Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Zusammenfassung

Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.

Einleitung

Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.

Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium¹freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel², immunstimulierend³, Antioxidans⁴, Metall-Chelatierung⁵, emulgierend⁶, und Drogen-Liefermittel^7,8). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers⁹. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind^9,10. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung¹⁰.

Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)¹¹ oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)¹²zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt¹³anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) ^{14 , 15} oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.

Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.

Protokoll

1. Cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydrat-Polymer-Isolierung

1. Polymerisolierung und Entfernung von Verunreinigungen
   1. Kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen [z. B. 30 °C unter einem 12-h-Licht (50 'E m^'2s '1)/12 h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Messen Sie das Wachstum mit Standardprotokollen [z.B. optische Dichte bei 730 nm (OD_730nm), Chlorophyll a, Trockengewicht, etc.], und messen Sie dann die Produktion von freigesetzten Polysacchariden nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode¹⁶.
   2. Übertragen Sie die Kultur in Dialysemembranen (12-14 kDa molekularer Abschaltung) und dialysieren Sie gegen mindestens 10 Volumina entionisiertes Wasser für 24 h unter kontinuierlichem Rühren.
      HINWEIS: Je nach Deminlysevolumen und mittlerer Zusammensetzung kann es notwendig sein, das Dialysewasser zu ändern.
   3. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Durchstechflasche und entsorgen Sie das Pellet (Zellen).
   4. Zentrifugieren Sie wieder bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C, um Verunreinigungen wie Zellwandablagerungen oder Lipopolysaccharide (LPS) zu entfernen.
   5. Den Überstand in ein Glasbecher geben und das Pellet entsorgen.
2. Niederschlag des Polymers
   1. Fügen Sie dem Überstand 2 Volumina von 96 % Ethanol hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Suspension bei 4 °C, mindestens über Nacht.
   3. Polymerrückgewinnung
      1. Für kleine oder nicht sichtbare Mengen ausgefälltem Polymer: Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml oder 2 ml autoklaviertem entionisiertem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die wässrige Aufhängung auf eine Durchstechflasche.
         VORSICHT: Der Überstand sollte sanft entsorgt werden, da er leicht wieder ausgesetzt werden kann.
      2. Für sichtbare/große Mengen ausgefälltem Polymer: Sammeln Sie das ausgefällte Polymer mit sterilen Metallzangen zu einer Durchstechflasche. Drücken Sie das Polymer und entsorgen Sie das überschüssige Ethanol.
   4. Optional: Wiederholen Sie je nach dem erforderlichen Polymerreinigungsgrad den Niederschlagsschritt mit 96% Ethanol nach Resuspension der Polymere in entionisiertem Wasser.
3. Lyophilisierung des Polymers
   1. Halten Sie die Durchstechflaschen mit dem gefällten Polymer mindestens über Nacht bei -80 °C.
   2. Das Polymer mindestens 48 h gefriertrocken (lyophilisieren) (die Suspension nicht vor dem Gefriertrocknen auftauen lassen).
   3. Das getrocknete Polymer bei Raumtemperatur (RT) bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.
      HINWEIS: Das Polymer in einem Trockentrockner zu lagern ist ratsam, da es Wasser im Laufe der Zeit aufnehmen kann.

2. Cyanobakterielle Exoproteom-Isolierung

1. Mittlere Konzentration
   1. Cyanobakterien unter Standardbedingungen anbauen [z. B. 30 °C unter einem 12 h-Licht (50 x 2 s^1)/12h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Überwachen Sie das Cyanobacterium-Wachstum mit Standardverfahren (z.B. OD_730nm, Chlorophyll a, Trockengewicht, etc. ).
   2. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4.000 x g, für 10 min bei RT.
   3. Den Überstand in einen Kolben geben und das Zellpellet entsorgen.
   4. Filtern Sie das dekantierte Medium durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 m.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier für einen kurzen Zeitraum angehalten werden, wenn das Medium bei 4 °C gehalten wird.
   5. Konzentrieren Sie das Medium ca. 500x (unter Berücksichtigung des Anfangsvolumens des gefilterten Mediums), wobei Zentrifugalkonzentratoren mit einem nominalen Molekulargewicht von 3 kDa verwendet werden. Die Zentrifugation sollte bei 4.000 x g (maximal 1 h pro Zentrifugation rund) bei 15 °C betrieben werden.
      VORSICHT: Bei den meisten Konzentratormarken muss das Filtergerät vor Gebrauch durch Zentrifugation mit Reinstwasser geräuflt werden. Sobald der Filter nass ist, lassen Sie ihn nicht austrocknen. Lassen Sie genügend Flüssigkeit auf dem Reservoir, wenn das Gerät nicht verwendet wird.
      HINWEIS: Die Reduzierung der Zentrifugationstemperatur auf 4 °C kann hilfreich sein, wenn das Ziel darin besteht, die Proteinaktivität zu untersuchen, obwohl dies die für die Probenkonzentration erforderliche Zeit erhöht. Das Protokoll kann zwischen Zentrifugationsschritten für kurze Zeiträume angehalten werden, wenn das Medium bei 4 °C gehalten wird.
   6. Spülen Sie die Wände des Filtergeräte-Probenreservoirs mit der konzentrierten Probe und übertragen Sie den Inhalt in ein Mikrozentrifugenrohr.
   7. Führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt des Filtergeräte-Probenreservoirs mit autoklavierten Kulturmedium durch, um eine maximale Exoproteom-Wiederherstellung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Um den Prozentsatz der Wiederherstellung zu quantifizieren, befolgen Sie die Anweisungen des jeweiligen Herstellers.
   8. Die Exoproteomproben bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Die Zugabe von Proteasehemmern wird für die Langzeitlagerung empfohlen.
2. Analyse des Exproteoms
   1. Quantifizieren Sie den Proteingehalt durch BCA-Protein-Assay in 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Trennen Sie die Proteine durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von Standard-Färbeprotokollen (z.B. Coomassie blau, Silberfärbung).
   3. Schneiden Sie die Bandbreiten/Gelbereiche von Interesse aus und sammeln Sie sie in verschiedenen Mikrozentrifugenrohren, die entsprechende Mengen an reinem reinem Wasser enthalten.
   4. Fahren Sie mit der Identifizierung und Analyse der Proteine durch Massenspektrometrie fort.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Extraktion freigesetzter Kohlenhydratpolymere aus cyanobakteriellen Kulturen ist in Abbildung 1dargestellt. Gefällte Polymere des moderaten EPS-Herstellers Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 und des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110 sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 3sind lyophilisierte Polymere mit unterschiedlichen ...

Diskussion

Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).

Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden¹. D...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Membranen für Dialyse	Medicell Membranes Ltd	DTV.12000.07	Visking Schlauch Größe 7, Durchmesser 23,8 mm, Breite 39-41 mm 30m Rolle
Ethanol 96%	AGA - &Aakut; lcool e Gé neros Alimentares, S.A.	4.000.02.02.00	Gärung Ethylalkohol 96% AGA
PES Filter 0,2 μ m	Fisher Scientific, Lda	15206869	Spritzenfilter Polystyrol 33MM 0,2 & Mikro; M STR
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K	Merck Millipore Ltd.	UFC900324	Zentrifugalfilter mit einem nominalen Molekulargewichts-Cutoff von 3 kDa
Thermo Scientific  Pierce BCA Protein Assay	Fisher Scientific, Lda	10741395	Grün-zu-Blaues, präzises, waschmittelkompatibles Assay-Reagenz zur Messung der Gesamtproteinkonzentration
Brillant Blue G Kolloidales Konzentrat	Sigma Aldrich Quí mica SL	B2025-1EA	Coomassie blau