Method Article

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

DOI:

10.3791/59617

⸱

June 19th, 2019

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1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

In This Article

Summary

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Abstract

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In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.

Introduction

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In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfer....

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Protocol

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Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.

1. Ernte Maus Knochenmark (BM)

  1. Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-Nagetier-Chow-Diät und beherbergen Sie sie in Mikroisolatorkäfigen in einer pathogenenfreien Anlage.
  2. Verwenden Sie männliche Mäuse, 6-10 Wochen al....

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Results

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Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.

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Discussion

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In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwere Met.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken dem LJI Flow Cytometry Kern für die Unterstützung bei der Massenzytometrie. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01HL134236, P01HL136275 und R01CA202987 (alle an C.C.H) und ADA7-12-MN-31 (04) (zu C.C.H. und Y.P.Z) unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CyTOF Antikörper (Maus)
Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) -89YFluidigmCat# 3089005B
Anti-Mensch/Maus CD45R/B220 (Klon RA36B2)-176YbFluidigmCat# 3176002B
Anti-Maus CD105 (Klon MJ7/18)-gereinigtBiolegendCat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-Maus CD115 (CSF-1R) (Klon AFS98)-gereinigteBiolegendeKat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Maus CD117/c-kit (Klon 2B8)-166ErFluidigmKat# 3166004B
Anti-Maus CD11a (Klon M17/4)-gereinigtBiolegendKat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Maus CD11b (Klon M1/70)-148NdFluidigmKat# 3148003B
Anti-Maus CD11c (Klon N418)-142NdFluidigmKat# 3142003B
Anti-Maus CD127 (IL-7Rα) (Klon A7R34)-MaxPar ReadyBiolegendKat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Maus CD150 (Klon TC1512F12.2)-167ErFluidigmCat# 3167004B
Anti-Maus CD16.2 (Fcγ RIV) (Klon 9E9)-gereinigteBiolegendeKat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Maus CD162 (Klon 4RA10 (RUO)) - gereinigtBD BiosciencesCat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-Maus CD169 (Siglec-1) (Klon 3D6.112)-gereinigteBiolegendeKat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-Maus-CD182 (CXCR2) (Klon SA044G4)-gereinigteBiolegendeKat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-Maus-CD183 (Klon CXCR3-173)-gereinigteBiolegendKat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-Maus CD335 (NKp46) (Klon 29A1.4)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-Maus CD34 (Klon MEC14.7)-gereinigteBiolegendCat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-Maus CD41 (Klon MWReg30)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Maus CD43 (Klon S11)-146NdFluidigmKat# 3146009B
Anti-Maus CD48 (Klon HM48.1)-156GdFluidigmKat# 3156012B
Anti-Maus CD62L (Klon MEL-14)-MaxPar ReadyThermoFisherKat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-Maus CD71 (Klon RI7217)-GereinigteBiolegendKat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-Maus CD90 (Klon G7)-gereinigteBiolegendCat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Maus F4/80 (Klon BM8)-159TBFluidigmCat# 3159009B
Anti-Maus Fcε RIα (Klon MAR-1)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-Maus-GM-CSF (MP1-22E9 (RUO)) - gereinigtBD BiosciencesCat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Maus I-A/I-E (Klon M5/114.15.2)-174YbFluidigmKat# 3174003B
Anti-Maus Ki67 (Klon B56 (RUO))-gereinigtBD BiosciencesKat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) (Klon D7)-169TmFluidigmKat# 3169015B
Anti-Maus Ly6B (Klon 7/4)-GereinigterAbcamKat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-Maus Ly-6G (Klon 1A8)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Maus NK1.1 (Klon PK136)-165HoFluidigmKat# 3165018B
Anti-Maus Siglec-F (Klon E50-2440 (RUO))-gereinigtBD BiosciencesKat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Maus TCRβ (Klon H57-597)-143NdFluidigm(Klon H57-597)-143Nd
Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen (Klon TER-119)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
Antikörper-StabilisatorCANDOR BioscienceCat# 130050
RinderserumalbuminSigma-AldrichCat# A4503
Cisplatin-194PtFluidigmCat# 201194
eBioscience 1x Erythrozyten-LysepufferThermoFisherCat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-SetThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ Vier-Element-KalibrierperlenFluidigmCat# 201078
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)ThermoFisherCat# AM9260G
Fötales RinderserumOmega ScientificCat# FB-02
HyClone Phosphat gepufferte KochsalzlösungGE LifesciencesCat#SH30256.01
Intercalator-IrFluidigmCat# 201192B
MAXPAR AntikörpermarkierungskitsFluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
ParaformaldehydSigma-AldrichCat# 158127
NatriumazidSigma-AldrichCat# S2002
Triton  X-100Sigma-AldrichCat# X100
Trypsin EDTA 1xCorningCat# 25-053-Cl
Experimentelles Modell: Organismus/Stämme
Maus: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryBest.-Nr.: 000664
Software Alogrithm
Bead-based NormalizerFinck et al., 2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankCytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0Chen et al., 2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten und Hinton, 2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....

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