Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

Zusammenfassung

In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.

Zusammenfassung

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger Proteinziele für kleine Moleküle. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet DARTS native, unveränderte, kleine Moleküle und ist einfach und einfach zu bedienen. In dieser Studie haben wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachten und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzten. Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls genutzt. Aus der proteolytischen Kurve sahen wir, dass die Proteolyse von mTOR durch Pronase durch das Vorhandensein von Rapamycin gehemmt wurde. Die Dosis-Abhängigkeits-Kurve ermöglichte es uns, die Bindungsaffinität von Ramamycin und mTOR abzuschätzen. Diese Methode ist wahrscheinlich eine leistungsfähige und einfache Methode zur genauen Identifizierung neuartiger Zielproteine und zur Optimierung des Wirkstoffzielengagements.

Einleitung

Die Identifizierung kleiner Molekül-Zielproteine ist für das mechanistische Verständnis und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Medikamente^{wesentlich 1,2,3}. Die Affinitätschromatographie als klassische Methode zur Identifizierung der Zielproteine kleiner Moleküle hat gute Ergebnisse erbracht^4,5. Diese Methode hat jedoch Grenzen, da die chemische Modifikation kleiner Moleküle oft zu einer reduzierten oder veränderten Bindungsspezifität oder Affinität führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzli....

Protokoll

1. Sammeln und Lyse-Zellen

1. Wachsen Sie 293T-Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1% Antibiotika. Inkubationskulturen bei 37 °Cunter 5% CO2 .
   HINWEIS: Der Wachstumszustand der Zellen kann die Stabilität nachfolgender Experimente beeinflussen.
2. Erweitern Sie Zellen in der Kultur bis zum Erreichen des Zusammenflusses von 80 bis 201290%.
3. Mischen Sie 345 l Zelllysereagenz (siehe Materialtabelle) mit 25 l 20x Protease-Inhibitor-Cocktail, 25 l 1 M Natriumfluorid, 50 l mit 100 mM-Glyzerophosphat, 50 l 50 ml Natriumpyrophosphat und 5 l 200 mM Natriumorth....

Ergebnisse

Das Flussdiagramm des Experiments ist in Abbildung 1dargestellt. Das Ergebnis der Blauen Färbung von Coomassie ist in Abbildung 2dargestellt. Die Inkubation mit dem kleinen Molekül bietet Schutz gegen Proteolyse. Es werden drei Bänder gefunden, die durch Inkubation mit Rapamycin über fahrzeugkontrolle geschützt zu sein scheinen. Die erwarteten Ergebnisse aus dem proteolytischen Kurvenexperiment sind in Abbildung 3dargestellt. Als Pr.......

Diskussion

DARTS ermöglicht die Identifizierung kleiner Molekülziele, indem die schützende Wirkung der Proteinbindung gegen Abbau genutzt wird. DARTS erfordert keine chemische Modifikation oder Immobilisierung des kleinen Moleküls²⁶. Dadurch können kleine Moleküle verwendet werden, um ihre direkten Bindungsproteinziele zu bestimmen. Zu den Standardbewertungskriterien für die klassische DARTS-Methode gehören Gelfärbung, Massenspektrometrie und Western Blotting^12,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100X Proteaseinhibitor	Cocktail Sigma-Aldrich	P8340	Mit Reinstwasser auf 20X verdünnen
293T Zelllinie	ATCC	CRL-3216	DMEM Medium mit 10% FBS
Essigsäure	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C1016
Zellschaber	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Färbelösung	Bio-Rad	1610436
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 6.0 Software für	statistische Analysen und Zeichnungen
Salzsäure	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.52	Bildverarbeitungs- und Analysesoftware
M-PER Zelllysereagenz	Thermo Fisher	78501
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S7653
Natriumfluorid	Sigma-Aldrich	S7920
Natriumorthovanadat	Sigma-Aldrich	450243
Natriumpyrophosphat	Sigma-Aldrich	221368
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	auf pH 8,0
β-Glycerophosphat	Sigma-Aldrich	G9422