Method Article

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

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1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Abstract

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Die auf Atomkraftmikroskopie basierende Einzelkraftspektroskopie (AFM-SCFS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungsstärken und -dynamiken auf einer lebenden Zellmembran, einschließlich der zwischen Zellen, Rezeptoren und Liganden, und neben vielen anderen Variationen. Es funktioniert auch als Mechanismus, um einen physikalischen oder biochemischen Stimulus auf einzelne Zellen in einer raumzeitlich kontrollierten Weise zu liefern, so dass bestimmte Zellaktivierung und nachfolgende zelluläre Ereignisse in Echtzeit überwacht werden können, in Kombination mit Live-Zell Fluoreszenz-Bildgebung. Der schlüsselfertige Schritt bei diesen AFM-SCFS-Messungen ist die AFM-Auslegerfunktionierung, oder mit anderen Worten, die Anfügung eines Interessenten an den Ausleger. Hier stellen wir Methoden zur Modisierung von AFM-Auslegern mit einer einzelnen T-Zelle bzw. einer einzelnen Polystyrolperle für immunologische Studien vor. Erstere beinhaltet einen biokompatiblen Klebstoff, der einzelne T-Zellen an die Spitze eines flachen Auslegers in einer Lösung koppelt, während letzterer auf einem Epoxidkleber für die Einzelperlenhaftung in der Luftumgebung beruht. Zwei immunologische Anwendungen, die mit jeder Auslegermodifikation verbunden sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Die hier beschriebenen Methoden lassen sich leicht an verschiedene Zelltypen und Feststoffpartikel anpassen.

Introduction

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Atomkraftmikroskopie (AFM), ein vielseitiges Werkzeug, hat viele Anwendungen in der Zellbiologie Forschunggefunden 1,2,3,4,5. Neben der hochauflösenden Bildgebungsfunktion ermöglicht die native Kraft-Probing-Funktion die direkte Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen direkt vor Ort auf der einzelzelligen Ebene6,7. Dazu gehören die Steifigkeiten subzellulärer Strukturen oder sogar ganzer Zellen8,

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Protocol

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Das Maus-Experiment-Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien der Tsinghua University

1. Auslegerfunktionalisierung mit einzelnen T-Zellen

  1. Maus Milzzellen Vorbereitung
    1. Opfern Sie die Maus (8-16 Wochen alt (entweder Geschlecht); z.B. C57BL/6 Stamm) mit Kohlendioxid, gefolgt von Zervixdislokation.
    2. Reinigen Sie die Maus mit 75% Ethanol und machen Sie einen Mittellinien-Hautschnitt gefolgt von Splenektomie.
    3. Homogenisieren Sie die Milz in 4 ml PBS mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) mit Glasschlitten und entfernen Sie Aggregate und Schmutz, indem Sie die Zellsuspension durch ein 70 m mesh Nylon Sieb passieren....

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Results

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Abbildung 4A zeigt typische Kraft-Distanz-Kurven aus der Bindungsinteraktion zwischen Einzel-T-Zelle und Single-DC in einem Annäherungszyklus. Die hellrote Kurve ist die Verlängerungskurve und die dunkelrote die Rückzugskurve. Da die Verlängerungskurve typischerweise für Einzugoder Steifigkeitsanalysen verwendet wird, betrifft hier nur die Rückzugskurve die Zellhaftung. Der Mindestwert (der grüne Kreis) in der Kurve gibt ein Maß für die maximale Haftkraft an........

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Discussion

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Die AFM-basierte Einzelkraftspektroskopie hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biophysikalischen Eigenschaften lebender Zellen zu adressieren. Für diese Anwendungen muss der Ausleger ordnungsgemäß funktionalisiert werden, um bestimmte Wechselwirkungen oder Eigenschaften auf den von Interesse wichtigen Zellen zu untersuchen. Hier werden die Methoden zur Kopplung einzelner T-Zellen und einzelner Mikron-Großer Perle an den spitzenlosen Ausleger beschrieben. Um eine einzelne T-Zelle am Ausleger zu b.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) und Innovative Research Group Program (81621002) unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
10 μ l PipettenspitzeThermo Fisher104-Q
15 ml TubeCorning430791
6 cm Durchmesser KulturschaleNALGENE nunc150462
6-Well-KulturplatteJETTCP011006
AFM CantileverNanoWorldArrow-TL1-50spitzenloser Cantilever
β-MercaptoethanolSigma7604
Biokompatibler KleberBD Cell-Tak354240
CD4+ T-Zell-Isolierung CocktailSTEMCELL19852C.1
DC2.4 ZelllinieEin Geschenk von K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-beschichtete magnetische PartikelSTEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
EpoxyERGO7100
Ethanoltwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR BlockerSTEMCELL18731
Glasdeckglaslokaler Verkäufer (Hai Men Lian Sheng)HX-E3724mm Durchmesser, 0,17mm Dünnheit
GlasobjektträgerJinTong Abteilung für Labor- und Gerätemanagement, Haimen N/Akundenspezifisch
H2O2 (30%)Chinesisches Pharm10011218
H2SO4Chinesisches Pharm80120892
HEPESSigma51558
MagnetSTEMCELL18000
Mesh NylonsiebBD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/Aim Labor kloniert
Maus CD25 Treg-Zellen positive IsolationskitSTEMCELL18782Komponente: FcR Blocker, Regulatory T-Zellen Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Maus CD4+ Tcell IsolationskitSTEMCELL19852Komponente:CD4+T-Zellisolierung Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rattenserum
NaOHLanyi chemische Produkte Co., LTD? Beijing1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PE Auswahl CocktailSTEMCELL18151
Penicillin-StreptomycinHycloneSV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
Polystyrol Mikrosphären 6,0μ mPolysciences07312-5
Polystyrol RundbodenröhrchenBD Falcon352054
RattenserumSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
Rekombinantes humanes Interleukin-2Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Lysepuffer für rote BlutkörperchenBeyotimeC3702
Regulatorischer T-Zell-PositivselektionscocktailSTEMCELL18782C
RPMI 1640LebenC11875500BT
ProbenkammerHausgemacht
Streptavidin-beschichtete magnetische PartikelSTEMCELL50001
TransfektionskitClontech631318
Trypsin 0,25 % EDTALife25200114
PinzetteJDN/A
NameCompanyKatalognummer< strong>Kommentare
Ausrüstung
20x Objektiv NA 0,8Zeiss420650-9901Plan-Apochromat
RasterkraftmikroskopJPKcellHesion200
ZentrifugeBeckman-ScharAllegra X-12R
Fluoreszenzbildgebunghausgemachtes objektives Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop auf Basis eines Zeiss-Mikroskopstativs
Befeuchteter CO2 InkubatorThermo FisherHERACELL 150i
Inverses LichtmikroskopZeissObserver A1 Handbuch

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

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Atomic Force MicroscopySingle Cell Force SpectroscopyAFM Cantilever FunctionalizationT Cell AdhesionPolystyrene Bead AttachmentBiocompatible Glue ApplicationEpoxy Glue MethodDendritic Cell InteractionImmune Synapse FormationForce Distance Curves

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