Methodenartikel

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

DOI:

10.3791/59590

⸱

27. Mai 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.

Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium1freigesetzt werd....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydrat-Polymer-Isolierung

  1. Polymerisolierung und Entfernung von Verunreinigungen
    1. Kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen [z. B. 30 °C unter einem 12-h-Licht (50 'E m'2s '1)/12 h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Messen Sie das Wachstum mit Standardprotokollen [z.B. optische Dichte bei 730 nm (OD730nm), Chlorophyll a, Trockengewicht, etc.], und messen Sie dann die Produktion von freigesetzten Polysacchariden nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode16.
    2. Übertragen Sie die Kultur in Dialysem....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Extraktion freigesetzter Kohlenhydratpolymere aus cyanobakteriellen Kulturen ist in Abbildung 1dargestellt. Gefällte Polymere des moderaten EPS-Herstellers Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 und des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110 sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 3sind lyophilisierte Polymere mit unterschiedlichen .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).

Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden1. D.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde aus Fondso Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln über das COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, und aus portugiesischen Fonds über FCT - Fundaéo para a Ciéncia e finanziert. ein Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-028779 und des Zuschusses SFRH/BD/99715/2014 (CF).

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Membranen für DialyseMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07Visking Schlauch Größe 7, Durchmesser 23,8 mm, Breite 39-41 mm 30m Rolle
Ethanol 96%AGA - &Aakut; lcool e Gé neros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Gärung Ethylalkohol 96% AGA
PES Filter 0,2 μ mFisher Scientific, Lda15206869Spritzenfilter Polystyrol 33MM 0,2 & Mikro; M STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324Zentrifugalfilter mit einem nominalen Molekulargewichts-Cutoff von 3 kDa
Thermo Scientific  Pierce BCA Protein AssayFisher Scientific, Lda10741395Grün-zu-Blaues, präzises, waschmittelkompatibles Assay-Reagenz zur Messung der Gesamtproteinkonzentration
Brillant Blue G Kolloidales Konzentrat Sigma Aldrich Quí mica SLB2025-1EACoomassie blau 

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Cyanobakterielle KohlenhydratpolymereProteinisolierungPolymerf llungKonzentration des ExoproteomsZentrifugationsfiltrationEthanolf llungLyophilisierungsprozessMassenspektrometrieAnpassung von Bakterienst mmenbiotechnologische Anwendungen

Verwandte Artikel