Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

Summary

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Abstract

Die vorgestellten Methoden zeigen Laborverfahren zur Isolierung von Organen von mit dem Zika-Virus infizierten Tieren und zur Quantifizierung der Viruslast. Der Zweck des Verfahrens ist es, virale Titter in peripheren und ZNS-Bereichen der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu quantifizieren, um virologische und immunologische Faktoren zu identifizieren, die die Zika-Virusinfektion regulieren. Die gezeigten Organisolationsverfahren ermöglichen sowohl die Fokusbildung der Assay-Quantifizierung als auch die quantitative PCR-Bewertung von viralen Titern. Die schnellen Organisolationstechniken sind für die Erhaltung von Virustiter konzipiert. Die virale Titerquantifizierung durch Fokusbildenden Assay ermöglicht eine schnelle Durchsatzbewertung des Zika-Virus. Der Vorteil des Fokus bildenden Assays ist die Bewertung von infektiösen Viren, die Einschränkung dieses Assays ist das Potenzial für Organtoxizität, die die Nachweisgrenze reduziert. Virale Titer-Bewertung wird mit quantitativer PCR kombiniert, und mit einer rekombinanten RNA-Kopierkontrolle wird die virale Genomkopie-Kopiennummer innerhalb des Organs mit geringer Nachweisgrenze bewertet. Insgesamt bieten diese Techniken eine genaue schnelle Hochdurchsatzmethode für die Analyse von Zika-Virustittern in der Peripherie und ZNS von Zika-Virus infizierten Tieren und können auf die Beurteilung von viralen Tittern in den Organen von Tieren angewendet werden, die mit den meisten Infizierten infiziert sind. Krankheitserreger, einschließlich Dengue-Virus.

Introduction

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Arbovirus, das zur Familie der Flaviviridae gehört und wichtige neuroinvasive menschliche Krankheitserreger wie das Powassan-Virus (POWV), das japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das West-Nil-Virus (WNV)¹umfasst. Nach seiner Isolierung und Identifizierung gab es regelmäßig Berichte über humane ZIKV-Infektionen in Afrika und Asien^2,3,4,5und Epidemien in Mittel- und Südamerika (überprüft in Referenz⁶). Jedoch, Es war nicht bis vor kurzem, dass ZIKV gedacht wurde,....

Protocol

Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien des St. Louis University Animal Care and Use Committee. SLU ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert.

1. Organisolation

HINWEIS: Das Virus ist bei Raumtemperatur (RT) nicht stabil, so dass die Anzahl der gleichzeitig geernteten Tiere sorgfältig geplant werden muss, um virale Titter zu erhalten.

1. Infizieren Sie Mäuse mit der gewählten Dosis und Route, basierend auf dem erforderlichen Phänotyp. Für dieses Protokoll, infizieren 8-10 Wo....

Results

Zur Bewertung von ZIKV-Titern mit dem oben beschriebenen ^Ifnar1-/- wurden Mäuse mit ZIKV (PRVABC59) mittels subkutaner (SC) Injektion in das Fußpad infiziert. Hier ist die Verabreichung von 1 x 10⁵ FFU von ZIKV an 8-12 Wochen alte Ifnar1^-/- Mäuse SC nicht tödlich, aber das Virus kann sich sowohl in der Peripherie als auch in der ZNS replizieren. Diese Dosis und Route werden verwendet, um Wirtsreger Immunantworten und Pathogenität zu stud.......

Discussion

ZikV-Infektion kann eine neurologische Erkrankung verursachen, daher müssen die aktuellen Tiermodelle, um Pathogenese, Immunantworten und schützende Wirksamkeit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten zu untersuchen, sich auf die Viruskontrolle innerhalb des ZNS konzentrieren. Eine der Herausforderungen bei der Konzentration auf ZNS-Krankheit ist, dass es oft auf Kosten der Untersuchung peripherer Infektionen kommt. Die hier vorgeschlagenen Methoden der Organisolierung konzentrieren sich auf die Notwendigkeit, die Z.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Brom-3-chlorpropan (BCP)	MRC-Gen	BP151
10 cc Spritze	Thermo Fisher Scientific	BD 309642
18 G Nadel	Thermo Fisher Scientific	22-557-145
1 cc TB Spritze	Thermo Fisher Scientific	14-823-16H
20 cc Spritze	Thermo Fisher Scientific	05-561-66
24 Rohrkugelmühle	Thermo Fisher Scientific	15 340 163
3,2 mm Edelstahlperlen	Thermo Fisher Scientific	NC9084634
37 > C Gewebekultur-Inkubator	Nuair	5800
4G2 Antikörper	im Haus
96 Well flache Bodenplatten	Midsci	TP92696
96 Well runde Bodenplatten	Midsci	TP92697
Basix 1,5 mL Eppendorf Röhrchen	Thermo Fisher Scientific	02-682-002
Konzentrierte keimtötende	Bleichklammern	30966CT
CTL S6 Analysator	CTL	CTL S6 Universal-Analysator
Gebogene Schneideschere	Fine Science Tools	14061-11
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hohe Glukose Mit 4.500 mg/L Glukose	MilliporeSigma	D5671
Ethanol (molekularbiologische Qualität)	MilliporeSigma	e7023
Fötales Rinderserum	MilliporeSigma	F0926-500ML
Pinzette	Fine Science Tools	11036-20
Eisessig	MilliporeSigma	537020
Ziege Anti-Maus-HRP-markierter Antikörper	MilliporeSigma	8924
HEPES 1 M	MilliporeSigma	H3537-100ML
Isopropanol (molekularbiologische Qualität)	MilliporeSigma	I9516
Ketamin/Xylazin-Cocktail	Vergleichende Medizin
L-Glutamin	MilliporeSigma	g7513
Magmax RNA Aufreinigungskit	Thermo Fisher Scientific	AM1830
Methylcellulose	MilliporeSigma	M0512
Mikrozentrifuge	Ependorf	5424R
MiniCollect 0,5 mL EDTA-Röhrchen	Bio-one	450480
O-Ring-Röhrchen	Thermo Fisher Scientific	21-403-195
One step q RT-PCR Mix	Thermo Fisher Scientific	4392938
Paraformaldehyd	Thermo Fisher	Scientific EMS- 15713-S
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	MilliporeSigma	d8537-500ml
Proline Mehrkanalpipetten	Sartorius	72230/72240
Proline Einkanalpipetten	Sartorius	728230
RNAse freies Wasser	Thermo Fisher Scientific	10-977-023
RNAzol BD	MRC Gen	RB192
Schaukelplattform	Thermo Fisher Scientific	11-676-333
RPMI 1640	Fisher	MT10040CV
Saponin	MilliporeSigma	s7900
Löffel/Spachtel	Fine Science Tools	10090-17
Gerade Schneideschere	Fine Science Tools	14060-11
Triton X-100	MilliporeSigma	t8787
True Blue Substrat	VWR	95059-168
Trypsin	MilliporeSigma	T3924-100ML