit einem elektrischen Rasierer gefolgt von Enthaarungscreme.
    2. Anästhesisieren Sie die Mäuse mit der Anästhesielösung.
    3. Legen Sie das Tier für 5 min auf ein 37 °C Heizkissen, um sicherzustellen, dass sich die Temperatur während des Vorgangs nicht ändert.
    4. Legen Sie das Tier in die Supine-Position mit gesicherten Beinen in einer verlängerten Position. Messen Sie den Abstand zwischen rechten und linken Beinen und Füßen für jedes Tier, da die Positionierung des Tieres ähnlich sein sollte, wenn das Verfahren wiederholt werden muss, um Veränderungen der Hinterkieferperfusion im Laufe der Zeit zu folgen.
    5. Beginnen Sie mit der Datenerfassung mit einem Laser-Doppler-Perfusionsbildner.
    6. Nach Abschluss der Übernahme die Anästhesie mit der antisedativen Lösung wiederherstellen.
    7. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und zeichnen Sie die Interessenregion (ROI) um das ischämische Hinterglied und einen vergleichbaren ROI um das nicht-ischämische Hinterglied.
    8. Beobachten Sie die Flusswerte und bestimmen Sie die Perfusion als Verhältnis der Perfusion in der ischämischen Gliedmaße zu der in der nicht-ischämischen Extremität. Veränderungen des Perfusionsverhältnisses werden im Laufe der Zeit gemessen.
  2. Immunhistochemie und Kapillardichteanalyse
    1. Nach der Anästhesisierung, opfern Sie die Mäuse durch Zervix-Dislokation.
    2. Um die Gastrocnemius-Muskeln beider Beine zu ernten, zuerst, entfernen Sie die Haut von beiden Hinterbeinen.
    3. Identifizieren Sie die Achillessehne und trennen Sie die Sehne vom Knochen mit einem 11-Blatt-Skalpell.
    4. Halten Sie die Achillessehne und trennen Sie den Muskel von der Tibia und Fibel bis zum Kniegelenk mit einer Federschere.
    5. Trennen Sie den Bizeps femoris vom Magen-Darm-Muskel.
    6. Verwenden Sie eine Federschere, um die Einfügungen der Gastrocnemius-Muskeln auf Kniegelenksebene zu schneiden.
    7. Legen Sie die geernteten Gastrocnemius-Muskeln mit Hilfe von 10% Tragacanth in querer Ausrichtung auf eine kleine Korkscheibe.
    8. Die Proben in flüssigstickstoffgekühltem Isopentan einfrieren und bei -80 °C bis zum Schnitt lagern.
    9. Schneiden Sie 7 m Abschnitte der Muskelproben auf einem Kryostat und montieren Sie auf Glasrutschen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    10. Befestigen Sie die Glasgletten in einer Flasche mit gekühltem reinem Aceton (ca. 50 ml) für 10 min bei -20 °C.
    11. Wasserstoffperoxidase 0,3% in Methanol (50 ml) verdünnt für 30 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
    12. Zweimal in phosphatgepufferter Saline (PBS) (50 ml) für insgesamt 10 min waschen.
    13. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift um die Abschnitte.
      HINWEIS: Die Verwendung eines hydrophoben Pens ermöglicht es, die Menge der während des Protokolls verbrauchten Lösungen zu reduzieren. Für alle Inkubationen verwenden Sie 100 l aller Lösungen pro Abschnitt.
    14. Tragen Sie eine Blockierlösung von 5% Kaninchenserum in PBS für 30 min bei Raumtemperatur auf.
    15. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei Raumtemperatur mit monoklonenantiktem Anti-CD31-Rattenantikörper, der bei 1:500 in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS verdünnt wird.
    16. Waschen Sie dreimal in PBS für insgesamt 30 min.
    17. Fügen Sie einen sekundären biotinylierten Kaninchen Anti-Ratten-IgG-Antikörper bei 1:200 in 1% BSA in PBS und 5% Kaninchenserum für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
    18. In PBS wie bisher waschen und beschrifteten avidinkonjugierten Peroxidase-Komplex für 30 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
    19. Spülen Sie 3 mal in PBS für 5 min und fügen Sie Diaminobenzidin (DAB) Peroxidase Substrat Kit für weitere 5 min.
    20. Die Abschnitte mit Hämatoxylin für 10 s vor der Montage verfärben.
    21. Messen Sie die Kapillardichten mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop (d. h. Anzahl der Kapillaren pro Anzahl von Myozyten) in 2 verschiedenen Abschnitten von 4 verschiedenen anatomischen Bereichen in jeder Probe.
  3. Kontrastmittelperfusion
    1. Anästhesisieren Sie die Mäuse mit der Anästhesielösung.
    2. Führen Sie eine mediane Laparotomie mit einer Skalpellklinge der Nummer 15 durch.
    3. Die Bauchaorta und die kaudale Vena cava aussetzen, nachdem sie seitlich den kleinen Darm zurückgezogen und eine Federschere verwendet haben.
    4. Setzen Sie einen 26-Spur-Katheter kranial in die Bauchaorta und einen anderen in die kaudale Vena cava in die gleiche Richtung ein.
    5. Sichere Katheter an Ort und Stelle mit einer 5/0 Seidennaht, um eine Aufenthaltsnaht durchzuführen.
    6. Waschen Sie das Gefäßsystem mit einer 37 °C-Salinelösung mit Heparin (500 Einheiten/100 ml), die mit einer 10 ml Spritze in die Bauchaorta geschoben wird. Fahren Sie mit sanfter Perfusion fort, bis eine klare Lösung aus dem Katheter im inneren der kaudalen Vena cava kommt.
      HINWEIS: Normalerweise sind 30 bis 40 ml einer heparinisierten Salinelösung erforderlich, um das Gefäßsystem einer erwachsenen Ratte zu spülen.
    7. Eine Mischung aus Adenosin (1 mg/L) und Papaverin (4 mg/L) 2 min.
    8. Injizieren Sie in den Aortenkatheter 10 ml einer Mischung aus 50% Bariumsulfat und 5% Gelatine.
      HINWEIS: Die Lösung muss bei 60 °C gehalten werden, um eine Verdickung zu vermeiden.
    9. Lassen Sie die Mäuse bei - 4 °C für mindestens 4 h, damit der Gefäßguss verfestigt werden kann.
    10. Entfernen Sie die Haut aus dem Unterkörper jeder Maus.
  4. Diaphonisierung - Spalteholz-Technik
    1. Fixieren Sie die Mäuse durch Eintauchen in eine 10% Formaldehydlösung für mindestens 72 h.
    2. Bleichen Sie die Mäuse durch Eintauchen in eine 30% Wasserstoffperoxidlösung für 24 h.
    3. Dehydrieren Sie die Mäuse mit der Gefriersubstitutionstechnik. Diese Methode besteht darin, die Mäuse aufeinanderfolgende Passagen (im Durchschnitt vier) von reinem Aceton bei - 20 °C für jeweils 24 h zu unterwerfen.
    4. Klären Sie die Mäuse, indem Sie sie in eine Lösung eintauchen, die ein Gemisch aus 100% Benzylbenzoat und 100% Methylsalicylat in einem Anteil von 3:5 enthält (dieses Gemisch wird auch als Spalteholzlösung bezeichnet) 13.
    5. Lassen Sie die Mäuse in der Spalteholz-Lösung in einer Vakuumkammer eintauchen, bis sie diaphan wird, was in der Regel 5 bis 7 Tage dauert.
    6. Ersetzen Sie die Lösung, wenn es dunkel wird, bevor die Probe klar wird.
  5. Quantifizierung von Begleitgefäßen
    1. Beobachten Sie die Mäuse, die in der Spalteholz-Lösung unter Transillumination mit einem stereotaxic Mikroskop aufgehängt sind. Verwenden Sie Mikrochirurgie Zangen, um es sanft zu greifen und zu bewegen.
    2. Fotografieren Sie die gesamten Gliedmaßen mit einer Mit-Digitalkamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist.
    3. Besorgen Sie sich ganze Gliedmaßenfotos mit der entsprechenden Software.
    4. Führen Sie eine manuelle Segmentierung der Begleitgefäße durch, indem Sie sie mit der entsprechenden Software hervorheben.
      ANMERKUNG: Kollateralgefäße werden gemäß der Definition von Longland definiert, einem definierten Stamm, einer mittleren Zone und einem wiedereintretenden, mit einem Durchmesser zwischen 20 und 300 m, ausgenommen Femoral-, Sapheno- und Poplitealarterien und alle venösen Strukturen.
    5. Definieren Sie ROIs in jeder Maus im gleichen anatomischen Bereich im Adduktor, um die Umgebung und unterhalb der chirurgischen Okklusion.
    6. Quantifizieren Sie die Kollateralgefäßdichte (CVD) in äquivalenten ROIs, die 20 % der gesamten Gliedmaßenfläche entsprechen. Die CVD wird als Verhältnis zwischen dem Gefäßbereich und den ROIs-Bereichen berechnet. Alle Dichtemessungen werden mit der ImageJ-Software durchgeführt.
      HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass der CVD-Wert der nicht-ischämischen Extremität für jede Maus 100 % entspricht, um Variationen in den Anatomie-, Perfusions- oder Diaphonisierungsverfahren auszuschließen. Der CVD-Prozentsatz in der ischämischen Gliedmaße wurde daher relativ zum nicht-ischämischen berechnet.
    7. Bestimmen Sie den Prozentsatz des CVD-Anstiegs als Differenz zwischen dem CVD-Prozentsatz zwischen den ischämischen und nonischenmischen Gliedmaßen.
  6. Laseraufnahme Mikrodissektion von Kapillaren
    1. Nach der Anästhesisierung, opfern Sie die Mäuse durch Zervix-Dislokation.
    2. Um die Gastrocnemius-Muskeln beider Beine zu ernten, entfernen Sie die Haut von Mäusen beide Hinterbeine.
    3. Identifizieren Sie die Achillessehne und trennen Sie die Sehne vom Knochen mit einem 11-Blatt-Skalpell.
    4. Halten Sie die Achillessehne und trennen Sie den Muskel von der Tibia und Fibel bis zum Kniegelenk mit einer Federschere.
    5. Trennen Sie den Bizeps femoris vom Magen-Darm-Muskel.
    6. Verwenden Sie eine Federschere, um die Einfügungen der Gastrocnemius-Muskeln auf Kniegelenksebene zu schneiden.
    7. Legen Sie die geernteten Gastrocnemius-Muskeln mit Hilfe von 10 % Tragacanth in querer Ausrichtung auf eine kleine Korkscheibe.
    8. Die Proben in flüssigstickstoffgekühltem Isopentan einfrieren und bei -80 °C bis zum Schnitt lagern.
    9. Auf einem Kryostat 12 m Abschnitte der Muskelproben schneiden und auf Glasrutschen montieren.
      HINWEIS: Nehmen Sie für den RNA-Schutz einen vorgekühlten Schlitten und berühren Sie die Rückseite des Schlittens mit dem Finger (Handschuhe), um nur den Bereich für die Platzierung des Abschnitts zu erwärmen. Abschnitt vom Kryostatmesser durch Berührung mit dem erwärmten Bereich übertragen und bei -20 °C im Kryostat 2-3 min trocknen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
      1. Befestigen Sie die Glasgletten in einer Flasche mit gekühltem reinem Aceton (ca. 50 ml) für 5 min bei -20 °C und trocknen Sie sie lufttrocken.
      2. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift um die Abschnitte.
        HINWEIS: Die Verwendung des hydrophoben Pens trägt zur Reduzierung der Während des Protokolls verbrauchten Lösungen bei. Für alle Inkubationen verwenden Sie 100 l aller Lösungen pro Abschnitt.
      3. Rehydrieren Sie mit 2 M NaCl/PBS bei 4 °C und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C mit monoklonen Anti-CD31-Ratten-Monoklon-Antikörpern bei 1:500 in 2M NaCl/PBS.
      4. Zweimal in 2M NaCl/PBS für insgesamt 6 min waschen.
      5. Fügen Sie einen sekundären biotinylierten Kaninchen Anti-Ratten-IgG-Antikörper um 1:200 in 2M NaCl/PBS und 5% Kaninchenserum für 30 min bei 4 °C hinzu.
      6. 2 M NaCl/PBS wie bisher einwaschen und beschrifteten avidinkonjugierten Peroxidase-Komplex 30 min bei 4 °C hinzufügen.
      7. Spülen und fügen Sie DAB Peroxidase Substrat Kit für 5 min.
      8. Die Abschnitte in eiskaltem 90 % Ethanol, gefolgt von 100 % Ethanol, dehydrieren und trocknen lassen.
      9. Sezieren Sie 10 000 Kapillaren pro Mäuse mit einem Laser-Mikrodissektionssystem, das mit einem gepulsten Festkörperlaser 355 nm ausgestattet ist, und katapultieren Sie die dissekierten Kapillaren in eine Mikrofugenrohr-Klebstoffkappe.
  7. RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Vorverstärkung und RT-PCR
    1. Isolieren Sie die gesamte RNA aus den mikrosezierten Kapillaren mit einem geeigneten Kit, die erhaltene Gesamt-RNA liegt zwischen 1,5-3 ng/l.
    2. Verwenden Sie ein cDNA-Synthesekit für die Synthese und zwei Runden der Vorverstärkung, indem Sie die in Tabelle 1beschriebenen Primer verwenden.
    3. Führen Sie RT-PCR für dieselben Ziele aus, die im vorherigen Schritt beschrieben wurden. Verwenden Sie ein Programm, das aus einem ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 10 min besteht, gefolgt von 50 Zyklen bei 95 °C für 15 s und bei 60 °C für 1 min.

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Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Nabelschnur mesenchymale Stammzellen und niedrig dosierte ionisierende Strahlung (LDIR) als vermeintliche angiogene Therapien 11,12getestet. Laser Doppler Perfusionswerte wurden vor der Ischämie-Induktion und zu vorab festgelegten Zeitpunkten von unmittelbar nach der Ischämie-Induktion bis 45 Tage nach der Ischämie erhalten. Gewebeperfusionsmessungen per Laser Doppler wurden als farbcodierte Bilder aufgezeichnet, ohne Durchb...

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Diskussion

Murine Modelle der CLI bestanden meist in Ligation der Femoralarterie nur distal zum Ursprung der profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Dies hat gezeigt, dass der größte Teil der Kollateralzirkulation intakt bleibt, was den Blutfluss in die Gliedmaßen innerhalb von 7 Tagen wiederherstellt 9. Die Entfernung des...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken José Rino und Ténia Carvalho, Leiter der Bioimaging Facility und Histologie und Vergleichendes Pathologielabor des Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes. Wir danken auch Vyacheslav Sushchyk von der Abteilung für Anatomie der Nova Medical School/Faculdade de Ciéncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Förderreferenz: Projekt, das von UID/IC/0306/2016 Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia finanziert wird. Paula de Oliveira wird durch ein Stipendium (SFRH/BD/80483/2011) von Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7500 Fast Real-Time PCRApplied Biosystems
Instrument AcetonMerk1000141000Reagenz; Achtung - leicht entzündliches
AdenosinValdepharmReagenz
AtipamezolOrionPharmaReagenz
Bariumsulfat (mikropaque)Guebert8671404 (ref. Infarmed)Reagenz
BuprenorphinRichterPharmaReagenz
Carl Zeiss Opmi-1 FC OperationsmikroskopCarl Zeiss Mikroskopie, DeutschlandInstrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA-Synthese-KitQiagen7335730Reagenz-Kryostat
Leica CMLeica Microsystems3050SInstrument
DAB Peroxidase-Substrat-KitDAKO; Vector LaboratoriesK3468Reagenz
WasserstoffperoxidaseMerk1072090250Reagenz; Achtung - nocif
hydrophober StiftDako411121Reagenz; Achtung - toxisch
KetamidorRichterpharmaCN:580393,7 630/01/12 DfvfReagenz
Laser Doppler Perfusion Imager moorLDI2-HIRMoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK5710Instrument
Leica DM2500 aufrechtes HellfeldmikroskopLeica MicrosystemsInstrument
MedetorVirbac037/01/07RFVPTReagenz
MethanolVWRUN1230Reagenz; Achtung - giftiges und leicht entzündliches
PapaverineLabesfalReagenz
Pentano IssoMerk1060561000Reagenz; Achtung - leicht entzündlich
Power SYBR® GreenApplied Biosystems4309155Reagenz
gereinigte Ratte Anti-Maus CD31Pharmingen550274Reagenz
RNeasy Micro KitQiagen74004Reagenz
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733XNaht
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Ratte IgG)Vectastain ABC Kit; Vector LaboratoriesPK-4004Reagenz
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202/ UL101Nahtmaterial
Zeiss PALM MicroBeam Laser MikrodissektionssystemCarl Zeiss Mikroskopie, Deutschland1023290916Instrument
Stereotaktisches MikroskopCarl Zeiss Mikroskopie, DeutschlandInstrument
DigitalkameraLinuxInstrument

Referenzen

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
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