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Methodenartikel

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

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DOI:

10.3791/59609

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10. Juli 2019

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1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Zusammenfassung

Die auf Atomkraftmikroskopie basierende Einzelkraftspektroskopie (AFM-SCFS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungsstärken und -dynamiken auf einer lebenden Zellmembran, einschließlich der zwischen Zellen, Rezeptoren und Liganden, und neben vielen anderen Variationen. Es funktioniert auch als Mechanismus, um einen physikalischen oder biochemischen Stimulus auf einzelne Zellen in einer raumzeitlich kontrollierten Weise zu liefern, so dass bestimmte Zellaktivierung und nachfolgende zelluläre Ereignisse in Echtzeit überwacht werden können, in Kombination mit Live-Zell Fluoreszenz-Bildgebung. Der schlüsselfertige Schritt bei diesen AFM-SCFS-Messungen ist die AFM-Auslegerfunktionierung, oder mit anderen Worten, die Anfügung eines Interessenten an den Ausleger. Hier stellen wir Methoden zur Modisierung von AFM-Auslegern mit einer einzelnen T-Zelle bzw. einer einzelnen Polystyrolperle für immunologische Studien vor. Erstere beinhaltet einen biokompatiblen Klebstoff, der einzelne T-Zellen an die Spitze eines flachen Auslegers in einer Lösung koppelt, während letzterer auf einem Epoxidkleber für die Einzelperlenhaftung in der Luftumgebung beruht. Zwei immunologische Anwendungen, die mit jeder Auslegermodifikation verbunden sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Die hier beschriebenen Methoden lassen sich leicht an verschiedene Zelltypen und Feststoffpartikel anpassen.

Einleitung

Atomkraftmikroskopie (AFM), ein vielseitiges Werkzeug, hat viele Anwendungen in der Zellbiologie Forschunggefunden 1,2,3,4,5. Neben der hochauflösenden Bildgebungsfunktion ermöglicht die native Kraft-Probing-Funktion die direkte Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen direkt vor Ort auf der einzelzelligen Ebene6,7. Dazu gehören die Steifigkeiten subzellulärer Strukturen oder sogar ganzer Zellen8,9,10,11,12, spezifische Liganden/Rezeptor-Bindungsstärken an der Einzelmolekülebene auf der Zelloberfläche13, und Haftkräfte zwischen Einzelpaaren von Festen Partikeln und Zellen oder zwischen zwei Zellen1,2,14,15. Die beiden letztgenannten sind oft als einzellige Kraftspektroskopie (SCFS)16kategorisiert. Aufgrund der leicht verfügbaren Ausleger mit unterschiedlicher Federkonstante ist der für AFM zugängliche Kraftbereich von wenigen Piconewtons (pN) bis zu Mikronewtons (N) recht breit, was die gesamte Bandbreite der zellulären Ereignisse mit Kräften von wenigen Dutzenden angemessen abdeckt. pN, wie z. B. rezeptorbasierte Einzelmolekülbindung, an nN, wie z. B. phagozytische zelluläre Ereignisse15. Dieser große dynamische Kraftbereich macht AFM vorteilhaft gegenüber anderen Kraft-Probing-Techniken wie optischer/magnetischer Pinzette und einer Biomembran-Kraftsonde, da sie besser für Schwachkraftmessungen geeignet sind, mit einer Kraft von typischerweise weniger als 200 pN17. , 18. Darüber hinaus kann AFM als hochpräziser Manipulator fungieren, um verschiedene Reize auf einzelne Zellen in einer räumlich definierten Weise zu liefern4,19. Dies ist für die Einzelzellaktivierungsstudien in Echtzeit wünschenswert. In Kombination mit livezelliger Fluoreszenz-Bildgebung kann die nachfolgende zelluläre Reaktion auf den spezifischen Reiz gleichzeitig überwacht werden, wodurch AFM-basiertes SCFS als optische Bildgebung äußerst robust ist und ein praktisches Werkzeug zur Untersuchung der zellulären Signalisierung bietet. Zum Beispiel wurde AFM verwendet, um die Stämme zu bestimmen, die erforderlich sind, um Kalziumtransienten in Osteoblasten zu entlocken20. In dieser Arbeit wurden Kalziumtransienten fluoreszierend durch Kalzium-Ratiometrische Bildgebung nach der Anwendung lokalisierter Kräfte auf kultivierte Osteoblasten mit einer AFM-Spitze verfolgt. Kürzlich wurde AFM eingesetzt, um Kollagenfibrillen zu dehnen, auf denen hepatische Stellatzellen (HSC) angebaut wurden, und diese mechano-transdued HSC-Aktivierung wurde in Echtzeit von einem fluoreszierenden Src-Biosensor überwacht, dessen Phosphorylierung Fluoreszenzintensität des Biosensors korreliert mit HSC-Aktivierung3.

In AFM-basierten SCFS-Experimenten ist die richtige Funktionalisierung von AFM-Auslegern ein wichtiger Schritt zu erfolgreichen Messungen. Da sich unser Forschungsinteresse auf die Aktivierung von Immunzellen konzentriert, funktionalisieren wir routinemäßig Ausleger mit Partikeln wie einzelnen Feststoffpartikeln, die Phagozytose und/oder starke Immunantworten auslösen können4,14 , 15 und einzelne T-Zellen, die eine Immunsynapse mit Antigen-präsentierenden Zellen bilden können, wie aktivierte dendritische Zellen (DC)2. Einzelne Feststoffpartikel werden in der Regel über einen Epoxidkleber in der Luftumgebung an einen Ausleger gekoppelt, während einzelne T-Zellen aufgrund ihrer nicht klebenden Natur über einen biokompatiblen Klebstoff in Lösung zu einem Ausleger funktionalisiert werden. Hier beschreiben wir die Methoden, um diese beiden Arten von Freischwinger-Modifikationen durchzuführen und geben auch zwei zugehörige Anwendungen. Die erste Anwendung besteht darin, T-Zell-/DC-Wechselwirkungen mit AFM-SCFS zu untersuchen, um den Unterdrückungsmechanismus von regulatorischen T-Zellen aus der Sicht der Zellmechanik zu verstehen. Die zweite beinhaltet die Kombination von AFM mit Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung, um die zelluläre Reaktion von Makrophagen auf ein festes Teilchen in Echtzeit zu überwachen, um den molekularen Mechanismus des rezeptorunabhängigen Phosphatidylinositols 4,5-Bisphosphat (PIP2)- Moesin vermittelte Phagozytose. Ziel dieses Protokolls ist es, interessierten Forschern einen Bezugsrahmen für die Konzeption und Umsetzung ihrer eigenen experimentellen Einstellungen mit AFM-basierter einzelliger Analyse für die immunologische Forschung zu bieten.

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Protokoll

Das Maus-Experiment-Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien der Tsinghua University

1. Auslegerfunktionalisierung mit einzelnen T-Zellen

  1. Maus Milzzellen Vorbereitung
    1. Opfern Sie die Maus (8-16 Wochen alt (entweder Geschlecht); z.B. C57BL/6 Stamm) mit Kohlendioxid, gefolgt von Zervixdislokation.
    2. Reinigen Sie die Maus mit 75% Ethanol und machen Sie einen Mittellinien-Hautschnitt gefolgt von Splenektomie.
    3. Homogenisieren Sie die Milz in 4 ml PBS mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) mit Glasschlitten und entfernen Sie Aggregate und Schmutz, indem Sie die Zellsuspension durch ein 70 m mesh Nylon Sieb passieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml roter Blutzelllysepuffer (bei Raumtemperatur ausbalanciert) für 5 min. Beenden Sie die Lysereaktion durch Zugabe von 8 ml PBS-Lösung.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min und setzen Sie Zellen mit einer Dichte von 1 x 108 Zellen/ml in PBS mit 2% FBS und 1 mM EDTA (Labelled as Solution A) wieder auf, in der Regel 0,25-2 ml je nach Zelldichte. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf ein 5 ml (12 x 75 mm) Polystyrol-Rundbodenrohr.
  2. Maus CD4+ T Zellen Vorbereitung
    1. Fügen Sie der Austragungsprobe aus Schritt 1.1.5 50 L/ml/ml CD4+ T-Zellisolationscocktail (siehe Materialtabelle)50 l/ml-Rattenserum (siehe Materialtabelle)hinzu. Mischen und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Wirbel die Stammstreptavidin-beschichtete magnetische Partikellösung (siehe Materialtabelle) für 30 s oder bis die Partikel gleichmäßig dispergiert erscheinen.
    3. Fügen Sie der Zellprobe 75 L/ml/ml streptavidin-beschichtete magnetische Partikel hinzu. Mischen und inkubieren für 2,5 min bei Raumtemperatur.
    4. Fügen Sie Lösung A hinzu, um die Zellprobe auf 2,5 ml aufzuladen und durch sanftes Pipettieren nach oben und unten für 2-3 Mal zu mischen.
    5. Legen Sie das Probenrohr (ohne Deckel) in den Magneten (siehe Materialtabelle) und brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die angereicherte Zellsuspension vorsichtig in ein neues 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die angereicherten T-Zellen in 500 l der Lösung A wieder auf.
      HINWEIS: Die angereicherten CD4+ T-Zellen enthalten sowohl konventionelle als auch regulatorische T-Zellen.
  3. Regulatorische T-Zellen Trennung von herkömmlichen T-Zellen
    1. Fügen Sie der angereicherten T-Zellprobe, die aus Schritt 1.2.6 gewonnen wurde, 25 L des FcR-Blocks (siehe Materialtabelle)hinzu. Mischen und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie der T-Zellprobe 25 L regulatorischen T-Zell-Positivauswahlcocktails (siehe Materialtabelle)hinzu. Mischen und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
    3. Fügen Sie der T-Zellprobe 10 L PE-Auswahlcocktail (siehe Materialtabelle)hinzu. Mischen und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
    4. Wirbel die Stamm dextran-beschichtete magnetische Partikellösung (siehe Materialtabelle) für 30 s oder bis die Partikel gleichmäßig dispergiert erscheinen.
    5. Fügen Sie der T-Zellprobe 10 L dextranbeschichtete magnetische Partikel hinzu. Mischen und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
    6. Fügen Sie die Lösung A hinzu, um die T-Zellprobe auf 2,5 ml aufzuladen und durch sanftes Pipettieren nach oben und unten für 2-3 Mal zu mischen.
    7. Legen Sie das T-Zell-Probenrohr (ohne Deckel) in den Magneten und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Rohr.
      HINWEIS: Der Überstand enthält die angereicherten konventionellen CD4+T-Zellen.
    8. Zentrifugieren Sie die angereicherten konventionellen CD4+T-Zellen bei 500 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 4 ml RPMI1640 wieder aus, die 10% FBS, 0,05 mM -Mercaptoethanol, 0,01 M HEPES und 1% Penicillin/Streptomycin (als Medium B gekennzeichnet) enthalten.
    9. Entfernen Sie das Rohr, in dem regulatorische T-Zellen vom Magneten angereichert sind. Fügen Sie 2,5 ml Lösung A in das Rohr und mischen Sie durch sanftes Pipettieren nach oben und unten für 2-3 mal. Legen Sie das Rohr wieder in den Magneten, brüten Sie für 5 min, und gießen Sie dann vorsichtig ab und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal.
    10. Setzen Sie die angereicherten regulatorischen T-Zellen in 2 ml Medium B aus.
    11. Sowohl gereinigte konventionelle T-Zellen als auch regulatorische T-Zellen mit 100 U/ml hIL-2 über Nacht oder für mindestens 4 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 inkubieren, bevor sie zur Auslegerfunktionalisierung verwendet werden.
  4. Dendritische Zellpräparation
    1. Bereiten Piranha-Lösung, eine Mischungaus 30% H2 O2 (30%) und 70% H2SO4 (conc) (v/v). 3 ml H 2 O2 unter ständigem Rühren und Kühlen langsam 3 ml H2O 2 in 7 ml H2 SO4 gießen.
      VORSICHT: Piranha-Lösung ist sehr korrosiv, und es kann Körpergewebe verbrennen und zerstören. Daher ist es sicherer, die Piranha-Lösung unter einer Haube zu verwenden und geeignete Sicherheitsausrüstung zu tragen, da die Mischung um den Becher spritzt. Neutralisieren Sie die Lösung mit NaOH nach Gebrauch auf pH 7.
    2. Den Glasdeckel von 24 mm Durchmesser für 30 min in die Piranha-Lösung eintauchen und anschließend gründlich mit dem sterilen Reinstwasser abspülen.
    3. Tauchen Sie ein Paar spitzen Pinzette in 75% Ethanol für 30 min für die kalte Desinfektion.
    4. Führen Sie die gereinigten Glasabdeckungen durch die Pinzette in eine 6-Well-Kulturplatte ein.
    5. Kippen Sie eine 6 cm kunststoffkulturelle Schale, in der DC2.4-Zellen mit 4 ml Medium B vorkultiviert wurden, und aspirieren Sie das gesamte Medium. Fügen Sie 2 ml PBS in die Kulturschale ein, um DC2.4-Zellen zu spülen und PBS zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt noch zwei Mal.
    6. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin EDTA für 2 min in die Kulturschale. Fügen Sie 1 ml Medium B zu dieser Schale hinzu, um die Enzymverdauungsreaktion zu beenden. Übertragen Sie die verdaute Zellsuspension in ein 15 ml-Rohr.
    7. Zentrifufugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min und setzen Sie DC2.4-Zellen mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen/ml in Medium B wieder auf.
    8. Seed DC2.4-Zellen auf den Glasabdeckungen, die in Schritt 1.4.4 hergestellt wurden, und bebrütendie Zellen über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C mit 5% CO2 .
      ANMERKUNG: Um die Wechselwirkungskräfte zwischen zwei einzelnen Zellen zu messen, ist eine relativ niedrige Konzentration von DC2.4-Zellen (d. h. <10 % Konfluenz) erforderlich, um einen angemessenen Abstand zwischen den Zellen zu haben.
  5. AFM Auslegervorbereitung
    HINWEIS: Ausleger, die für Einzelzellkraftspektroskopieexperimente geeignet sind, sind solche mit niedrigen Federkonstanten, typischerweise im Bereich von 0,01-0,06 N/m. Hier werden weiche spitzenlose Ausleger für Einzelzellen und einzelne Feststoffpartikel bevorzugt.
    1. Reinigen Sie die Ausleger durch Piranha-Behandlung oder Plasma- oder UV-Ozon-Reinigung.
    2. Montieren Sie den gereinigten Ausleger am AFM-Scankopf.
    3. Bereiten Sie eine saubere Probenkammer mit reinem Wasser gefüllt und kalibrieren Sie den Ausleger in Wasserlösung, indem Sie zuerst eine Kraftkurve auf dem Glassubstrat laufen, um die Empfindlichkeit zu erhalten (die Steigung der linearen Passung über den abstoßenden Teil der nahenden Kurve) und dann Aufzeichnung eines thermischen Rauschspektrums zur Extraktion der Federkonstante gemäß der Bedienungsanleitung des AFM.
    4. Entfernen Sie den AFM-Scankopf aus der Lösung, waschen Sie den montierten Ausleger mit ein paar Tropfen reinem Ethanol und halten Sie den Ausleger trocken auf dem Scankopf.
  6. Anbringen einzelner T-Zellen an den Ausleger
    1. Das Gehäuse der lebenden Zellumgebung mit 5% CO2 bei 37 °C vorheizen.
    2. Montieren Sie den Glasdeckel mit DC2.4-Zellen, die von Schritt 1.4.8 auf eine Probenkammerbaugruppe angebaut werden, fügen Sie der Kammer sofort 600 l Medium B hinzu und legen Sie die Baugruppe dann auf die AFM-Probenstufe.
    3. Fügen Sie hIL-2 inkubierte CD4+T-Zellen (entweder konventionelle oder regulatorische T-Zellen) in die Probenkammer ein.
      HINWEIS: Das gesamte Probenvolumen sollte 1 ml nicht überschreiten.
    4. Warten Sie, bis die hinzugefügten CD4+T-Zellen vollständig auf der Unterseite des Coverslips abgerechnet sind.
      HINWEIS: Luftblasen verursachen große Störungen des Experiments, daher ist es ratsam, Luftblasen in Schritt1.6.2 und 1.6.3 zu vermeiden.
    5. Fügen Sie mit einer Pipette wie in Abbildung 1 einen Tropfen von 2 l biokompatiblen Kleber auf das Ende des montierten Auslegers und legen Sie dann den Scankopf schnell auf die Probenstufe, so dass der Ausleger mit dem biokompatiblen Kleber in den lösung.
      VORSICHT: Berühren Sie den Glasstein oder den Ausleger nicht mit der Pipettenspitze. Da der hier verwendete biokompatible Klebstoff anfällig für Oxidation in der Luft ist, sollte dieser Schritt so schnell wie möglich durchgeführt werden.
    6. Suchen Sie eine gesunde T-Zelle unter der Spitze des Auslegers grob unter dem Mikroskop, indem Sie die Probenstufe bewegen und dann die Positionierung fein anpassen, indem Sie den Scankopf bewegen.
      HINWEIS: Eine gesunde CD4+T-Zelle hat in der Regel eine relativ große Größe, glatte Kanten und optisch transmissiv in der Lichtfeld-Bildgebung.
    7. Senken Sie den Ausleger manuell mit Stufengrößen von 50 m und dann bis 10, 5, 2 und 0,5 m schrittweise, indem Sie die Schrittmotoren steuern. Halten Sie die Position der Schrittmotoren und passen Sie die Positionierung des Scankopfes für eine bessere Ausrichtung zwischen der Auslegerspitze und der Zelle an, sobald der Ausleger einen festen Kontakt mit der Ziel-T-Zelle herstellt, wie durch eine kleine Verschiebung des Laserstrahls angezeigt wird. Position im Photodetektor entspricht einem typischen Kraftbereich von 0,5-1,5 nN.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann auch durch Ausführen einer einzigen Kraftmessung durchgeführt werden, bei der soll der Sollwert (die auf die Zelle angewendete Kraft) und die Kontaktzeit in der Software gut definiert werden. Aufgrund der nicht klebenden Natur von T-Zellen bietet der manuelle Ansatz jedoch mehr Flexibilität bei der Steuerung von Ziel-, Positionierungs- und Kontaktzeiten als die automatische Annäherung und es funktioniert zuverlässig für die T-Zellhaftung. Zukünftige Experimentalisten sollten sowohl das manuelle als auch das automatische Herangehen versuchen, herauszufinden, was für ihre Interessensysteme besser funktioniert.
    8. Ziehen Sie den Ausleger nach 30 s Kontakt ein.
      HINWEIS: Wenn sich die Zelle mit dem Ausleger bewegt, ist die Anlage erfolgreich. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie Schritt 1.6.6, jedoch auf einer anderen T-Zelle. Der biokompatible Klebstoff ist leicht oxidiert. Schritt 1.6.5-1.6.7 sollte innerhalb von 5 Min. abgeschlossen sein. Wenn derselbe Ausleger dreimal für die T-Zell-Anhaftung fehlschlägt, sollte ein neuer Ausleger verwendet werden, und die Befestigungsprozedur sollte von Schritt 1.5.2 erneut beginnen.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hinzufügens eines kleinen Tropfens biokompatiblen Klebers auf den montierten Ausleger. Der Ausleger wird über eine Spannfeder am Glasblockhalter montiert, der auf dem AFM-Scankopf installiert ist (hier nicht gezeichnet). Wenn der Scankopf auf einer abgeflachten Fläche steht, ist der Ausleger vertikal ausgerichtet, wie in der Zeichnung dargestellt. Mit einer Mikropipette können an der Spitze des Auslegers etwa 2 L biokompatible Leime hinzugefügt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Kraftspektroskopie der Einzelpaar-T-Zell-/Dendritischen Zellinteraktion
    HINWEIS: Um Zell-/Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen, ist ein AFM mit einem Z-Bereich erforderlich, der größer ist als der herkömmliche 10-15 m, um die beiden Zellen vollständig zu trennen. Der hier verwendete AFM hat einen Z-Bereich von 100 m, der ausreicht, um die T-Zelle nach Zell-/Zellkontakt von der dendritischen Zelle zu trennen.
    1. Positionieren Sie die angeschlossene T-Zelle über einer separaten DC2.4-Zelle, indem Sie die Probenstufe und/oder den Scankopf bewegen (siehe Abbildung 2).
    2. Legen Sie die richtigen Parameter fest und führen Sie die Kraftspektroskopie aus.
      HINWEIS: In der Regel werden folgende Tasteneinstellungen verwendet: Sollwert 0,5 nN, Zuglänge 50 m, Z-Bewegung Konstante Geschwindigkeit, Extend Speed 5 'm/s, Contact Time 10 s, Delay Mode Constant Force. Für jedes T-DC-Paar werden 20 Wiederholungen von Kraftkurven gesammelt und für die weitere Analyse mindestens 14 Kraftkurven verwendet.
    3. Montieren Sie einen neuen gereinigten Ausleger, kalibrieren Sie ihn in reinem Wasser wie in Schritt 1.5.3, und gehen Sie zurück zu der gleichen T-DC-Zellenprobe, um Schritt 1.6 und 1.7 für ein anderes T-DC-Paar zu wiederholen. Sonde mindestens 5 Paare für jede Bedingung.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Experimentelle Konfiguration der Kraftprüfung zwischen einer einzelnen T-Zelle und einem Gleichstrom. (A) Schematische Zeichnung der experimentellen Konfiguration, bei der eine T-Zelle, die am Ausleger befestigt ist, zu einem Dc gebracht wird, der auf dem Substrat zur Kraftprobe angebaut wird. (B) Hellfeldbild eines T-Zell-funktionalisierten Auslegers und eines Gleichstroms. Maßstabsleiste, 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Auslegerfunktionalisierung mit einzelnen Polystyrolperlen

  1. Einzelperlen-Vorbereitung
    1. Verdünnen Sie die Lagersuspension von 6'm Polystyrolperlen in 100% Ethanol.
      HINWEIS: Die Konzentration der verdünnten Perlenlösung sollte niedrig genug sein, so dass, wenn sie einer Glasabdeckungsoberfläche zugesetzt werden, einzelne Perlen gut getrennt sind, ohne dass sich nach der Lösungsmittelverdampfung eine signifikante Clusterbildung befindet.
    2. Reinigen Sie den Glasdeckel mit einem Durchmesser von 24 mm mit Ethanol und entfernen Sie Staub durch N2 Luftstrom.
    3. Montieren Sie den gereinigten Glasdeckel an einer Probenkammerbaugruppe und legen Sie die Baugruppe auf das Mikroskop.
    4. Legen Sie einen Tropfen verdünnter Perlenlösung auf die linke Seite, aber in der Nähe der Mitte des Deckslips (siehe Abbildung 3) und überprüfen Sie den Abstand zwischen den Perlen nach der Lösungsmittelverdampfung im hellen Feld unter dem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn einzelne Perlen gut getrennt sind.
    5. Tauchen Sie eine Mikropipette-Spitze oder einen Zahnstocher in einen gut gemischten Epoxidkleber und übertragen Sie dann eine kleine Menge solchen Klebers an drei separate Stellen mit aufeinanderfolgenden sanften Berührungen auf der rechten Seite, aber in der Nähe der Mitte des Coverslip.
      HINWEIS: Die drei Klebepunkte sollten vertikal ausgerichtet sein (siehe Abbildung 3). Die letzte Stelle mit der geringsten Menge des Klebers wird später verwendet.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für die Funktionalisierung von Einzelperlen am Ausleger. Auf der linken Seite des Substrats werden gut getrennte mikrongroße Perlen hergestellt und durch 3 aufeinanderfolgende sanfte Berührungen eine winzige Menge Epoxidkleber auf die rechte Seite des Substrats übertragen, was zu 3 Leimflecken führt. Nur der letzte Fleck mit der geringsten Menge des Klebers (durch einen Kreis gekennzeichnet) wird verwendet, um das Ende des Auslegers zu beschichten. Nähern Sie sich dem Ausleger in den Kleber von links und bewegen Sie dann den Ausleger nach hinten, sobald er in den Kleber eingetaucht ist, um den Kleber ganz am Ende des Auslegers zu beschränken. Bringen Sie die Zielperle unter den Ausleger und richten Sie sie richtig aus, bevor Sie einen festen Kontakt (in der Regel 2-5 nN) für die Perlenhaftung herstellen. Wenn die Perle erfolgreich am Ausleger funktionalisiert wird, kann ein neuer Ausleger montiert werden, um einen neuen Funktionalisierungszyklus zu starten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. AFM Auslegervorbereitung
    1. Montieren Sie einen gereinigten tip-less Ausleger am AFM-Scankopf.
    2. Kalibrieren Sie diesen Ausleger in der Luft mit einer sauberen Oberfläche, um die Federkonstante zu erhalten.
  2. Anbringen einzelner Perlen am Ausleger
    1. Positionieren Sie die Auslegerspitze über der linken Grenze des letzten Epoxid-Kleberflecks, wie in Abbildung 3 dargestellt.
    2. Bringen Sie den Ausleger langsam in die Nähe des Klebers, indem Sie die Schrittmotoren mit kleinen Schrittgrößen senken.
    3. Ziehen Sie den Ausleger schnell vom Kleber seitlich weg, indem Sie den AFM-Scankopf manuell (nach links) nach hinten bewegen, sobald die Spitze in den Kleber getaucht ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur eine winzige Menge des Klebers am Ende der Spitze haftet. Wenn es übermäßigen Kleber auf der Spitze gibt, ist es möglich, die Menge des Klebers durch Berühren zu reduzieren, gefolgt von dem Gleiten der Spitze auf einer leeren Oberfläche.
    4. Bewegen Sie die Auslegerspitze auf eine gut isolierte Einzelperle.
    5. Nähern Sie sich langsam dem Ausleger an die einzelne Perle und nehmen Sie einen festen Kontakt mit der Perle her (wie durch die Verschiebung der Laserstrahlposition im Photodetektor, die einem typischen Kraftbereich von 2-5 nN entspricht) für ca. 10 s, bei dem eine Feineinstellung des t ip Positionierung seitlich wird helfen, besser die Perle am Ende der Spitze zu lokalisieren. Ziehen Sie die Spitze am Ende des Kontakts ein.
      HINWEIS: Das Verschwinden der Perle aus der ursprünglichen Brennebene deutet auf ein erfolgreiches Haftereignis hin.
    6. Den perlenmodifizierten Ausleger vorsichtig abmontieren und in einer Auslegerbox über Nacht für die volle Erstarrung des Leims aufbewahren.
  3. Fluoreszenz-Bildgebung der zellulären Reaktion von Makrophage auf eine einzelne Perle, die von AFM geliefert wird.
    HINWEIS: Die Fluoreszenz-Bildgebung wurde auf einem selbstgebauten objektiven Gesamt-Internen Reflexionsfluoreszenzmikroskop auf Basis eines kommerziellen Mikroskopständers durchgeführt. Dieses Bildgebungssystem ist mit 4 Laserquellen (405 nm, 488 nm, 561 nm, 647 nm), einem Splitter-Viewer für die zweifarbige Detektion und einem Elektronenmultiplikator (EMCCD) für die Großfeld-Bildgebung ausgestattet.
    1. Grow RAW264.7 Zellen auf einem Glasdeckelbeirutsch bei 37 °C in einer 5%CO2 befeuchteten Kammer.
    2. Transfektion Moesin-EGFP und PLC-PH-mCherry zu RAW264.7 Zellen mit einem Transfektionskit (siehe Tabelle der Materialien) gemäß dem Herstellerprotokoll zur fluoreszierenden Visualisierung von Moesin- und Phosphatidylinositol-Molekülen 4,5-Bisphosphat (PIP2) in dieser reihenfolge.
      HINWEIS: Moesin hat ein ITAM-Motiv, das Syk, einen Schlüsselspieler in der Phagozytose, aktivieren kann. PIP2 ist dafür bekannt, Moesin für die Zellmembran zu rekrutieren.
    3. Legen Sie den Glasdeckel mit Zellen auf eine Probenkammerbaugruppe und montieren Sie die Baugruppe auf die AFM-Probenstufe.
    4. Montieren Sie den perlenmodifizierten Ausleger am AFM-Scankopf.
    5. Führen Sie eine Kraftkurve in einem leeren Bereich aus und kalibrieren Sie die Kraft mit der Empfindlichkeit aus dieser Kurve und der in Schritt 2.2.2 gemessenen Federkonstante.
    6. Finden Sie eine gut isolierte Zelle mit den richtigen Fluoreszenzintensitäten in grünen (Moesin-EGFP) und roten (PLC-PH-mCherry) Kanälen mit 488/561 nm Anregungen.
    7. Liefern Sie die nackte 6'm-Polystyrolperle mit AFM mit 1 nN konstanter Kraft und 500 s Kontaktzeit an die Zelloberfläche.
    8. Zeichnen Sie Fluoreszenzbildreihen der Zelle auf, die zur Analyse mit der Perle in Kontakt stehen (in der Regel 10 Frames/s).
      HINWEIS: Um die Photobleichung der Fluorophore zu reduzieren, sollte eine relativ geringe Anregungsleistung für die Suche nach den zellenvon Interesse verwendet werden. Darüber hinaus kann ein intermittierendes Anregungsschema verwendet werden, um die Fluoreszenzzeitspuren zu verlängern, wenn die Dynamik der Zellreaktionen auf einer langsamen Zeitskala erfolgt.

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Ergebnisse

Abbildung 4A zeigt typische Kraft-Distanz-Kurven aus der Bindungsinteraktion zwischen Einzel-T-Zelle und Single-DC in einem Annäherungszyklus. Die hellrote Kurve ist die Verlängerungskurve und die dunkelrote die Rückzugskurve. Da die Verlängerungskurve typischerweise für Einzugoder Steifigkeitsanalysen verwendet wird, betrifft hier nur die Rückzugskurve die Zellhaftung. Der Mindestwert (der grüne Kreis) in der Kurve gibt ein Maß für die maximale Haftkraft an....

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Diskussion

Die AFM-basierte Einzelkraftspektroskopie hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biophysikalischen Eigenschaften lebender Zellen zu adressieren. Für diese Anwendungen muss der Ausleger ordnungsgemäß funktionalisiert werden, um bestimmte Wechselwirkungen oder Eigenschaften auf den von Interesse wichtigen Zellen zu untersuchen. Hier werden die Methoden zur Kopplung einzelner T-Zellen und einzelner Mikron-Großer Perle an den spitzenlosen Ausleger beschrieben. Um eine einzelne T-Zelle am Ausleger zu b...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) und Innovative Research Group Program (81621002) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
10 μ l PipettenspitzeThermo Fisher104-Q
15 ml TubeCorning430791
6 cm Durchmesser KulturschaleNALGENE nunc150462
6-Well-KulturplatteJETTCP011006
AFM CantileverNanoWorldArrow-TL1-50spitzenloser Cantilever
β-MercaptoethanolSigma7604
Biokompatibler KleberBD Cell-Tak354240
CD4+ T-Zell-Isolierung CocktailSTEMCELL19852C.1
DC2.4 ZelllinieEin Geschenk von K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-beschichtete magnetische PartikelSTEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
EpoxyERGO7100
Ethanoltwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR BlockerSTEMCELL18731
Glasdeckglaslokaler Verkäufer (Hai Men Lian Sheng)HX-E3724mm Durchmesser, 0,17mm Dünnheit
GlasobjektträgerJinTong Abteilung für Labor- und Gerätemanagement, Haimen N/Akundenspezifisch
H2O2 (30%)Chinesisches Pharm10011218
H2SO4Chinesisches Pharm80120892
HEPESSigma51558
MagnetSTEMCELL18000
Mesh NylonsiebBD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/Aim Labor kloniert
Maus CD25 Treg-Zellen positive IsolationskitSTEMCELL18782Komponente: FcR Blocker, Regulatory T-Zellen Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Maus CD4+ Tcell IsolationskitSTEMCELL19852Komponente:CD4+T-Zellisolierung Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rattenserum
NaOHLanyi chemische Produkte Co., LTD? Beijing1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PE Auswahl CocktailSTEMCELL18151
Penicillin-StreptomycinHycloneSV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
Polystyrol Mikrosphären 6,0μ mPolysciences07312-5
Polystyrol RundbodenröhrchenBD Falcon352054
RattenserumSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
Rekombinantes humanes Interleukin-2Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Lysepuffer für rote BlutkörperchenBeyotimeC3702
Regulatorischer T-Zell-PositivselektionscocktailSTEMCELL18782C
RPMI 1640LebenC11875500BT
ProbenkammerHausgemacht
Streptavidin-beschichtete magnetische PartikelSTEMCELL50001
TransfektionskitClontech631318
Trypsin 0,25 % EDTALife25200114
PinzetteJDN/A
NameCompanyKatalognummer< strong>Kommentare
Ausrüstung
20x Objektiv NA 0,8Zeiss420650-9901Plan-Apochromat
RasterkraftmikroskopJPKcellHesion200
ZentrifugeBeckman-ScharAllegra X-12R
Fluoreszenzbildgebunghausgemachtes objektives Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop auf Basis eines Zeiss-Mikroskopstativs
Befeuchteter CO2 InkubatorThermo FisherHERACELL 150i
Inverses LichtmikroskopZeissObserver A1 Handbuch

Referenzen

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