Beschrieben hier ist die Verwendung von mehreren hausgemachten Werkzeugen zu übertragen, kühlen, und töten erwachsene Drosophila, sowie Glaskultur Fläschchen zu reinigen und Eier zu sammeln. Diese Werkzeuge sind einfach zu machen und sind ziemlich effizient im Umgang mit Drosophila.
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Methodenartikel
Einfache hausgemachte Werkzeuge, um Fruchtfliegen zu behandeln —Drosophila melanogaster
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist sowohl in der biologischen Forschung als auch in der Biologieausbildung weit verbreitet. Der Umgang mit erwachsenen Fliegen ist häufig, aber schwierig in der Praxis, da erwachsene Fliegen fliegen. Hier wird gezeigt, wie Sie einige einfache und kostengünstige Werkzeuge herstellen, um schwierige Probleme im Umgang mit Drosophilaanzugehen. Löcher in Schaumstopfen werden gemacht und Pipettenspitzen oder Trichter werden in die Löcher eingesetzt. Fliegen bewegen sich dann nur in eine Richtung in die Pipette-Spitze/Trichter-Assemblage, was eine effiziente Kontrolle der Übertragung von erwachsenen Drosophila in oder aus einer Durchstechflasche ermöglicht. Bestehende Protokolle wurden für die Kühlung von Fliegen modifiziert, indem sie in zerkleinertem Eis gekühlt und auf eine kalte, harte Eispackung übertragen werden. Die Eispackung ist mit einem Stück medizinischer Gaze bedeckt, das immobilisierte Fliegen aus dem kondensierten Wasser hält, wenn sie unter einem Stereomikroskop untersucht werden. Die Fliegen werden schließlich zum Zählen und Sortieren eingeschläfert oder durch Mikrowaden entsorgt. Ein flaschenförmiger Käfig wurde auch zum Sammeln von Eiern entwickelt, sowie ein arbeitssparendes Gerät und ein Begleitprotokoll zur Reinigung von Glaskulturfläschchen.
Einleitung
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein Modellorganismus weit verbreitet in der biologischen Forschung und Biologie-Bildung verwendet, um eine breite Palette von Themen1,2zu studieren. Die grundlegenden Probleme des Umgangs mit Drosophila sind die Übertragung von Erwachsenen von der Durchstechflasche in die Durchstechflasche und die Immobilisierung der Fliegen, so dass sie leichter zu handhaben sind, da alle Erwachsenen (mit Ausnahme einiger Mutanten3,4) fliegen können.
Konventionell überträgt ein Forscher Fliegen von einer Durchstechflasche zur anderen, indem er zwei Fläschchen mund-zu-Mund-Propaganda hält, die Fliegen heruntertippt oder Fliegen in eine andere Durchstechflasche fliegen lässt, dann beide Fläschchen trennt und wieder einsteckt4. Offensichtlich erfordert dies, dass das Öffnen von zwei Fläschchen mit dem gleichen Durchmesser, und es ist schwer, die Menge der übertragenen Fliegen zu kontrollieren. In der Zwischenzeit erfordert dies schnelle Hände, um die Arbeit zu erledigen, und die Flucht aus streunenden Fliegen kann zu Problemen für das Labor oder Klassenzimmer führen. Das Hinzufügen von extra jungfräulichen Fliegen oder männlichen Fliegen zu einem bereits vorbereiteten Kreuz ist eine weitere Routineaufgabe in Drosophila-Experimenten. Konventionell müssen Fliegen in der Kreuzdurchstecher immobilisiert werden, bevor zusätzliche Fliegen hinzukommen.
Erwachsene Drosophila werden routinemäßig durch Äther, CO2oder kühlend5anbeäscht. Im Vergleich zur Ether- und CO2-Exposition ist das Kühlen das kostengünstigste Mittel zur Immobilisierung von Erwachsenen Drosophila und der am wenigsten schädliche für die Fliegen und Forscher (vor allem junge Studenten)6,7. Wasser, das sich kontinuierlich auf der kalten Oberfläche kondensiert oder Kammer benetzt die Fliegen. Es ist schwierig, die Phänotypen von Nassfliegen zu bestimmen, und sie können leicht während der Manipulation beschädigt werden8,9. Dies hat verhindert, dass die Kühlmethode immer mehr akzeptiert wird.
Werkzeuge für den Fliegentransfer und ein Verfahren zur Fliegenkühlung wurden zuvor beschrieben10. Hierbei wird eine modifizierte Kühlanästhesietechnik berichtet, die für Drosophila-Experimente sicher, zuverlässig und machbar ist. Ebenfalls in diesem Papier beschrieben sind 1) Methoden zum Töten von Erwachsenen zum Zählen, Sortieren oder Entsorgen, 2) arbeitssparende Geräte und Protokolle zur Reinigung von Glaskulturfläschchen und 3) ein einfacher Käfig zum Sammeln von Eiern. Die leicht zu gestaltenden und kostengünstigen Tools, die hier beschrieben werden, können verwendet werden, um die schwierigen Probleme der Fliegenhandhabung anzugehen, und diese Methoden wurden getestet und haben sich als robust, zuverlässig und für erfahrene Forscher bewährt.
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Protokoll
1. Vorbereiten von Werkzeugen und Zubehör
- Tip/Trichter-Stopper
- Erhalten Sie zwei Schwammstecker (der Durchmesser der Stecker muss etwas größer sein als der Innendurchmesser der Fläschchen, die zum Übertragen von Fliegen verwendet werden). Machen Sie ein Loch in den Zentren der Schwammstopfen mit einem beheizten elektrischen Lötkolben.
- Besorgen Sie sich zwei 1 ml Pipettenspitzen, schneiden Sie eine mit einem scharfen Messer quer zur Hälfte und entsorgen Sie das spitze Ende. Dann 1,5 cm des spitzen Endes von der zweiten Pipettenspitze schneiden. Kleben Sie die Reste der beiden Pipettenspitzen zusammen mit einem Allzweckkleber, um eine längliche Pipettenspitze zu machen (Abbildung 1A).
- Legen Sie einen Trichter und die längliche Pipettenspitze in die Schwammstecker ein, um einen Tip- und Trichterstopfen (nachfolgend T- und F-Stopper genannt) herzustellen und die Pipettenspitze mit einem 100-L-Mikrozentrifugenrohr zu verschließen (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Länge des Trichterstiels muss größer als die Höhe des Steckers sein. Wenn es kürzer als oder gleich der Höhe des Steckers ist, dann entweichen Fliegen aus der Stammöffnung. Das Ende des Trichterstiels sollte mindestens 2 cm über der Oberfläche des Kulturmediums oder dem Boden einer leeren Durchstechflasche liegen. Kleine Trichter (z.B. Scheibendurchmesser <60 mm) mit kleinen innenstieligen Öffnungsdurchmessern (<5 mm) sind vorzuziehen. Zur Herstellung eines F-Stoppers kann entweder ein Glas oder ein Kunststofftrichter verwendet werden. Für Biologieklassen sind Kunststofftrichter jedoch vorzuziehen, da sie weniger leicht brechen als Glastrichter.
- Mikrosezierende Nadeln
- Erhalten Sie mechanische Bleistifte, die sich in der Hand wohlfühlen, und Insektenstifte, die den Durchmessern (z. B. 0,5 mm, 0,7 mm) ihrer Bleiminen entsprechen.
- Schneiden Sie die breiten Enden der Insektenstifte mit einer Zange und legen Sie den Schnitt flach. Ersetzen Sie die Leitung durch die Stifte (Abbildung 1B). Drücken Sie die Klicktaste und füttern Sie 0,5–1 cm eines Stifts, um eine Sezierung durchzuführen. Reinigen Sie den Stift und schieben Sie ihn nach einer Sezieraktivität vollständig wieder in die Bleistiftwelle, um ihn für jede Person sicher zu handhaben.
HINWEIS: Mikrosezierende Nadeln sind nicht nur bei Dersektionen von Organen wie Larvenspeicheldrüsen nützlich, sondern auch beim Zählen und Sortieren von toten erwachsenen Fliegen.
- Harte Eispackungen
- Erhalten Sie mehrere wiederfreibare harte Eispackungen (große Eispackungen sind vorzuziehen). Abbildung 1C zeigt ein gut funktionierendes Eispaket, das 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm misst und die Ober- und Unterseite hat, die vollständig flach sind.
- Schneiden Sie medizinische Gaze (nichtsteril) in Stücke, die etwas kleiner als die kalten Oberflächen der Eispackungen sind, die sie bedecken. Beispielsweise ist ein Stück medizinischer Gaze, das etwas kleiner als 26,5 cm x 14,5 cm ist, vorzuziehen, um eine eispackung zu bedecken, die in Abbildung 1Cdargestellt ist.
HINWEIS: Das notwendige Zubehör für diese Kühlwerkzeuge sind: eine Eisbox (wir verwendeten eine 25 cm x 15 cm x 15 cm Schaumstoffbox für eine Person und 37 cm x 28 cm x 20 cm Box für mehr als eine Person), die verwendet wird, um zerkleinertes Eis zu speichern; eine Feinpunkt-Pinzette, die verwendet wird, um gekühlte Fliegen an ihren Flügeln zu greifen und sie in eine Durchstechflasche zu übertragen; ein Paar schützende Arbeitshandschuhe, mit denen gekühlte Eispackungen aus einem Gefrierschrank von -20 °C entnehmen werden; und Kunststofffolie, die zur Abdeckung der Bühne eines Stereomikroskops verwendet wird.
- Drosophila Ei Sammlung Käfig
HINWEIS: Fertige Drosophila Eiersammelkäfige sind bei vielen Biotechnologie-Unternehmenerhältlich 11. Beschrieben wird hier ein kleiner Acryl-Flaschen-Ei-Sammlungskäfig für 60 mm Petrischalen (Abbildung1D links; das Käfigdesign ist in der Mitte dargestellt). Es kann für andere Petrischalengrößen (z.B. 100 mm, 35 mm) angepasst werden. Dies ermöglicht die Übertragung von Fliegen in den oder aus dem Käfig mit Leichtigkeit. Ein einfacher Käfig kann wie folgt zubereitet werden.- Verwenden Sie einen Druckmesser, um eine Soft-Kunststoff-Getränkeflasche (500 ml, Innendurchmesser ca. 65 mm) in ein ungefähres Verhältnis von 2:1 (spitzes Ende: stumpfes Ende) zu schneiden und das stumpfe Ende zu verwerfen.
- Wickeln Sie einen Streifen Kartenpapier um eine Apfelsaftplatte (Innendurchmesser 60 mm) mit Klebeband [die Apfelsaftplatte wird verwendet, um Eier zu sammeln (Abbildung 1E, rechts)].
- Schnurloser Schlauchbürstentreiber
- Erhalten Sie einen Akku-Bohrer (max. Geschwindigkeit = 500 Rpm).
- Erhalten Sie eine Rohrbürste, die Borsten an den Seiten sowie an der Vorderseite hat. Idealerweise sollte der Durchmesser der Bürste etwas größer sein als der Durchmesser der zu reinigenden Kulturfläschchen. Schneiden Sie das Ende des Griffs, damit er in das Bohrfutter eingesetzt werden kann (Abbildung 1D).
HINWEIS: Das notwendige Zubehör für diese Reinigungswerkzeuge sind Edelstahlschwämme und lange Manschettengummihandschuhe.
2. Transfer von Erwachsenenfliegen von Vial A nach Vial B
HINWEIS: Die Übertragung von erwachsenen Fliegen von einer Durchstechflasche in eine andere ist die häufigste Praxis, die in Drosophila-Experimenten durchgeführt wird [z.B. die Übertragung von Fliegen von der alten Kultur (A) auf die frische Kultur (B) oder von einer Kreuzdurchstechflasche (A) auf leere Durchstechflasche (B)] zur Anästhesisierung. Das hier beschriebene Protokoll kann für alle Aktivitäten zur Übertragung von Erwachsenenfliegen verwendet werden. Sofern nicht anders angegeben, wird dieses Protokoll verwendet, um Fliegen von Durchstechflasche A auf Durchstechflasche B in diesem Papier zu übertragen.
- Überprüfen Sie den Stiel des Trichters eines F-Stoppers und die Pipettenspitze eines T-Stoppers sorgfältig, und löschen Sie dann alle Fliegen, die in den Stopfen verbleiben, mit einem Gummiluftgebläse. Dieser Schritt ist von größter Bedeutung, insbesondere wenn ein Satz von T- und F-Stoppern für die kontinuierliche Übertragung verschiedener Drosophila-Linien verwendet wird.
- Tippen Sie auf die Fliegen in der Durchstechflasche A und ersetzen Sie den Stecker durch einen T-Stopper, dann stecken Sie die Durchstechflasche B mit einem F-Stopper.
- Durchstechflasche A über Durchstechflasche B umkehren, das Pipettenspitzenende des T-Stoppers in die Trichteröffnung des F-Stoppers einsetzen, die Kante der invertierten Durchstechflasche A klopfen, damit Fliegen aus der Pipettespitze und durch den Stiel des Trichters rutschen können, und in die Durchstechflasche B fallen. Wenn ein altes Essen in der Durchstechflasche A weniger kompakt wird, kann es fallen, wenn die Durchstechflasche A invertiert und geklopft wird. In einer solchen Situation, invertieren Durchstechflasche B über Durchstechflasche A und lassen Sie die Fliegen in Durchstechflasche B kriechen.
- Trennen Sie den T-Stopper vom F-Stopper. Kappen Sie das Pipettenspitzenende des T-Stoppers mit einem 200-L-Mikrozentrifugenrohr, wenn die verbleibenden Fliegen in durchstecherungsmittel A kurzzeitig auf andere Fläschchen übertragen werden müssen; Andernfalls entfernen Sie den T-Stopper und stecken Sie die Durchstechflasche A wieder ein. Entfernen Sie den F-Stopper und stecken Sie die Durchstechflasche B wieder ein.
3. Immobilisieren von Fliegen durch Chillen
- Halten Sie harte wiederfreibare Eispackungen in einem -20 °C Gefrierschrank für mindestens 24 h vor Gebrauch auf.
- Legen Sie eine gekühlte, harte Eispackung bei Raumtemperatur (RT) für 20 min. Etwas befeuchten Sie ein Stück nicht-aseptische medizinische Gaze mit etwas fließendem Wasser und lassen Sie es eng an der Oberfläche der Eispackung zu haften. Die medizinische Gaze kann beim nächsten Fliegenkühlen wiederverwendet werden. Gleichzeitig eine leere Durchstechflasche in zerkleinertem Eis abkühlen lassen.
- Transfer erwachsene Fliegen, die immobilisiert werden müssen, in die gekühlte leere Durchstechflasche (CEV). Wenn die beiden Transferfläschchen getrennt sind, bedecken Sie den CEV mit einer Petrischale oder einem Stecker und klopfen Sie den CEV gegen das zerkleinerte Eis, um alle Fliegen im CEV nach unten zu tippen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis alle Fliegen immobilisiert sind. Die Fliegen werden innerhalb von 30 s immobilisiert. Als nächstes legen Sie den CEV für 1 min ins Eis. Es ist nicht ratsam, zu viele Fliegen auf einmal zur Anästhesisierung zu übertragen.
- Gießen Sie die gekühlten Fliegen auf die medizinische Gaze, die die Eispackung bedeckt. Verteilen Sie die überlappenden Fliegen mit einem Pinsel und stellen Sie sicher, dass jede Fliege durch die kalte Oberfläche des Eispakets gekühlt werden kann. Wenn ein gekühlter harter Eispackung leicht anschwillt, legen Sie ihn auf ein Handtuch und arbeiten Sie auf seiner flachen Seite.
- Entfernen Sie die Bühnenclips aus dem Stereomikroskop, bedecken Sie die Bühne mit einem Stück Plastikfolie und legen Sie den Eissack auf die Bühne. Schalten Sie das obere Licht ein (eine kaltlichte Quelle ist wünschenswert), fokussieren Sie das Stereomikroskop und bewegen Sie den Eissack, bis die gekühlten Fliegen deutlich zu sehen sind.
4. Töten von erwachsenen Fliegen zum Zählen, Sortieren oder Entsorgen
- Transfer Erwachsene fliegt in eine leere Durchstechflasche und bedecken Sie sie mit einer Petrischale.
- Invertieren Sie die Durchstechflasche, erhitzen Sie sie für 1 min + 20 s in einer Mikrowelle, und lassen Sie die toten Fliegen in die Petrischale fallen.
- Tragen Sie Schutzhandschuhe an und nehmen Sie die Durchstechflasche aus der Mikrowelle. Gießen Sie die toten Fliegen auf eine weiße Papierkarte, zählen oder untersuchen Sie die Fliegen mit einer Mikrosezierender Nadel unter einem Stereomikroskop und entsorgen Sie die Fliegenkörper nach Beobachtung in einer Mülltonne.
- Um unerwünschte Fliegen zu töten, erhitzen Sie die Fliegen für 2-3 min in einer Mikrowelle, dann tippen Sie die Kadaver in eine Mülltonne.
HINWEIS: Es ist nicht ratsam, einige flügelmutende Stämme (z.B. Flügellängenmutanten) zur Untersuchung zu töten, da es schwierig ist, von den Kadavern zu beurteilen, wenn die Flügel über die Spitze des Bauches hinausreichen, was bei Wildfliegen zu beobachten ist.
5. Übertragen von Fliegen in/ aus flaschenförmigen Eier-Sammlung Käfig
HINWEIS: Wie bereits erwähnt, werden T- und F-Stopper verwendet, um Fliegen in den und aus dem Eiersammelkäfig zu übertragen. Fliegen müssen während dieses Prozesses nicht beästhetisiert werden. Weitere Details, wie die Zubereitung des Apfelsaftmediums, die Eiersammlung und die Dechorionisierung, finden Sie in der Literatur12.
- Legen Sie den Eiersammelkäfig in den Apfelsaftteller oder montieren Sie den Apfelsaftteller in den Käfig aus einer Softdrinkflasche. Versiegeln Sie das Gelenk um die beiden Komponenten mit einem Streifen Paraffinfolie.
- Legen Sie so viele Fliegen wie möglich in den Käfig und stecken Sie den Käfig nach dem Übertragen der Fliegen mit einem Schaumstoffstopfen wieder ein.
- Um die Nahrung für Fliegen im Käfig zu ändern, übertragen Sie die Fliegen im Käfig in eine leere Durchstechflasche.
- Ersetzen Sie die Apfelsaftplatte und versiegeln Sie sie erneut, und übertragen Sie die Fliegen dann von der Durchstechflasche zurück in den Käfig.
- Wenn die Eiersammlung endet, übertragen Sie die Fliegen in eine leere Durchstechflasche und übertragen Sie sie in Kulturfläschchen.
6. Reinigung Glas Kultur Fläschchen
HINWEIS: Im Allgemeinen enthält eine alte Kulturdurchstecher lebende Fliegen. In dem hier beschriebenen Protokoll müssen diese Fliegen NICHT vor der Reinigung getötet werden, es sei denn, es handelt sich um transgene Fliegen.
- Entfernen Sie alle permanenten Markertinten aus den Glaskulturfläschchen mit nassen, rostfreien Stahlschwämmen.
-
Die Kulturfläschchen im fließenden Wasser einweichen.
- Füllen Sie ein Laborspülbecken mit Wasser, fügen Sie flüssige Geschirrspülseife in das Wasser, und mischen.
- Tauchen Sie die Kulturfläschchen in das Wasser ein, dann entfernen Sie den Stecker, so dass das Wasser in die Durchstechflasche laufen kann. Das Geschirrwaschmittel im Wasser lässt alle verbleibenden erwachsenen Fliegen auf den Boden sinken und im Wasser ertrinken.
- Die alten Kulturfläschchen mindestens 30 min im Wasser einweichen.
- Lösen Sie das Futter des Bohrers, legen Sie die Reagenzbürste ein und ziehen Sie das Futter wieder fest. Überprüfen Sie die Richtung des Rotationsselektors, und stellen Sie sicher, dass sich der Bohrer im Uhrzeigersinn dreht. Stellen Sie den Geschwindigkeitsauslöser ein und stellen Sie sicher, dass die maximale Geschwindigkeit weniger als 500 U/min beträgt.
-
Reinigen Sie die Kulturfläschchen.
- Reinigen Sie die Kulturfläschchen grob.
- Legen Sie einen langen Manschettengummihandschuh auf die nicht-dominante Hand und halten Sie die Durchstechflasche im Wasser.
- Halten Sie den Akku-Rohrbürstentreiber mit der bloßen dominanten Hand, drücken Sie den Pinsel in die Kultur-Fläschchen und drücken Sie den Auslöser.
HINWEIS: Tauchen Sie die Batterie nicht ins Wasser. Die rotierende Bürste zerbricht alte Lebensmittel, Pupa usw. und entfernt mehr als 95% des Abfalls. - Den Abfall in eine separate Mülltonne kippen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Abfalls in jeder Durchstechflasche gereinigt wurde.
- Reinigen Sie die Kulturfläschchen gründlich.
- Reinigen Sie die Rohrbürste, entleeren sie und reinigen Sie das Waschbecken, und füllen Sie es mit sauberem Wasser auf.
- Entfernen Sie die Restabfälle aus jeder Kulturdurchstechflasche, wie in Abschnitt 6.4.1 beschrieben.
- Reinigen Sie die Kulturfläschchen grob.
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Ergebnisse
Die T- und F-Stopper wurden als eine Reihe einfacher Werkzeuge entwickelt, die angepasst und in jeder Fliegenübertragung eingesetzt werden können. Das Übertragen von Fliegen aus einer alten Kultur in mehrere frische Kulturen beinhaltet das Entfernen der Stecker der frischen Fläschchen, deren Austausch durch F-Stopper, das Abklopfen der Fliegen in der alten Durchstechflasche, das schnelle Entfernen des Steckers und das Ersetzen durch einen T-Stopper. Wenn das alte Essen kompakt ist, dann i...
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Diskussion
Einige hausgemachte Werkzeuge für den Umgang mit grundlegenden Aktivitäten in Drosophila Aufzucht und Experimente beteiligt sind in diesem Papier beschrieben. Diese Werkzeuge sind einfach, aber ziemlich effektiv. Praktisch kann jedes Labor diese Werkzeuge mit Leichtigkeit herstellen, und ein Forschungs- oder Lehrlabor muss keine vorgefertigte Alternative finden, die vielleicht nicht lokal verfügbar ist.
Fliegentransfer ist die häufigste Praxis und eine schwierige Aufgabe in Drosop...
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Offenlegungen
Der Autor hat nichts zu verraten.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Eine Zange | |||
| Akku-Bohrschrauber | Maximale Drehzahl: 500 U/min | ||
| Elektrischer Lötkolben | |||
| Feilentrichterdurchmesser | |||
| der Scheibe< 60mm | |||
| Eisbox | |||
| Insektenstifte | |||
| Infrarot-Thermometer | HCIYET HT-830 | ||
| mit langer Manschette | |||
| Druckbleistifte Medizinische | |||
| Gaze | |||
| Mikrozentrifugenröhrchen | 100 ul | ||
| Mikrowellenherd | |||
| Parafilm | |||
| Perischale | Innendurchmesser 60 mm | ||
| Pipettenspitzen | 1 ml | ||
| Kunststofffolie | |||
| Perischale | & Phi; 36 mm zum Abdecken des leeren Fläschchens | ||
| Punktpinzette | |||
| Arbeitsschutzhandschuhe | |||
| Wiedereinfrierbare Harteisakkus | 26,5 Mal; 14,5 x 2,5 cm oder größer | ||
| Gummi-Luftgebläse | |||
| Schnappschneider | |||
| Softdrinkflasche | 500 ml, Innendurchmesser ca. 65 mm | ||
| Schwammstopfen | |||
| Edelstahlschwämme | |||
| Röhrenbürste | |||
| Vial | & Phi; 34 mm & mal; 90 mm |
Referenzen
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