Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.
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Methodenartikel
Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Cryptosporidium parvum ist eine der Hauptursachen für menschliche Durchfallerkrankungen. Um die Pathologie des Parasiten zu verstehen und effiziente Medikamente zu entwickeln, ist ein In-vitro-Kultursystem erforderlich, das die Bedingungen im Wirt rekapituliert. Organoide, die den Geweben ihrer Herkunft sehr ähnlich sind, sind ideal für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Gewebe-abgeleitete Strukturen, die aus adulten Stammzellen abgeleitet werden und über einen längeren Zeitraum in kulturgemäß wachsen, ohne eine genetische Aberration oder Transformation zu durchlaufen. Sie haben eine gut definierte Polarität mit apikalen und basolateralen Oberflächen. Organoide haben verschiedene Anwendungen in Medikamententests, Bio-Banking, und Krankheitsmodellierung und Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, wie man die Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium für die Infektion menschlicher Darm- und Atemwegsorganoide vorbereitet. Wir zeigen dann, wie Mikroinjektion verwendet werden kann, um die Mikroben in das Organoidlumen zu injizieren. Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen Organoide für Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien verwendet werden können: Mikroinjektion, mechanisches Scheren und Plattieren und durch die Herstellung von Monolayern. Die Mikroinjektion ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Parasitenvolumina und den direkten apikalen Seitenkontakt für die Mikroben. Wir liefern Details für ein optimales Wachstum von Organoiden für die Bildgebung oder Oozystenproduktion. Schließlich zeigen wir auch, wie die neu erzeugten Oozysten aus dem Organoid für die weitere Weiterverarbeitung und Analyse isoliert werden können.
Einleitung
Die Entwicklung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Cryptosporidium-Infektionen wurde durch das Fehlen von In-vitro-Systemen behindert, die die In-vivo-Situation beim Menschen genau nachahmen1,2. Viele der derzeit verfügbaren Systeme erlauben entweder nur eine kurzfristige Infektion (<5 Tage) oder unterstützen nicht den gesamten Lebenszyklus des Parasiten3,4. Andere Systeme, die die vollständige Entwicklung des Parasiten ermöglichen, basieren auf verewigten Zelllinien oder Krebszelllinien, die die physiologische....
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Protokoll
Die gesamte Gewebebehandlung und -resektion wurde im Rahmen der vom Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolle mit Zustimmung des Patienten durchgeführt.
1. Herstellung von C. parvum Oozysten zur Injektion
HINWEIS: Cryptosporidium Oozysten wurden aus einer kommerziellen Quelle gekauft (siehe Tabelle der Materialien). Diese Oozysten werden in Kälbern produziert und in phosphatgepufferter Salin (PBS) mit Antibiotika gelagert. Sie können ca. 3 Monate bei 4 °C gelagert werden und sollten niemals eingefroren werden. Normalerweise verwenden wir Oozysten in....
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Ergebnisse
Die hier vorgestellten Protokolle führen zur effizienten Reinigung von Oozysten und Sporozoiten (Abbildung 1A) bereit für die Mikroinjektion. Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von ca. 70–80% der Oozysten, daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozysten und Schalen durch einen 3-m-Filter herauszufiltern. Die Filtration führt zu einer fast 100% Sporozoitreinigung (Abbildung 1B). Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen Farbstoffs.......
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Diskussion
Kultur von Cryptosporidium Parasiten in Darm- und Atemwegsorganoiden bietet ein genaues Modell, um Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen zu studieren10, hat aber auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel erfordern die aktuellen Methoden zur Auswahl und Verbreitung genetisch veränderter Cryptosporidium-Parasiten die Durchfahrt in Mäuse19, die keine Isolierung von Parasiten zulässt, die für eine In-vivo-Infektion wesentliche Modifikationen aufweisen. Organoidkul.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Deborah A. Schaefer von der School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA, dass sie uns bei der Herstellung und Analyse von Oozysten geholfen hat. Wir danken auch Franceschi Microscopy and Imaging Center und D.L. Mullendore an der Washington State University für die TEM-Vorbereitung und Bildgebung von isolierten organoiden Oozysten.
D.D. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftlich....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Basalmembran-Extrakt (extrazelluläre Matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo Antikörper (Oocyst-spezifischer Antikörper) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Endkonzentration = Verwenden Sie 2-3 Tropfen/Objektträger |
| Crypto-Grab IgM-beschichtete Magnetbeads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 Zahnstange | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 Gepäckträger | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonat-Membranfilter - 3µ m | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Schneller grüner Farbstoff | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Mikroinjektor | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 1 mm | WPI | TW100F-4 | nbsp; |
| Matrigel (extrazelluläre Matrix) | Corning | 356237 | |
| Mikrofugenröhrchen 1,5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-Loader-Spitzen | Eppendorf | 612-7933 | |
| Mikropipettenabzieher P-97 | Verschlussinstrument | P-97 | |
| Normales Eselsserum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Natriumhypoclorit (5% verwenden) | Clorox | 50371478 | |
| Super Stick Slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonat Filterhalter | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholsäure-Natriumsalzhydrat | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield Eindeckmittel | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Endmenge | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL vorrätig in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL vorrätig in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL vorrätig in 500 mL DMEM |
| INTESTINALE ORGANOID-OME (Expansionsmedien) | Endkonzentration | ||
| >A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0,5 & Mikro; M |
| Adv+++ | bis zu 100 mL herstellen | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1,25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | Im Haus* | 10 % | |
| P38-Hemmer (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 &μm; M |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL Medium |
| RSpoI CM | Im Haus* | 20 % | |
| Wnt3a CM | Im Haus* | 50% | |
| Im Haus* - Zellleitungen werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt | |||
| DARM ORGANOID MEDIA-OMD (Differenzierungsmedien) | Zur Differenzierung von Organoiden wurden expandierende Dünndarm-Organoide sechs bis sieben Tage nach der Teilung in einem Wnt-reichen Medium gezüchtet und dann in einem Differenzierungsmedium (Entzug von Wnt, Nicotinamid SB202190, in einem Differenzierungsmedium (Entzug von Wnt, Nicotinamid, SB202190, Prostaglandin E2 aus einem Wnt-reichen Medium oder OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differenzierungsmedium) | Endkonzentration | ||
| Adv+++ | bis zu 100 mL herstellen | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0,0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/ml |
| N-Acetylcystein | Sigma | A9125-25G | 1,25 mM |
| Nicotinamid | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Direkt mit dem Unternehmen Kontakt aufnehmen | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µ M |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2,5 µ m |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Wenden Sie sich direkt an das Unternehmen | 10 |
| %Reduktionspuffer (zur Resuspension von Oozysten und Sporozoiten zur Injektion) | Endkonzentration | ||
| L-Glutathion reduziert | Sigma | G4251-10MG | 0,5 μ g/μ L von OME/OMD/LOM |
| Betain | Sigma | 61962 | 0,5 μ g/μ L von OME/OMD/LOM |
| L-Cystein | Sigma | 168149-2,5G | 0,5 μ g/μ L OME/OMD/LOM |
| Linolensäure | Sigma | L1376-10MG | 6,8 μ g/mL von OME/OMD /LOM |
| Taurin | Sigma T0625-10MG | 0,5 μ g/μ L von OME/OMD/LOM | |
| Blocking Puffer (für die Immunfluoreszenzfärbung) | Endkonzentration | ||
| Esel/Ziegenserum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| Liste der verwendeten Antikörper | |||
| Alexa 568 Anti-Kaninchen | Invitrogen | A-11011 | Verdünnung-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit - Fluorescein-markierter Antikörper Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Verdünnung - 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads - Magnetische Kügelchen beschichtet mit monoklonalen Antikörpern | reaktiv Waterborne, Inc | IMS400-20 | Verdünnung - 1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Verdünnung - 1:1.000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Verdünnung - 1:1.000; RRID: AB_2620155 |
| Kaninchen-Anti-gp15-Antikörper, der von R. M. O' erzeugt wurde Connor (Co-Autor). | Auf Anfrage | Auf Anfrage | Verdünnung - 1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Verdünnung - 1:200 |
Referenzen
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
