Method Article

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Abstract

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Die vorgestellten Methoden zeigen Laborverfahren zur Isolierung von Organen von mit dem Zika-Virus infizierten Tieren und zur Quantifizierung der Viruslast. Der Zweck des Verfahrens ist es, virale Titter in peripheren und ZNS-Bereichen der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, um virologische und immunologische Faktoren zu identifizieren, die die Zika-Virusinfektion regulieren. Die gezeigten Organisolationsverfahren ermöglichen sowohl die Fokusbildung der Assay-Quantifizierung als auch die quantitative PCR-Bewertung von viralen Titern. Die schnellen Organisolationstechniken sind für die Erhaltung von Virustiter konzipiert. Die virale Titerquantifizierung durch Fokusbildenden Assay ermöglicht eine schnelle Durchsatzbewertung des Zika-Virus. Der Vorteil des Fokus bildenden Assays ist die Bewertung von infektiösen Viren, die Einschränkung dieses Assays ist das Potenzial für Organtoxizität, die die Nachweisgrenze reduziert. Virale Titer-Bewertung wird mit quantitativer PCR kombiniert, und mit einer rekombinanten RNA-Kopierkontrolle wird die virale Genomkopie-Kopiennummer innerhalb des Organs mit geringer Nachweisgrenze bewertet. Insgesamt bieten diese Techniken eine genaue schnelle Hochdurchsatzmethode für die Analyse von Zika-Virustittern in der Peripherie und ZNS von Zika-Virus infizierten Tieren und können auf die Beurteilung von viralen Tittern in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Infizierten infiziert sind. Krankheitserreger, einschließlich Dengue-Virus.

Introduction

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Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Arbovirus, das zur Familie der Flaviviridae gehört und wichtige neuroinvasive menschliche Krankheitserreger wie das Powassan-Virus (POWV), das japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das West-Nil-Virus (WNV)1umfasst. Nach seiner Isolierung und Identifizierung gab es regelmäßig Berichte über humane ZIKV-Infektionen in Afrika und Asien2,3,4,5und Epidemien in Mittel- und Südamerika (überprüft in Referenz6). Jedoch, Es war nicht bis vor kurzem, dass ZIKV gedacht wurde, um schwere Krankheit verursachen7. Jetzt gibt es Tausende von Fällen von neurologischen Erkrankungen und Geburtsfehlern im Zusammenhang mit ZIKV-Infektionen. Das schnelle Aufkommen von ZIKV hat viele Fragen im Zusammenhang mit: Warum gibt es eine Zunahme der Krankheit schwere, was ist die immunologische Reaktion auf ZIKV-Infektion und gibt es virale und / oder Immun vermittelten Pathologien mit der Zunahme der neurologischen Manifestationen und Geburtsfehler. Es gibt jetzt eine Eile, um die mit ZIKV verbundene Erkrankung des zentralbedingten Nervensystems (ZNS) zu verstehen sowie die Notwendigkeit, die Wirksamkeit der antiviralen Medikamente und Impfstoffe gegen ZIKV schnell zu testen. Vor diesem Hintergrund haben wir Methoden zur schnellen Analyse von ZIKV-Tistern sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS mit hilfe eines ZIKV-spezifischen Fokusbildungs-Assays (FFA) entwickelt.

Kleintiermodelle sind wichtig für das Verständnis des Krankheitsverlaufs und für die frühzeitige Bewertung von Impfstoffen, Therapeutika und Antiviralen. Wir haben Kleintiermodelle für die Untersuchung von Arbovirus-Erkrankungen etabliert, indem wir verschiedene Mausstämme verwenden, um menschliche Infektionen und Schutz vor viralen Krankheitserregernzumodellieren 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Mit Diesen früheren Erfahrungen begannen wir, Techniken zur Bewertung des WNV- und Dengue-Virus, eines verwandten Flavivirus zur Beurteilung von ZIKV-Titer in beiden peripheren Organen sowie des CNS21,23, zu modifizieren. 24. Die Vorteile dieser Methoden gegenüber anderen Assays sind: 1) dass sie die Fähigkeit kombinieren, sowohl periphere als auch ZNS-Organe für die Analyse zu ernten; 2) die Methoden sind anpassungsfähig für die Durchflusszytometrie, für Messungen angeborener und adaptiver Immunantworten, zusammen mit viralen Tittern an demselben Tier im selben Organ; 3) die Erntetechnik ist für die histologische Analyse anpassungsfähig; 4) die ZIKV FFA ist eine schnelle Hochdurchsatzmethode für die virale Titeranalyse; und 5) diese Methoden können auf die Beurteilung von Virustorten in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Krankheitserregern infiziert sind25.

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Protocol

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Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien des St. Louis University Animal Care and Use Committee. SLU ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert.

1. Organisolation

HINWEIS: Das Virus ist bei Raumtemperatur (RT) nicht stabil, so dass die Anzahl der gleichzeitig geernteten Tiere sorgfältig geplant werden muss, um virale Titter zu erhalten.

  1. Infizieren Sie Mäuse mit der gewählten Dosis und Route, basierend auf dem erforderlichen Phänotyp. Für dieses Protokoll, infizieren 8-10 Wochen alten männlichen und weiblichen Typ I Interferon-Rezeptor Mangel (Ifnar1-/-) C57BL/6 Mäuse.
    1. Anästhesisieren Sie Ifnar1-/- Mäuse mit einem Cocktail aus Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Testen Sie den Pedalreflex durch eine feste Zehenprise, um die Anästhesie zu bestätigen. 1 x 105 Fokusbildeinheiten (FFU) von ZIKV subkutan (SC) über das Fußpolster verabreichen.
  2. Bereiten Sie alle Materialien, die für die Ernte am Vortag benötigt werden: 2 Scheren, Zangen und 20 ml 70% Ethanol (EtOH) in einem 50 ml konischen zur Desinfektion von Werkzeugen.
    1. Bereiten Sie Spritzen und Nadeln vor: eine 20 ml Spritze für die Perfusion, 23 G Nadeln (ca. 1 pro Käfig) und 1 ml Spritze mit 25 G Nadel (1 pro 3-5 Maus). Vor dem Wiegen von Rohren Stahlperlen (in Haube) zu 1,5 ml O-Ring-Schraubverschlussrohre (eine für jedes Organ) hinzufügen. Die Rohre müssen für die Homogenisierung geeignet sein.
  3. Bereiten Sie den Tag der Ernte die Materialien für die Perfusion und Organ Einfrieren benötigt.
    1. Füllen Sie einen Eiskübel mit Trockeneis und 70% EtOH, um ein Eisbad zu machen. Bereiten Sie sterile Phosphat gepufferte Saline (PBS) unter der Annahme vor, dass 25-30 ml pro Maus PBS für jede Perfusion 5-10 ml für das Rückenmark benötigt werden). Erhalten Sie Anästhesie, einen Cocktail aus Ketamin und Xylazin, und nehmen Sie 300 L pro Maus an. Legen Sie alle Materialien und alle zusätzlichen Rohre, die für die Durchflusszytometrie usw. erforderlich sind, in einen sekundären Behälter, um sie zur Tieranlage zu transportieren.
  4. Befolgen Sie alle notwendigen Verfahren für die Einreise, einschließlich der An- und Unterrichtung von persönlichen Schutzausrüstungen beim Ein- und Ausfahren in die Tiereinrichtung.
    ACHTUNG: Alle Verfahren sind in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank in einer Laboranlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchzuführen.
  5. Anästhesie verabreichen, 200-500 l, intraperitoneal je nach Größe und Gewicht des Tieres. Wenn Sie allein arbeiten, an ein Tier gleichzeitig anästhesien, um das Töten der Tiere vor der Organernte zu vermeiden.
    1. Bestätigen Sie die Anästhesiedosis, indem Sie die Zehen mit Dereinsdrücken kneifen, um den Pedalreflex zu bewerten. Fahren Sie nicht fort, es sei denn, sie reagieren nicht vollständig. Verwenden Sie Stifte, um die Maus an einer Wachsplatte zu befestizen. An dieser Stelle, douse die Maus in 70% Ethanol, um Haarkontamination in der Organernte Verfahren zu vermeiden
  6. Terminally bluten durch Herzpunktion.
    1. Öffnen Sie das Tier mit der Schere und den Zangen durch die Brusthöhle, um das Herz freizulegen. Sammeln Sie Blut über Herzpunktion (ca. 800 L), dies kann für mehrere Assays einschließlich klinischer Chemie, Hämatologie, Durchflusszytometrie verwendet werden, um antigenspezifische Reaktionen zu erkennen, und in Echtzeit quantitative PCR (qRT-PCR) für die Analyse der viralen Kopiernummer.
    2. Für die virale RNA-Analyse mit qRT-PCR, sammeln Sie Blut in einer EDTA-Röhre, wenn aus Vollblut oder in einem Mikrozentrifugenrohr extrahiert, wenn aus Serum extrahiert. (Für Serum, Spin-Rohr mit maximaler Geschwindigkeit in Zentrifuge, Raumtemperatur, für 20 min und entfernen Serum zu einem separaten Rohr). Fügen Sie der Serumprobe nach der Veredelung ein lineares Polyacrylamid als Träger hinzu. RNA kann dann bei -80 °C analysiert oder gespeichert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt weiterzuverarbeiten.
  7. Füllen Sie die 20 ml Spritze mit PBS bei Raumtemperatur (oder 37 °C) und durchdringen Sie Mäuse, indem Sie die Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel einsetzen. Punktieren Sie das rechte Atrium, damit Blut und PBS austreten können. Verabreichen Sie die PBS langsam, während Sie die Farbe der Leber überprüfen, um zu bestätigen, dass das Tier vollständig durchsetzt ist. Leber sollte von tiefrot zu rosa Lachs Farbe ändern.
    1. Wenn Sie die Organe für die Histologie vorbereiten, lassen Sie die Schmetterlingsnadel an Ort und Stelle und durchdringen Sie dann mit 20 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd. Wenn ja, ist es praktisch, die Spritze mit einem 3-Wege-Stopphahn verbunden zu haben, an dem beide Spritzen befestigt sind, wobei das Ventil ein- und ausgeschaltet wird, während eine Zwischenstation zwischen PBS und PFA wechselt.
  8. Ernteorgane in beschriftete, gewogene Schläuche. Für periphere Organe, folgen Sie einer etablierten Reihenfolge für die Ernte: Leber, Milz, Niere und Lunge.
    1. Nehmen Sie nur einen Lappen aus der Leber; es spielt keine Rolle, welche, aber für alle Experimente immer versuchen, den gleichen Lappen mit der gleichen Größe Stück zu nehmen. In ähnlicher Weise, für Nieren und Lunge, nehmen Sie die gleiche Niere und Lunge. Wenn auch die Durchflusszytometrie abgeschlossen werden soll, kann jedes Organ halbiert werden. Bewahren Sie die Hälfte für zytometrie im Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) bei Raumtemperatur auf, bis die Ernte abgeschlossen ist.
    2. Unmittelbar nach der Ernte jedes Organ in ein markiertes Rohr geben und in das Trockeneisbad legen. Virus-Titer reduziert sich im Laufe der Zeit bei Raumtemperatur, so dass die Zeit, die es braucht, um Organe zu ernten, extrem wichtig ist. Es muss Konsistenz zwischen Mäusen geben, daher ist nach der Sicherheit die nächste Priorität die Geschwindigkeit.
      HINWEIS: Wenn Organe für virale Titer geerntet werden, ist es sehr hilfreich, an dieser Stelle eine zweite individuelle Ernte des Gehirns zu haben, um virale Titter zu erhalten.
  9. Entfernen Sie die restlichen Organe aus der Mauskörperhöhle, um Zugang zur Wirbelsäule und zum Schädel zu erhalten.
    1. Entfernen Sie die Maus vom Brett und entfernen Sie das Fell, gefolgt von der Entfernung der Arme und Beine.
      Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer Enthauptung, stumpf oder chirurgische Schere, um das Gehirn zu ernten, indem Sie den Schädel mit einer gezackten LaGrange Schere durch das Foramen magnum schneiden. Dann schälen Sie den Schädel mit Zangen ab und schaufeln Sie das Gehirn mit einem Spachtel aus.
    2. Entfernen Sie mit einer starken, abgestumpften Schere die Rippen und andere Knochen, die die Wirbelsäule umgeben. Dann schneiden Sie über den Beckenknochen und setzen Sie das Wirbelforamen auf Lendenwirbelsäulenniveau aus. Die kleine Spitze des Rückenmarks sollte an dieser Stelle sichtbar sein.
    3. Verwenden Sie eine 10 ml Spritze gefüllt mit PBS und eine 18 G Nadel, um das Rückenmark zu vertreiben, indem Sie die Schnur von der Lenden- zur Halswirbelsäule über eine Petrischale "spülen".
    4. Legen Sie vorsichtig die abgeschrägte Spitze der Nadel in das Wirbel-Foramen, um übermäßigen Druck zu vermeiden, um zu verhindern, dass die Nadel den Wirbelkörper übergeht. Halten Sie stark, um Druck auf den Wirbelkörper und die Nadel auszuüben und drücken Sie den Spritzenkolben, um die Schnur zu vertreiben. Das Rückenmark sofort in das beschriftete Röhrchen geben und in das Trockeneisbad legen.
  10. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Tieren, bis die Ernte abgeschlossen ist. Legen Sie die Erntewerkzeuge in das 70% Ethanol zwischen den Tieren. Konzentrieren Sie sich auf Konsistenz und Geschwindigkeit. Die Dauer zwischen den einzelnen Organernten sollte konsistent bleiben, um die viralen Titerergebnisse nicht zu verzerrt.
  11. Wenn Sie fertig sind, desinfizieren Sie den Biosicherheitsschrank und das gesamte Material, bevor Sie es aus der Tieranlage entfernen.
  12. Entfernen Sie jedes Rohr aus dem Eisbad und wiegen Sie Die röhrchen, um das Organgewicht zu bestimmen. Um das Organgewicht zu bestimmen, subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Rohres vom Gewicht des Organs, das das Rohr enthält.
    HINWEIS: An dieser Stelle können Organe bei -80 °C eingefroren werden, um zu einem späteren Zeitpunkt weiter zu verarbeiten, oder Organe können unmittelbar vor dem Einfrieren einzelner Aliquoten homogenisiert werden. Einfrieren Auftauproben mehrmals verringert viralen Titer. Daher ist es wichtig, für alle Experimente innerhalb eines einzigen Projekts das gleiche Verfahren durchzuführen.

2. Organhomogenisierung

  1. Bereiten Sie 3 beschriftete, 1,5 ml Schnappkappenröhren für jedes zu homogenisierbare Organ vor.
  2. Wenn Proben nicht unmittelbar nach der Ernte homogenisiert werden, entfernen Sie die Rohre von -80 °C. Die Proben müssen nicht aufgetaut werden, um zu homogenisieren.
  3. Legen Sie die Proben auf Eis, um sie kalt zu halten, um den viralen Titerverlust zu minimieren. Dann fügen Sie 1 ml kaltes DMEM mit 5% FBS zu jedem Organ hinzu, das ein Rohr enthält.
  4. Sofort schlagen Rohre in Perlenschlag nach Herstelleranleitung. Alle Organe mit Stahlperlen in einem Perlenhomogenisator-Instrument homogenisieren. Prüfen Sie, ob jedes Organ vollständig homogenisiert wurde.
  5. Organablagerungen in Mikrofuge bei 12.000 x g für 5 min in einer auf 8 °C gekühlten Mikrofuge abdrehen. Dann die Rohre in den Eiskübel zurückbringen. Im Biosicherheitsschrank werden proben in Tuben für notwendige Assays ausgegliedert. Dann die Rohre in den Eiskübel zurückbringen.
  6. Für fokusbildenden Assay, aliquot 500 l in ein beschriftetes Rohr. Dann rohre in das Rack auf einen Eiskübel legen. Aliquot 50 l in eine Röhre für RNA für fluorogene quantitative RT-PCR (qRT-PCR) zur Messung der Kopiernummer des viralen Genoms.
  7. Isolieren Sie die gesamte RNA aus den Organen der infizierten Tiere mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit. Bestimmen Sie die flavivirusvirale RNA mithilfe der für ZIKV spezifischen Primer-Sondensätze, die einzigartige Sequenzen in jedem Flavivirus-Genom erkennen. Bestimmen Sie die virale Kopiernummer anhand eines Kopierkontrollplasmids, das eine definierte positive einsträngige RNA enthält, die in vitro mit T7-Polymerase erzeugt wurde, die die ZIKV-Zielsequenzen enthält.
  8. Aliquot die verbleibende Probe, die etwa 300 l beträgt, in das dritte Rohr und lagern Sie bei Bedarf bei -80 °C.
    HINWEIS: Wenn Proben zuvor nicht eingefroren wurden, bei -80 °C einfrieren. Wenn Proben zuvor eingefroren worden waren, fahren Sie mit dem Fokus durch Assay und/oder RNA-Isolierung fort, bevor Sieaufhören.

3. Zika Virus Fokus bildende Assay26

HINWEIS: Es ist wichtig, eine Keine Virenkontrolle und eine positive Kontrolle einzuschließen. Die positive Kontrolle ist eine Verdünnungsserie eines Virusbestands mit einer bekannten Konzentration. Nicht alle Steuerelemente müssen auf der gleichen Platte sein, aber da der Test größer als 5 Platten wird, sollten mehr Steuerelemente hinzugefügt und zwischen Platten verteilt werden. Achten Sie darauf, die Monoschicht nicht mit den Pipettenspitzen oder durch kräftiges Waschen zu kratzen. Mehrere Organe können am selben Tag oder an verschiedenen Tagen getit werden. Aber ein einzelnes Organ sollte nicht über mehrere Tage getitert werden, weil verschiedene Assay-Bedingungen viralen Titer beeinflussen können. Es wird dringend empfohlen, ein einzelnes Organ an einem einzigen Tag zu betreiben.

  1. Bereiten Sie vor dem Testtag die Zellen und Reagenzien vor, die für den Fokus bildenden Assay benötigt werden.
    1. Bereiten Sie Wachstumsmedien mit 500 ml DMEM mit 5 ml HEPES und 25 ml FBS vor. Lassen Sie die Zellen der Vero-Weltgesundheitsorganisation (WHO) in Wachstumsmedien bei 37 °C, 5% CO2 vor Beginn des Assays wachsen. Die Vero-Zellen sollten vor Beginn des Testes keine hohe Passage sein oder jemals über 100% Konfluenz wachsen.
    2. 500 ml einer 2%igen Methylcelluloselösung vorbereiten, indem Sie eine 1 L Glasmedienflasche mit 10 g Methylcellulose und einer großen Rührstange und einer separaten 1 L Glasmedienflasche mit 500 ml H2O autoklavieren. Wenn das autoklavierte Wasser in der Mikrowelle abgekühlt ist, bis die Flasche heiß ist, aber nicht kocht.
    3. Gießen Sie vorsichtig warmes/heißes Wasser in eine Flasche Methylcellulose, während Sie sich in der Gewebekulturhaube begeben. Teilweise Kappenflasche und rühren auf der Kochplatte, bis Methylcellulose in Lösung ist (1-4 h). Aliquot die 2% Methylcellulose-Lösung in sterile 50 ml konische Röhre. 2% Methylcellulose kann bis zum Bedarf bei 4 °C gelagert werden.
    4. Bereiten Sie eine 5% Paraformaldehyd-Lösung in PBS zur Befestigung der Platten vor und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie benötigt wird. Bereiten Sie einen 1x Fokus bildenden Assay-Waschpuffer vor, indem Sie 0,05% Triton X-100 zu PBS hinzufügen und bei RT lagern. Bereiten Sie einen 1x FFA-Färbungspuffer vor, indem Sie PBS 1 mg/ml Saponin hinzufügen und bei 4 °C lagern, bis es benötigt wird. Diese können ein- bis zwei Wochen im Voraus vorbereitet werden.
  2. Berechnen Sie die Anzahl der flachen 96 Brunnenplatten, die für den Test benötigt werden, so dass jedes Organ in Dreifache plattiert ist. Fügen Sie genügend zusätzliche Bohrungen für positive und negative Kontrollen hinzu.
    1. Wachsen Sie genug Vero-Zellen in Wachstumsmedien, um den assay entworfen zu vervollständigen. Trypsinisieren Sie die Vero-Zellen und zählen Sie sie mit 1,5 x 105 Zellen pro ml in Wachstumsmedien. Platten Vero-Zellen in den 96 gut flachen Bodenplatten bei 3,0 x 104 Vero-WHO-Zellen/gut in Wachstumsmedien, indem Sie 200 l pro Brunnen hinzufügen.
    2. Inkubieren Sie Platten bei 37°C bei 5%CO2 über Nacht, stellen Sie sicher, dass die Platten im Inkubator eben sind, so dass die Zellen gleichmäßig innerhalb des Brunnens verteilt sind.
      HINWEIS: Jedes Labor baut Vero-Zellen etwas anders an; das Ziel ist eine 90-95% konfluente Monoschicht in jedem Brunnen am Tag des Assays für zika Virus.
  3. Verdünnt es zika Virus Proben am Tag des Assays. Wenn die Organproben zuvor homogenisiert waren, entfernen Sie Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank und lassen Sie sie auftauen, bevor Sie die Proben für den Test auf Eis legen.
    1. Auf Eis bereiten Sie eine runde untere 96-Wellplatte vor, indem Sie den Reihen B durch H 180 L kaltwachsende Medien hinzufügen und Zeile A leer lassen. Fügen Sie 150 l jeder homogenisierten Organprobe in Zeile A der runden Bodenplatte hinzu.
    2. Bereiten Sie serielle 10-fache Verdünnungen jeder Probe mit einer Mehrkanalpipette vor. Verdünnung von Proben in einer runden unteren 96-Well-Platte, indem man 20 l Probe in 180 L Wachstumsmedien einfügt und die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung wechselt.
  4. Bereiten Sie die Fokusformplatte vor, indem Sie die Medien von der flachen 96-Wellplatte entfernen, die Vero-Zellen bedeckt. Tun Sie dies unmittelbar vor dem Hinzufügen der Virusproben, um zu verhindern, dass die Monoschicht austrocknet.
    1. Fügen Sie jedem Brunnen in der Vero-Platte 100 l der Virusverdünnung hinzu. Fügen Sie eine Stichprobe mit dem gleichen Satz von Tipps hinzu, indem Sie von der niedrigsten zur höchsten Konzentration gehen. Felsplatten nebeneinander 2-4 mal darauf achten, nicht zu wirbeln.
    2. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5%CO2 für 1-2 h. Stellen Sie sicher, dass die Platten im Inkubator eben sind. Während der Inkubation 2% Methylcellulose auf RT aufwärmen.
    3. 2% Methylcelluloselösung in Wachstumsmedien verdünnen. Die Verdünnung sollte im Verhältnis von etwa 2:1 von 2% Methylcellulose zu Wachstumsmedien liegen. Halten Sie bei Raumtemperatur, bis es Zeit ist, es zu verwenden. Fügen Sie 1-2 Tropfen/Well (stellen Sie die Pipette auf 125 l) der Methylcellulose: Wachstumsmedien an jedem Brunnen der 96 WellPlatte.
    4. Inkubieren Sie 32-40 h bei 37°C, 5% CO2 . Da alle Vero-Zellen leicht anders wachsen und Faktoren wie Zellzusammenfluss und Stamm des Zika-Virus die Inkubationszeit verändern können.
  5. Fixieren Sie die Vero-Zellen mit der vorbereiteten 5% Paraformaldehydlösung.
    1. Fügen Sie jeweils 50 l 5% Paraformaldehyd zu jeder Platte über der Methylcelluloseschicht im Biosicherheitsschrank hinzu. Inkubieren Sie für 60 min bei RT. Die Befestigung kann über Nacht bei 4 °C gehen, aber die Platte mit Parafilm bedecken, um die Verdunstung zu reduzieren.
    2. Dump Overlay und Medien aus Zellen in einen Entsorgungsbehälter im Biosicherheitsschrank. Sanft mit PBS waschen, 150 l/well. Entfernen Sie PBS von den Platten und entfernen Sie die Platte aus dem BSL-2.
    3. Wiederholen Sie die PBS-Waschanlage 2x mit 150 L/Well. Entfernen Sie dann die PBS. Fügen Sie 150 L / well 1x FFA-Waschpuffer und lassen Sie für 5-10 min bei RT sitzen, um die festen Zellen zu permeabilisieren.
  6. Erkennen Sie eine Infektion mit primärem Zika-Antikörper. Bereiten Sie den primären Antikörper 4G2 (D1-4G2-4-15) in einer Konzentration von 1 mg/ml im FFA-Färbepuffer vor. Bereiten Sie genügend Antikörper für den gesamten Assay vor.
    HINWEIS: Bleiben Sie weg von Laborwindeln oder anderem hochlintisoren Material, da die Fasern sich negativ auf die Bildgebung der Brennpunkte auswirken.
    1. FFA-Waschpuffer von den Platten entfernen. Fügen Sie dem primären Antikörper 50 L/Well in den FFA-Färbungspuffer hinzu. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und brüten Sie über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelplattform. Der Assay kann mit einer Inkubation für 2 h bei RT durchgeführt werden.
  7. Visualisieren Sie die Infektion durch die Zugabe eines sekundären HRP konjugierten Antikörpers. Bereiten Sie den sekundären Goat Anti-Maus HRP-markierten Antikörper in einer Konzentration von 1:5.000 im FFA-Färbepuffer vor. Bereiten Sie genügend Antikörper für den gesamten Assay vor.
    1. Waschen Sie Zellen 3x mit FFA-Waschpuffer, entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie jedes Mal in die Spüle blättern. Färben Sie die Zellen mit dem sekundären Antikörper im FFA-Färbepuffer bei 50 l/well. 1-2 h bei RT inkubieren.
    2. Waschen Sie Zellen 3x mit FFA-Waschpuffer, entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie jedes Mal in die Spüle blättern. Fügen Sie 50 L/Well des Trueblue Substrats hinzu.
    3. Beobachten Sie die Platten sorgfältig, warten 2-15 min, bis die Flecken vollständig definiert sind und minimalen Hintergrund. Nachdem die Flecken sichtbar sind, waschen Sie sanft mit Wasser, mit einer Hand, um die Monoschicht vor der Kraft des Wassers zu schützen. Tippen Sie so schnell wie möglich auf Papiertücher (NOT DIAPERS) und Bild.
    4. Spots können manuell oder mit einem automatisierten Spotzähler gezählt werden. Bei manueller Zählung kann ein Sezieren von Bereichen verwendet werden, um die Visualisierung zu unterstützen.
    5. Wählen Sie für jede Probe eine Verdünnung mit leicht zu unterscheidenden Brennpunkten (z. B. 20 bis 200 pro Bohrplatz) und berechnen Titer in fokusbildenden Einheiten pro ml (FFU/ml), wobei der Durchschnitt der doppelten Bohrungen verwendet wird: FFU/mL = (mittlere randaliert/well) (Verdünnungsfaktor) (mL inoculum).

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Results

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Zur Bewertung von ZIKV-Titern mit dem oben beschriebenen Ifnar1-/- wurden Mäuse mit ZIKV (PRVABC59) mittels subkutaner (SC) Injektion in das Fußpad infiziert. Hier ist die Verabreichung von 1 x 105 FFU von ZIKV an 8-12 Wochen alte Ifnar1-/- Mäuse SC nicht tödlich, aber das Virus kann sich sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS replizieren. Diese Dosis und Route werden verwendet, um Wirtsreger Immunantworten und Pathogenität zu stud...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZikV-Infektion kann eine neurologische Erkrankung verursachen, daher müssen die aktuellen Tiermodelle, um Pathogenese, Immunantworten und schützende Wirksamkeit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten zu untersuchen, sich auf die Viruskontrolle innerhalb des ZNS konzentrieren. Eine der Herausforderungen bei der Konzentration auf ZNS-Krankheit ist, dass es oft auf Kosten der Untersuchung peripherer Infektionen kommt. Die hier vorgeschlagenen Methoden der Organisolierung konzentrieren sich auf die Notwendigkeit, die Z...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Pinto wird durch ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School of Medicine und Start-up-Fonds von der Saint Louis University School of Medicine finanziert. Dr. Brien wird durch einen K22AI104794 Early Investigator Award des NIH NIAID sowie ein Saatgutstipendium der Saint Louis University School finanziert. Für alle geförderten Personen spielten die Geldgeber keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-Brom-3-chlorpropan (BCP)MRC-GenBP151
10 cc SpritzeThermo Fisher ScientificBD 309642
18 G NadelThermo Fisher Scientific22-557-145
1 cc TB SpritzeThermo Fisher Scientific14-823-16H
20 cc SpritzeThermo Fisher Scientific05-561-66
24 RohrkugelmühleThermo Fisher Scientific15 340 163
3,2 mm EdelstahlperlenThermo Fisher ScientificNC9084634
37 > C Gewebekultur-InkubatorNuair5800
4G2 Antikörperim Haus
96 Well flache BodenplattenMidsciTP92696
96 Well runde BodenplattenMidsciTP92697
Basix 1,5 mL Eppendorf RöhrchenThermo Fisher Scientific02-682-002
Konzentrierte keimtötendeBleichklammern30966CT
CTL S6 AnalysatorCTLCTL S6 Universal-Analysator
Gebogene SchneideschereFine Science Tools14061-11
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hohe Glukose Mit 4.500 mg/L GlukoseMilliporeSigmaD5671
Ethanol (molekularbiologische Qualität)MilliporeSigmae7023
Fötales RinderserumMilliporeSigmaF0926-500ML
PinzetteFine Science Tools11036-20
EisessigMilliporeSigma537020
Ziege Anti-Maus-HRP-markierter AntikörperMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Isopropanol (molekularbiologische Qualität)MilliporeSigmaI9516
Ketamin/Xylazin-CocktailVergleichende Medizin
L-GlutaminMilliporeSigmag7513
Magmax RNA AufreinigungskitThermo Fisher ScientificAM1830
MethylcelluloseMilliporeSigmaM0512
MikrozentrifugeEpendorf5424R
MiniCollect 0,5 mL EDTA-RöhrchenBio-one450480
O-Ring-RöhrchenThermo Fisher Scientific21-403-195
One step q RT-PCR MixThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehydThermo FisherScientific EMS- 15713-S
Phosphatgepufferte KochsalzlösungMilliporeSigmad8537-500ml
Proline MehrkanalpipettenSartorius72230/72240
Proline EinkanalpipettenSartorius728230
RNAse freies WasserThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC GenRB192
SchaukelplattformThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinMilliporeSigmas7900
Löffel/SpachtelFine Science Tools10090-17
Gerade SchneideschereFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
True Blue SubstratVWR95059-168
TrypsinMilliporeSigmaT3924-100ML

References

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