Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung

Summary

In diesem Manuskript wird die Implementierung eines stimulierten Raman-Streumikroskops (SRS) beschrieben, das durch die Integration eines SRS-Experimentalaufbaus mit einem Laser-Scanning-Mikroskop gewonnen wurde. Das SRS-Mikroskop basiert auf zwei Femtosekunden (fs) Laserquellen, einem Ti-Sapphire (Ti:Sa) und einem synchronisierten optischen parametrischen Oszillator (OPO).

Abstract

Stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) verwendet Nahinfrarot-Anregungslicht; Daher hat es viele mikroskopische Bildgebungseigenschaften mit mehreren Photonen. Die SRS-Bildgebungsmodalität kann mit kommerziellen Laser-Scanning-Mikroskopen erreicht werden, indem ein nicht gescannter Vorwärtsdetektor mit richtigen Bandpassfiltern und einem Lock-in-Verstärker (LIA)-Erkennungsschema ausgestattet wird. Ein schematisches Layout eines typischen SRS-Mikroskops umfasst Folgendes: zwei gepulste Laserstrahlen (d. h. die Pumpe und sonde, die in einem Rastermikroskop gerichtet sind), die sowohl in Raum als auch Zeit auf der Bildebene überlappen und dann durch ein Mikroskopobjektiv in das Beispiel durch zwei Scanspiegel (SMs), die den Brennpunkt über eine x-y-Ebene rastern. Nach Interaktion mit der Probe werden die übertragenen Ausgangsimpulse durch ein oberes Objektiv erfasst und durch ein Vorwärtsdetektionssystem gemessen, das in ein invertiertes Mikroskop eingesetzt wird. Pumpenimpulse werden durch einen Stapel optischer Filter entfernt, während die Sondenimpulse, die das Ergebnis des SRS-Prozesses im Brennvolumen der Probe sind, mit einer Photodiode (PD) gemessen werden. Die Auslesung der PD wird von der LIA demoduliert, um die Modulationstiefe zu extrahieren. Ein zweidimensionales (2D) Bild wird durch Synchronisieren der Vorwärts-Erkennungseinheit mit der Mikroskop-Scaneinheit erhalten. In diesem Beitrag wird die Implementierung eines SRS-Mikroskops beschrieben und erfolgreich demonstriert, ebenso wie die Meldung von etikettenfreien Bildern von Polystyrolperlen mit Durchmessern von 3 m. Es ist erwähnenswert, dass SRS Mikroskope nicht kommerziell erhältlich sind, so dass, um diese Eigenschaften zu nutzen, die hausgemachte Konstruktion die einzige Option ist. Da die SRS-Mikroskopie in vielen Bereichen immer beliebter wird, wird angenommen, dass diese sorgfältige Beschreibung der Implementierung des SRS-Mikroskops für die wissenschaftliche Gemeinschaft sehr nützlich sein kann.

Introduction

In Life-Science-Anwendungen hat sich die SRS-Mikroskopie als leistungsfähiges Werkzeug für die etikettenfreie Bildgebung herauskristallisiert. Die Grundidee der SRS-Mikroskopie besteht darin, die Stärke des Schwingungskontrasts und seine Fähigkeit, Bilder in wenigen Sekunden zu erfassen, zu kombinieren.

SRS ist ein Prozess, bei dem der Frequenzunterschied zwischen zwei Laserstrahlenfrequenzen (Pumpensignal und Stokes-Signal bei unterschiedlichen Frequenzen) mit der molekularen Schwingung einer untersuchten Probe übereinstimmt, wodurch eine stimulierte Raman-Streuung und eine signifikante Erhöhung des Stokes-Signals. Im Gegensatz zur lineare....

Protocol

1. Inbetriebnahme des Lasersystems

1. Prüfen Sie, ob die Temperatur der Kühler bei oder unter 20 °C gehalten wird.
2. Prüfen Sie, ob die Feuchtigkeitskontrolleinheit ordnungsgemäß funktioniert und die Luftfeuchtigkeit bei etwa 40 % gehalten wird.
3. Schalten Sie den Ti:Sa-Laser ein und folgen Sie dabei den Anweisungen im Handbuch.
4. Stellen Sie die Wellenlänge auf 810 nm ein.
5. Schalten Sie den OPO und den angeschlossenen Minicomputer ein. Führen Sie die Anwendung aus, die den OPO-Laser steuert.
6. Wählen Sie Bypass aus, wenn am Ausgang des OPO-Feldes 100 % des Ti:Sa-Laserausgangs erforderlich ist.

Results

Ein Beispiel für die SRS-Messung (d. h. die SRS-Messung an einem einzelnen Punkt der Stichprobe) ist in Abbildung 7dargestellt. Wenn die Balken nicht zeitlich oder räumsfrei überlappen, wird das erhaltene Ergebnis in Abbildung 8adargestellt. Bei Off-Resonanz ist die von LIA gemessene Amplitude des Signals Null, während die von LIA gemessene Signalphase zwischen negativen und positiven Werten springt. Während die Balken im Raum überlappen und die Verzögeru.......

Discussion

Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen gehoben, insbesondere in Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind. Lipide sind an mehreren physiologischen Wegen wie der Produktion biologischer Membranen beteiligt und dienen als biosynthetische Vorläufer und Signalwandler¹⁰. Lipide werden in spezialisierte intrazelluläre Organellen verpackt, auch Lipidtröpfchen (LDs) genannt. Ihre Durchmesser .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisation tool	Nikon	Nikon C2Tool	Acquisation supported tool
APE Pulse Link Control Software	APE-APE	Pulse Link Control Software	Software control Autocorrelator
	APE	APE PulseCheck USB 50	Autocorrelator
Detector	Thorlabs	Thorlabs DET10A	Photodiode
Detector card	Thorlabs	Thorlabs VRC	IR-Detektor Karte
Dichroitischer Spiegel	Semrock Semrock	FF875-Di01-25X36	Dichroitischer Spiegel
Dichroitischer Spiegel	Semrock	FF875-Di01-25x36	Dichroitischer Spiegel
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Pockels-Zelle
Schneller Detektor	Thorlabs	Thorlabs DET025AL/M	Fotodiode
Schnelle Spiegelabtasteinheit	Nikon	C2	Microscpe Abtastkopf
Femtosekundenlaser Ti:SA	Coherent	Coherent Chameleon Ultra II	Chameleon Ultra II
Funktionsgenerator	TTi	TG5011 AIM – TTi	Funktionsgenerator
Inverses optisches Mikroskop	Nikon	Eclipse TE-2000-E,	Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier	Standford Research System	SR844-200 MHz Dual-Phase	A Lock-in Verstärker von Stanford Research Systems
Kerbfilter,	Semrock	NF03-808E-25	Notch
Filter Optische Verzögerungsleitung	Newport	Newport M-ILS200CC	Abstimmbare optische Verzögerungsleitung
Optischer parametrischer Oszillator	Kohärent	Kohärent Kompakt OPO	Kohärent Kompakt OPO
Oszilloskop	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Digitales Oszilloskop
PCI-Karte	Nationales Instrument	NI PCIe 6363	Datenerfassungskarte
Positionssensoren Detektoren	Newport	Newport Conex PSD9	Sensor für Positionsdetektor
Leistungsmesserkopf	Coherent	PowerMax PM10,	Laserleistungsdetektor
Translationstische	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Mechanischer Translationstisch mit Standard-Mikrometer