Methodenartikel

Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

DOI:

10.3791/59656

⸱

27. August 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger Proteinziele für kleine Moleküle. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet DARTS native, unveränderte, kleine Moleküle und ist einfach und einfach zu bedienen. In dieser Studie haben wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachten und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzten. Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls genutzt. Aus der proteolytischen Kurve sahen wir, dass die Proteolyse von mTOR durch Pronase durch das Vorhandensein von Rapamycin gehemmt wurde. Die Dosis-Abhängigkeits-Kurve ermöglichte es uns, die Bindungsaffinität von Ramamycin und mTOR abzuschätzen. Diese Methode ist wahrscheinlich eine leistungsfähige und einfache Methode zur genauen Identifizierung neuartiger Zielproteine und zur Optimierung des Wirkstoffzielengagements.

Einleitung

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Die Identifizierung kleiner Molekül-Zielproteine ist für das mechanistische Verständnis und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Medikamentewesentlich 1,2,3. Die Affinitätschromatographie als klassische Methode zur Identifizierung der Zielproteine kleiner Moleküle hat gute Ergebnisse erbracht4,5. Diese Methode hat jedoch Grenzen, da die chemische Modifikation kleiner Moleküle oft zu einer reduzierten oder veränderten Bindungsspezifität oder Affinität führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzlich mehrere neue Strategien entwickelt und angewendet, um die kleinen Molekülziele ohne chemische Modifikation der kleinen Moleküle zu identifizieren. Diese direkten Methoden zur Zielidentifikation von etikettenfreien kleinen Molekülen umfassen die wirkstoffaffinitätsresponsive Zielstabilität (DARTS)6, Stabilität von Proteinen aus Oxidationsraten (SPROX)7, zellulärer thermischer Schichtassay (CETSA)8 ,9und thermische proteom profiling (TPP)10. Diese Methoden sind sehr vorteilhaft, da sie natürliche, unveränderte kleine Moleküle verwenden und sich nur auf direkte Bindungswechselwirkungen verlassen, um Zielproteine zu finden11.

Unter diesen neuen Methoden ist DARTS eine vergleichsweise einfache Methode, die leicht von den meisten Labors übernommen werden kann12,13. DARTS hängt von dem Konzept ab, dass Ligandengebundene Proteine eine modifizierte Anfälligkeit für enzymatische Degradation im Vergleich zu ungebundenen Proteinen aufweisen. Das neue Zielprotein kann durch Untersuchung des veränderten Bandes im SDS-PAGE-Gel durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Identifizierung von bisher unbekannten Zielen von Naturprodukten und Medikamenten14,15,16,17,18 , 19. Es ist auch leistungsfähig als Mittel, um die Bindung von Verbindungen an ein bestimmtes Protein zu überprüfen oder zu validieren20,21. In dieser Studie stellen wir eine Verbesserung des Experiments dar, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität mit kleinen Molekülen überwachen und Protein-Ligand-Bindungsaffinitäten identifizieren. Wir verwenden mTOR- rapamycin Interaktion als Beispiel, um unseren Ansatz zu demonstrieren.

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Protokoll

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1. Sammeln und Lyse-Zellen

  1. Wachsen Sie 293T-Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1% Antibiotika. Inkubationskulturen bei 37 °Cunter 5% CO2 .
    HINWEIS: Der Wachstumszustand der Zellen kann die Stabilität nachfolgender Experimente beeinflussen.
  2. Erweitern Sie Zellen in der Kultur bis zum Erreichen des Zusammenflusses von 80 bis 201290%.
  3. Mischen Sie 345 l Zelllysereagenz (siehe Materialtabelle) mit 25 l 20x Protease-Inhibitor-Cocktail, 25 l 1 M Natriumfluorid, 50 l mit 100 mM-Glyzerophosphat, 50 l 50 ml Natriumpyrophosphat und 5 l 200 mM Natriumorthovanadate. Den Lysepuffer gekühlt auf Eis halten.
    HINWEIS: Andere Lysepuffer mit verschiedenen Reinigungsmitteln (z. B. Triton X-100 oder NP-40) können mit DARTS verwendet werden, solange sie nicht denaturing sind. Membranproteine oder Kernproteine können extrahiert werden, indem 0,4% Triton X-100 oder 0,4% NP-40 in das Zelllysat hinzugefügt werden.
  4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
  5. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in einer geeigneten Menge Zelllysepuffer zu sammeln und die Lysing-Zellen in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die für jedes DARTS-Experiment benötigt werden, hängt davon ab, wie viel Protein aus verschiedenen Zelllinien extrahiert werden kann. Im Allgemeinen liegt die Proteinkonzentration des verwendeten Lysats zwischen 4 und 20126 g/l. Eine 10-cm-Platte mit 293T-Zellen bei 85-u201290%-Konfluenz, lysiert mit 300 l Lysepuffer, führt typischerweise zu einem Lysat mit einer Proteinkonzentration von 5 g/l.
  6. Mischen Sie die Lysepuffer/Lysing-Zellen gut und inkubieren Sie die Röhre auf Eis für 10 min.
  7. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18.000 g für 10 min bei 4 °C.
  8. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Rohr geben und auf Eis gekühlt halten.
  9. Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration von Lysaten anzunähern.

2. Inkubieren Sie Proteinlysate mit dem kleinen Molekül

  1. Die Lysate mit 99 °L in zwei 1,5 ml-Rohre aufteilen.
  2. Machen Sie eine Anfangsstoffkonzentration von 10 mM kleinen Molekül. Bei der Durchführung von DARTS kann man mit einer höheren Konzentration des kleinen Moleküls (5-u201210x des EC50-Wertes) beginnen, um eine optimale Bindung zu gewährleisten.
    1. Fügen Sie entweder 1 l Lösungsmittel hinzu, dass das kleine Molekül in kleinen Molekül-Stammlösungen löslich ist, oder 1 l kleiner Molekül-Stammlösungen zu jedem Aliquot von Lysat. Zelle mit den Lösungen für 30-u201260 min bei Raumtemperatur mit Schütteln bebrüten.
  3. Auf Eis serielle Verdünnungen (1:200, 1:400, 1:800 und 1:1600) frisch aufgetauter Pronaselösung in 1x TNC (für 1 ml 10x TNC-Puffer, Mischen Sie 300 l Reinstwasser mit 100 l 5 M Natriumchlorid, 100 l und 500 l von 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
  4. Untersuchen Sie eine breite Breite der Pronase:Protein-Verhältnisse (z. B. von 1:100 bis 1:2000), um die beobachtungsweise Wirkung der Pronase auf die Ziel(en) zu gewährleisten.
    ANMERKUNG: Zur Berechnung der Pronase-Konzentrationen (Beispiel): 5 -g/l-Proteinkonzentration x 20-L-Probe = 100 g Protein. Für ein Pronase:Protein-Verhältnis von 1:100 benötigen wir eine Pronase-Lösung von 0,5 g/l (100 g bei 100 x 2 ,L). Dieses Experiment muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um einen geeigneten Bereich von Pronase:Protein-Verhältnissen zu erhalten.

3. Proteolyse durchführen

ANMERKUNG: Bei der Proteolyse werden die Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben

  1. Teilen Sie nach der Inkubation mit dem kleinen Molekül jedes Aliquot in 20 L-Proben auf.
  2. Fügen Sie in jeder Probe in bestimmten Intervallen (alle 30 s) 2 L des Spektrums der Pronase-Lösungen hinzu. Verwenden Sie ein gleiches Volumen von 1x TNC-Puffer, um eine unverdaute Kontrollprobe einzurichten.
  3. Nach 5-u201220 min die Verdauung durch Zugabe von 2 l kalten 20x Protease-Hemmer-Cocktail alle 30 s stoppen. Gut mischen und 10 min auf Eis brüten.
  4. Proben mit dem entsprechenden Volumen von 5x SDS-PAGE Ladepuffer verdünnen und bei 95 °C 5 min kochen.
  5. Führen Sie den nächsten Teil des Experiments durch oder lagern Sie die Proteinprobe bei 80 °C.

4. Quantifizierung und Analyse

  1. Führen Sie nach DARTS Coomassie blaue Färbung nach dem zuvor veröffentlichten Protokoll22durch.
  2. Die gefärbten Proteinbänder sollten nach dem Entsalzen sehr klar sein. Gießen Sie die verwendete Destain-Lösung ab und fügen Sie frische 1% Essigsäurelösung hinzu, um das Gel zu bedecken. Setzen Sie das Gel unter das Licht, um die Bänder mit signifikanten Unterschieden zwischen Gruppen mit (Probengruppe) oder ohne (Kontrollgruppe) das kleine Molekül zu beobachten.
  3. Schneiden Sie die beiden entsprechenden Bänder aus dem Gel mit einem sterilen Instrument und führen Sie LC-MS/MS sofort auf.
    HINWEIS: LC-MS/MS muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Proteine im Gel kontinuierlich abgebaut werden.
  4. Verdauen Sie die Bänder, extrahieren Sie Peptide und führen Sie die LC-MS/MS-Analyse23durch.
    1. Um LC-MS/MS-Daten zu analysieren, identifizieren Sie zunächst alle Proteine im einzelnen Band. Zweitens verwenden Sie Peptidspektrum-Match (PSM), um die Fülle jedes Proteins darzustellen.
      HINWEIS: PSM liefert die Gesamtzahl der identifizierten Peptidsequenzen für das Protein, einschließlich der redundant identifizierten. Im Allgemeinen kann die Art und Weise, wie oft ein Peptid identifiziert/sequenziert wird, als grobe Schätzung der Fülle des Proteins in der Probe verwendet werden. Proteine, die in der Probengruppe über die Kontrollgruppe angereichert sind, sind Proteine von Interesse.
  5. Beschaffen Sie die primären Antikörper der ausgewählten Proteine. Führen Sie einen westlichen Blot durch, um zu überprüfen, ob das kleine Molekül direkt an die potenziellen Zielproteine binden kann24.
    1. Laden Sie gleiche Mengen an Protein in die Brunnen eines 8% SDS-PAGE Gels, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel 30 min bei 80 V aus, stellen Sie dann die Spannung auf 120 V ein und fahren Sie weiter für 1-u20122 h.
  6. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit Bildverarbeitungs- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
  7. Analysieren Sie die Daten und zeichnen Sie die Kurven.
    1. Bestimmung der proteolytischen Kurve für ein Zielprotein
      1. Das Pronase:Protein-Verhältnis wird bei der Proteolyse variiert. Normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die den unverdauten Bändern entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Verwenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse der statistik- und zeichnungssoftware, um eine Kurve normalisierter Daten für relative Bandintensität und Pronase:Protein-Verhältnisse darzustellen.
      3. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus und lassen Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten zu. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie unter x die Zahlen 0, 1, 2, 3, 4, 5 ein (als Platzhalter entsprechende Pronase:Protein-Verhältnisse).
      4. Geben Sie in der y-Spalte die normalisierten Daten für relative Bandintensitäten ein. Führen Sie "Nichtlineare Regression" durch und implementieren Sie eine "Dosis-Response-Stimulation" mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response —Variable Neigung (vier Parameter)".
      5. Konvertieren Sie die Anmerkungen der X-Achse in der Kurve in die entsprechenden Pronase:Protein-Verhältnisse.
    2. Bestimmung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve für ein Zielprotein
      HINWEIS: Für die Dosis-Abhängigkeits-Analyse ist die Molarität des kleinen Moleküls in den Proben unterschiedlich. Das stabile Pronase:Protein-Verhältnis sollte durch DieAnalyse von Proteolysedaten informiert werden. Das Pronase:Protein-Verhältnis, das den maximalen Unterschied in der Zielproteinintensität während der proteolytischen Kurve zeigte, sollte für das Dosisabhängigkeitsexperiment verwendet werden.
      1. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit einer Bildanalysesoftware. Wie bei der Generierung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die dem am wenigsten verdauten Band entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Wenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse innerhalb der Statistik- und Zeichnungssoftware auf die normalisierten Daten an. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus, und geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander anseitigen Unterspalten ein.
      3. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie für die Variable "x" unterschiedliche Konzentrationen des kleinen Moleküls ein; 'y' enthält die entsprechenden normalisierten Daten für die relative Bandintensität.
      4. Transformieren Sie x-Werte mit X = Log(X). Verwenden Sie schließlich die nichtlineare Regression, und implementieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Stimulation mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response –Variable Neigung (vier Parameter)".

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Ergebnisse

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Das Flussdiagramm des Experiments ist in Abbildung 1dargestellt. Das Ergebnis der Blauen Färbung von Coomassie ist in Abbildung 2dargestellt. Die Inkubation mit dem kleinen Molekül bietet Schutz gegen Proteolyse. Es werden drei Bänder gefunden, die durch Inkubation mit Rapamycin über fahrzeugkontrolle geschützt zu sein scheinen. Die erwarteten Ergebnisse aus dem proteolytischen Kurvenexperiment sind in Abbildung 3dargestellt. Als Pr...

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Diskussion

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DARTS ermöglicht die Identifizierung kleiner Molekülziele, indem die schützende Wirkung der Proteinbindung gegen Abbau genutzt wird. DARTS erfordert keine chemische Modifikation oder Immobilisierung des kleinen Moleküls26. Dadurch können kleine Moleküle verwendet werden, um ihre direkten Bindungsproteinziele zu bestimmen. Zu den Standardbewertungskriterien für die klassische DARTS-Methode gehören Gelfärbung, Massenspektrometrie und Western Blotting12,

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-Forschungsstipendien R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 und ein DOD-Forschungsstipendium W81XWH-16-1-0482 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100X ProteaseinhibitorCocktail Sigma-AldrichP8340Mit Reinstwasser auf 20X verdünnen
293T ZelllinieATCCCRL-3216DMEM Medium mit 10% FBS
EssigsäureSigma-AldrichA6283
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
CalciumchloridSigma-AldrichC1016
ZellschaberThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 FärbelösungBio-Rad1610436
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 6.0 Software fürstatistische Analysen und Zeichnungen
SalzsäureSigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.52Bildverarbeitungs- und Analysesoftware
M-PER ZelllysereagenzThermo Fisher78501
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
NatriumchloridSigma-AldrichS7653
NatriumfluoridSigma-AldrichS7920
NatriumorthovanadatSigma-Aldrich450243
NatriumpyrophosphatSigma-Aldrich221368
Trizma BaseSigma-AldrichT1503auf pH 8,0
β-GlycerophosphatSigma-AldrichG9422

Referenzen

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  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784(2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454(2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438(2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

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