Methodenartikel

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

DOI:

10.3791/59658

⸱

20. August 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben Vollgenom- und Ganzexom-Datensätze sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Spitzenforschung der Humangenetik zugänglicher gemacht. Obwohl eine Reihe von Silico-Algorithmen entwickelt wurden, um die Pathogenität der in diesen Datensätzen identifizierten Varianten vorherzusagen, sind funktionelle Studien entscheidend, um zu bestimmen, wie spezifische genomische Varianten die Proteinfunktion beeinflussen, insbesondere für Missense Varianten. Im Undiagnosed Diseases Network (UDN) und anderen Forschungskonsortien für seltene Krankheiten werden Modellorganismen (MO) einschließlich Drosophila, C. elegans,Zebrafische und Mäuse aktiv verwendet, um die Funktion von vermeintlichen menschlichen Krankheiten zu bewerten. Varianten. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur funktionellen Bewertung seltener menschlicher Varianten, die im Model Organisms Screening Center Drosophila Core des UDN verwendet werden. Der Workflow beginnt mit dem Sammeln von menschlichen und MO-Informationen aus mehreren öffentlichen Datenbanken, wobei die MARRVEL-Webressource verwendet wird, um zu beurteilen, ob die Variante wahrscheinlich zum Zustand eines Patienten beiträgt, sowie effektive Experimente auf der Grundlage verfügbarer Wissen und Ressourcen. Als nächstes werden genetische Werkzeuge (z.B. T2A-GAL4 und UAS-Human cDNA-Linien) generiert, um die Funktionen von Varianten von Interesse an Drosophilazu bewerten. Bei der Entwicklung dieser Reagenzien können zweigleisige funktionelle Assays auf Basis von Rettungs- und Überexpressionsexperimenten durchgeführt werden, um die Variantenfunktion zu bewerten. Im Rettungszweig werden die endogenen Fliegengene "humanisiert", indem das orthologe Drosophila-Gen durch Referenz- oder Varianten-Humantransgene ersetzt wird. Im Überexpressionszweig werden die Referenz und die Variante menschlicher Proteine exogen in einer Vielzahl von Geweben angetrieben. In beiden Fällen kann jeder verschreibbare Phänotyp (z. B. Letalität, Augenmorphologie, Elektrophysiologie) unabhängig von der Krankheit des Interesses als Auslese verwendet werden. Die beobachteten Unterschiede zwischen Referenz- und Variantenallelen deuten auf einen variantenspezifischen Effekt und damit auf eine wahrscheinliche Pathogenität hin. Dieses Protokoll ermöglicht schnelle, in vivo Bewertungen von vermeintlichen menschlichen krankheitserregenden Varianten von Genen mit bekannten und unbekannten Funktionen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patienten mit seltenen Krankheiten unterziehen sich oft einer anstrengenden Reise, die als "diagnostische Odyssee" bezeichnet wird, um eine genaue Diagnose zu erhalten1. Es wird angenommen, dass die meisten seltenen Krankheiten einen starken genetischen Ursprung haben, was genetische/genomische Analysen zu kritischen Elementen der klinischen Aufarbeitung macht. Neben der Sequenzierung von Kandidatengenpanels und der Variationsvariation von Kopierzahlen auf Basis von chromosomalen Mikroarrays sind Die Technologien für die Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und die Vollgenomsequenzierung (WGS) in den letztenzehnJahren zu immer wertvolleren Werkzeugen geworden. 3. Derzeit liegt die diagnostische Rate zur Identifizierung einer bekannten pathogenen Variante in WES und WGS bei 25 % (höher in pädiatrischen Fällen)4,5. In den meisten Fällen, die nach dem klinischen WES/WGS nicht diagnostiziert werden, ist ein häufiges Problem, dass es viele Kandidatengene und Varianten gibt. Die Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert häufig neuartige oder ultraseltene Varianten in vielen Genen, und es ist eine Herausforderung, zu interpretieren, ob diese Varianten zu Krankheitsphänotypen beitragen. Obwohl beispielsweise die meisten Unsinn- oder Frameshift-Mutationen in Genen als Funktionsverlust -allele (LOF) aufgrund des unsinnig vermittelten Zerfalls des codierten Transkripts angesehen werden, entweichen abgeschnittene Mutationen, die in den letzten Exons gefunden wurden, diesem Prozess und können als gutartige oder Funktionsverstärkung (GOF) Allele6.

Darüber hinaus ist die Vorhersage der Auswirkungen eines Missense-Alleels eine gewaltige Aufgabe, da es zu einer Reihe verschiedener genetischer Szenarien führen kann, wie Sie erstmals von Herman Muller in den 1930er Jahren beschrieben wurden (d. h. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph oder isomorph)7 . Zahlreiche Silico-Programme und -Methoden wurden entwickelt, um die Pathogenität von Missense-Varianten auf der Grundlage der evolutionären Konservierung, der Art der Aminosäureänderung, der Position innerhalb eines funktionellen Bereichs, der Allelhäufigkeit in der allgemeinen Bevölkerung vorherzusagen, und andere Parameter8. Diese Programme sind jedoch keine umfassende Lösung, um das komplizierte Problem der Varianteninterpretation zu lösen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass fünf breit angelegte Varianten-Pathogenitätsvorhersagealgorithmen (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) sich auf Pathogenität von 80% der Zeit einigen 80% der Zeit8 . Bemerkenswert ist, dass selbst wenn alle Algorithmen zustimmen, sie eine falsche Vorhersage der Pathogenität bis zu 11% der Zeit zurückgeben. Dies führt nicht nur zu fehlerhaften klinischen Interpretation, sondern kann auch Forscher davon abhalten, neue Varianten zu verfolgen, indem sie sie fälschlicherweise als gutartig auflisten. Eine Möglichkeit, die aktuelle Beschränkung der Silico-Modellierung zu ergänzen, besteht darin, experimentelle Daten bereitzustellen, die die Wirkung der Variantenfunktion in vitro, ex vivo (z. B. kultivierte Zellen, Organoide) oder in vivo demonstrieren.

In vivo funktionelle Studien zu varianten seltenen Krankheiten in MO haben einzigartige Stärken13 und wurden von vielen Forschungsinitiativen für seltene Krankheiten auf der ganzen Welt übernommen, einschließlich des Undiagnosed Diseases Network (UDN) in den Vereinigten Staaten und Rare Krankheiten Modelle & Mechanismen (RDMM) Netzwerke in Kanada, Japan, Europa und Australien14. Zusätzlich zu diesen koordinierten Bemühungen, MO-Forscher in den Arbeitsablauf von Diagnosen seltener Krankheiten und mechanistischen Studien auf nationaler Ebene zu integrieren, haben eine Reihe individueller kollaborativer Studien zwischen klinischen und MO-Forschern zu der Entdeckung geführt. und Charakterisierung vieler neuer menschenkranker Gene und Varianten82,83,84.

Im UDN erhält ein zentralisiertes Model Organisms Screening Center (MOSC) Einreichungen von Kandidatengenen und Varianten mit einer Beschreibung des Zustands des Patienten und beurteilt, ob die Variante mit Informatikwerkzeugen und in vivo pathogen sein dürfte. Experimente. In Phase I (2015-2018) des UDN bestand das MOSC aus einem Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] und Zebrafish Core (University of Oregon), das gemeinsam an der Beurteilung von Fällen arbeitete. Mit Hilfe der Informatikanalyse und einer Reihe verschiedener experimenteller Strategien in Drosophila und Zebrafischen hat das MOSC bisher zur Diagnose von 132 Patienten beigetragen, die Identifizierung von 31 neuen Syndromen55, Entdeckung mehrerer neuer Krankheitsgene (z.B. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) und phänotypische Ausdehnung bekannter Krankheiten Gene (z. B. CACNA1A21, ACOX122).

Zusätzlich zu den Projekten innerhalb des UDN haben MOSC Drosophila Core-Forscher in Zusammenarbeit mit den Centers for Mendelian Genomics und anderen Initiativen (z.B. ANKLE223, TM2D3) zu neuen Entdeckungen von Krankheitsgenen beigetragen. 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) mit dem gleichen Satz von Informatik und Genetik Strategien, die für die UDN entwickelt wurden. Angesichts der Bedeutung von MO-Studien zur Diagnose seltener Krankheiten wurde das MOSC um einen C. elegans Core und einen zweiten Zebrafischkern (beide an der Washington University in St. Louis) für Phase II (2018-2022) des UDN erweitert.

Dieses Manuskript beschreibt ein in vivo funktionelles Studienprotokoll, das aktiv im UDN MOSC Drosophila Core verwendet wird, um festzustellen, ob Missense-Varianten funktionelle Folgen für das Protein von Interesse haben, indem transgene Fliegen, die menschliche Proteine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, MO-Forschern zu helfen, mit klinischen Forschungsgruppen zusammenzuarbeiten, um experimentelle Beweise dafür zu liefern, dass eine Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse funktionelle Folgen hat, wodurch die klinische Diagnose erleichtert wird. Dieses Protokoll ist am nützlichsten in einem Szenario, in dem ein Drosophila-Forscher von einem klinischen Forscher angesprochen wird, der einen Patienten mit einer seltenen Krankheit mit einer bestimmten Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse hat.

Dieses Protokoll kann in drei Elemente unterteilt werden: (1) Sammeln von Informationen, um die Wahrscheinlichkeit zu beurteilen, dass die Variante des Interesses für den Patientenphänotyp verantwortlich ist, und die Durchführbarkeit einer funktionellen Studie in Drosophila, (2) bestehende genetische Instrumente und die Etablierung neuer Instrumente und (3) die Durchführung funktioneller Studien in vivo. Das dritte Element kann weiter in zwei Unterelemente unterteilt werden, je nach der Bewertung der Funktion einer Interessenvariante (Rettungsexperiment oder überexpressionbasierte Strategien). Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll an viele Szenarien außerhalb der Forschung an seltenen monogenen Krankheiten angepasst und optimiert werden kann (z. B. häufige Krankheiten, Gen-Umwelt-Wechselwirkungen und pharmakologische/genetische Screens zur Identifizierung therapeutischer Ziele). Die Fähigkeit, die Funktionalität und Pathogenität von Varianten zu bestimmen, wird nicht nur dem Patienten von Interesse durch eine genaue molekulare Diagnose nützen, sondern auch breitere Auswirkungen auf die translationale und wissenschaftliche Grundlagenforschung haben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sammeln von menschlichen und MO-Informationen zu bewerten: Wahrscheinlichkeit einer Variante von Interesse verantwortlich für Krankheit Phänotypen und Machbarkeit von funktionellen Studien in Drosophila

  1. Führen Sie umfangreiche Datenbank- und Literaturrecherchen durch, um festzustellen, ob die spezifischen Gene und Varianten von Interesse gute Kandidaten sind, um den Phänotyp des Patienten von Interesse zu erklären. Sammeln Sie insbesondere die folgenden Informationen.
    1. Beurteilen Sie, ob das Gen von Interesse zuvor in andere genetische Störungen verwickelt war (phänotypische Expansion des bekannten Krankheitsgens) oder ob es sich um ein völlig neues Krankheitskandidatengen handelt [Genvariante von ungewisser Bedeutung (GVUS)].
    2. Bewerten Sie die Allelhäufigkeit der Variante des Interesses an Krankheits- oder Kontrollpopulationsdatenbanken.
    3. Bewerten Sie, ob es Kopiernummernvariationen (CNVs) gibt, die dieses Gen in Krankheits- oder Kontrollpopulationsdatenbanken enthalten.
    4. Bewerten Sie, was die orthologous Gene sind in verschiedenen MO-Arten einschließlich Maus, Zebrafisch, Drosophila, C. elegans, und Hefe, dann weiter untersuchen die bekannten Funktionen und Expressionsmuster dieser orthologen Gene.
    5. Beurteilen Sie, ob die Variante von Interesse in einer funktionellen Domäne des Proteins vorhanden ist und ob die Aminosäure von Interesse evolutionär konserviert wird.
      ANMERKUNG: Antworten auf diese fünf Fragen (Schritte 1.1.1-1.1.5) können durch den individuellen Zugriff auf eine Reihe von Human- und MO-Datenbanken oder über die Webressource MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (siehe Tabelle) erhalten. 1 für Online-Ressourcen)30, die in einem begleitenden Artikel31ausführlich beschrieben wird. Weitere Beispiele finden Sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse. Die Website der Monarch Initiative32 und Gene2Function33 bieten ebenfalls nützliche Informationen.
  2. Sammeln Sie zusätzliche Informationen, um weiter zu beurteilen, ob die Variante aus einer Proteinfunktion und Struktursicht ein guter Krankheitskandidat ist.
    1. Bewerten Sie, ob die Variante des Interesses auf der Grundlage von Silico-Vorhersagealgorithmen als schädlich vorhergesagt wird.
      ANMERKUNG: Variantenpathogenitätsalgorithmen wurden in den letzten 15 Jahren von vielen Forschungsgruppen entwickelt, und einige werden auch in den MARRVEL-Suchergebnissen angezeigt. Neuere Programme, einschließlich der beiden unten aufgeführten, kombinieren mehrere Varianten pathogenitätsrediction Algorithmen und Maschinelle Lernansätze, um eine Pathogenität serernizitätswert zu generieren. Weitere Informationen zu Variantenvorhersagealgorithmen und deren Leistung finden Sie unter Ghosh, et al.8. i) CADD (kombinierte annotationsabhängige Erschöpfung): integratives Anmerkungswerkzeug, das aus mehr als 60 genomischen Merkmalen besteht und Partituren für menschliche SNVs sowie kurze Einfügungen und Löschungen liefert11. (ii) REVEL (rare exome variant ensemble learner): kombiniert mehrere Varianten-Pathogenitätsalgorithmen (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP und phastCons) für alle möglichen menschlichen Missense-Varianten34.
    2. Bestimmen Sie, ob das menschliche Gen/Protein von Interesse oder seine MO-Orthologs nachweislich genetisch oder physisch mit Genen/Proteinen interagieren, die zuvor mit genetischen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden. Wenn ja, beurteilen Sie, ob der Patient von Interesse überlappende Phänotypen mit diesen Störungen aufweist.
      HINWEIS: Mehrere Werkzeuge wurden entwickelt, um genetische und Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage von MO-Publikationen sowie großangelegte Proteomik von mehreren Arten-Screens zu analysieren. STRING (Suchwerkzeug für wiederkehrende Fälle benachbarter Gene)35: eine Datenbank für bekannte und vorhergesagte Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es integriert genetische Interaktions- und Co-Expression-Datensätze sowie Text-Mining-Tools, um Gene und Proteine zu identifizieren, die in einer Vielzahl von Organismen zusammen funktionieren können. MIST (Molecular Interaction search tool)36: eine Datenbank, die genetische und Protein-Protein-Interaktionsdaten von genetischen Kern-MOs (Hefe, C. elegans, Drosophila, Zebrafisch, Frosch, Ratte, Maus) und Menschen integriert. Vorhersage von Wechselwirkungen, die aus orthologous Genen/Proteinen (Interlogs) abgeleitet werden, werden ebenfalls angezeigt.
    3. Bestimmen Sie, ob die 3D-Struktur des von Interesse interessierten Proteins gelöst oder modelliert wurde. Wenn dies der Zutun der Option ist, bestimmen Sie, wo die Variante von Interessen im Verhältnis zu wichtigen funktionalen Domänen zugeordnet ist.
      ANMERKUNG: Proteinstrukturen, die durch Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Kryo-Elektronenmikroskopie gelöst werden, finden sich in öffentlichen Datenbanken, einschließlich der PDB (Proteindatenbank) und der EMDatabank37. Obwohl es keine einzige Datenbank für vorhergesagte/modellierte Proteinstrukturen gibt, stehen Benutzern eine Reihe von Algorithmen (z. B. SWISS-MODEL38, Modeller39und Phyre240) zur Verfügung, um Proteinmodellierung durchzuführen.
  3. Kommunizieren Sie mit klinischen Mitarbeitern, um informationen aus den Informatikanalysen in den Abschnitten 1.1-1.2 zu diskutieren. Wenn klinische Mitarbeiter auch das Gefühl haben, dass die Variante und das Gen von Interesse gute Kandidaten sind, um die Phänotypen zu erklären, die beim Patienten gesehen werden, fahren Sie mit Abschnitt 2 fort. Wenn es spezifische Fragen über den Genotyp und Phänotyp des Patienten gibt, besprechen Sie diese mit den klinischen Mitarbeitern, bevor Sie vorankommen.
    ANMERKUNG: Wenn man der Meinung ist, dass die Variante von Interesse den Phänotyp des Interesses (z. B. identische Variante in hochfrequenter Kontrollpopulation) nicht erklären kann, besprechen Sie dies mit klinischen Mitarbeitern, um festzustellen, ob die Variante eine gute kandidaten, da es möglicherweise nicht die geeignete Expertise für die Interpretation klinischer Phänotypen gibt.

2. Sammeln vorhandener genetischer Werkzeuge und Einrichtung neuer Reagenzien zur Untersuchung einer spezifischen Variante von Interesse

ANMERKUNG: Sobald die Variante von Interesse festgestellt wurde, ist ein guter Kandidat, um experimentell zu verfolgen, Reagenzien zu sammeln oder zu erzeugen, um in vivo-Funktionsstudien durchzuführen. Für funktionelle Studien, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden einige wichtige Drosophila melanogaster Reagenzien benötigt: 1) vorgelagerte Aktivierungsequenz-regulierte menschliche cDNA-transgene Stämme, die die Referenz- oder Variantensequenz tragen, 2) ein Funktionsverlust Allel eines fliegenden Gens von Interesse und 3) eine GAL4-Linie, die für Rettungsexperimente verwendet werden kann.

  1. Erzeugung von UAS-Human cDNA-Konstrukten und transgenen Fliegen
    1. Identifizieren und erhalten Sie die entsprechenden menschlichen cDNA-Konstrukte. Viele Klone sind aus der MGC (Mammalian Gen Collection)43 erhältlich und können von ausgewählten Vendern erworben werden. Bei Genen, die alternativ gespleißt sind, prüfen Sie, welche Isoform cDNA der Verwendung von Ensembl oder RefSeq entspricht.
      HINWEIS: Viele cDNAs sind in rekombinator-vermittelten Klonsystem-kompatiblen Reagenzien44erhältlich, was den Subklonschritt vereinfacht. cDNAs können in einem "offenen (kein Stop-Codon)" oder "geschlossenen (mit endogenem oder künstlichem Stop-Codon)" Format kommen. Während offene Klone das C'-Tagging von Proteinen ermöglichen, die für biochemische (z. B. Western Blot) und zellbiologische (z. B. Immunflecken) Assays nützlich sind, um die Expression des Proteins von Interesse zu überwachen, kann es in einigen Fällen die Proteinfunktion beeinträchtigen.
    2. Unterklonen Sie den Referenz- und Varianten-cDNA in den transgenen Drosophila-Vektor. Verwenden Sie das mit dem C31-vermittelte Transgenesesystem, da dadurch die Referenz- und Varianten-cDNAs an der gleichen Stelle im Genom45integriert werden können. Für dieses Projekt verwendet der MOSC Drosophila Core routinemäßig den pGW-HA.attB Vektor46.
      ANMERKUNG: Wenn sich die humane cDNA in rekombinant endenden Klonsystem-kompatiblen Vektoren befindet (z. B. pDONR221, pENTR221), fahren Sie zu Abschnitt 2.1.4 über, in dem LR-Reaktionen zum Unterklonen der cDNAs in pGW-HA.attB erklärt werden.
      1. Befindet sich die humane cDNA nicht in einem rekombinanten Klonsystem-kompatiblen Plasmid, unterklonen Sie die humanen cDNAs mit standardmolekularen biologischen Techniken in einen Gateway-Eintragsvektor (ein Beispiel für ein solches Protokoll ist unten dokumentiert).
        1. Führen Sie eine Überhang-PCR durch, um attB1- und attB2-Arme einzuführen. Die Vorwärtsgrundierung sollte die attB1-Sequenz 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCC-3' haben, gefolgt von den ersten 22 Nukleotiden der Ziel-cDNA. Der Reverse Primer sollte die attB2-Sequenz 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' haben, gefolgt von der umgekehrten Ergänzung der letzten 25 Nukleotide der cDNA von Interesse. Schließen Sie das Stop-Codon der cDNA aus, fügen Sie dann ein C'-Tag hinzu, wenn es gewünscht ist, einen Klon zu "öffnen", oder fügen Sie ein Stop-Codon hinzu, um einen Klon zu "schließen".
        2. Bereiten Sie einen 100-Liter-PCR-Mix mit hoher Genauigkeit vor, der aus 50 l Hochtreue-PCR-Master-Mix, 36 l destilliertem Wasser, je 5 l von Vorwärts- und Rückwärtsprimern besteht, die in Schritt 2.1.2.1.1 auf 10 'M und 4 'L der Ziel-cDNA (150 ng/'L) verdünnt sind.
        3. Führen Sie PCR mit dem Standard-Mutagenese-Protokoll durch, um attB1- und attB2-Arme auf die cDNA von Interesse hinzuzufügen. Die Bedingungen variieren je nach Konstrukt und Varianten von Interesse.
        4. Isolieren Sie die Ziel-cDNA mit zusätzlichen Homologiearmen über Gelelektrophorese und Gelextraktion. Erstellen Sie 1% Agarose-Gel und führen Sie Die Elektrophorese mit Standardmethoden durch. Verbrauchen Sie das Band, das der Größe der cDNA plus der zusätzlichen Länge der Homologiearme entspricht. Extrahieren Sie DNA aus dem Gel durch Standardmethoden95. Kommerzielle Gel-Extraktions-Kits sind von mehreren Unternehmen erhältlich.
        5. Führen Sie eine In-vitro-Rekombinatoasenreaktion basierend auf dem rekombinanten Klonprotokoll entsprechend dem verwendeten System durch.
        6. Verwandeln Sie den BP-Reaktionsmix in chemisch kompetente E. coli-Zellen. Kompetente Zellen können intern hergestellt oder von kommerziellen Anbietern gekauft werden. Kultur die transformierten Zellen über Nacht auf einer LB-Platte mit geeigneten Antibiotika für die Kolonieauswahl. Am nächsten Tag wählen Sie mehrere Kolonien aus und wachsen sie über Nacht in unabhängigen flüssigen Kulturen an.
        7. Isolieren Sie die DNA von den Nachtkulturen durch Miniprep. Sanger sequenzieren die positiven Klone, um sicherzustellen, dass die cDNA die richtige Sequenz96hat. Bewahren Sie Zellen aus den Kulturen, die für die gewünschte Sequenz positiv sind, in 25% Glycerin, das bei -80 °C gespeichert ist.
    3. Führen Sie eine standortgesteuerte Mutagenese durch, um die Variante des Interesses in das Gateway-Plasmid mit der Referenz human cDNA97einzuführen. Ein detailliertes Protokoll für diese Methode finden Sie auf der Website des Anbieters48,49. Bestätigen Sie das Vorhandensein der Variante im mutierten Plasmid über Sanger-Sequenzierung des gesamten offenen Leserahmens (ORF), um sicherzustellen, dass durch diesen Mutageneseschritt keine zusätzlichen Varianten eingeführt werden.
    4. Subklonieren Sie die Referenz- und Varianten-Human-CDNAs im Spenderplasmid (Gateway-Plasmide mit attL1- und attL2-Standorten) über eine LR-Clonasereaktion in das transgene Plasmid (z.B. pGW-HA.attB mit attR1 und attR2-Standorten).
      ANMERKUNG: Es gibt UAS-C31-Vektoren, die für die konventionelle Beschränkung sonenzymbasierter Subklonierung (z. B. pUAST.attB50) entwickelt wurden, wenn es vorzuziehen ist, menschliche cDNAs über Restriktionsenzymmethoden zu unterklonen.
    5. Wählen Sie die Docking-Sites für die UAS-Human-cDNA-Transgene aus. Eine Reihe von Docking-Sites wurden von mehreren Laboratorien generiert und sind öffentlich verfügbar von Lagerzentren50,52,53.
      ANMERKUNG: Da es bequem ist, das menschliche Transgen auf einem Chromosom zu haben, das nicht den Fliegenortholog des Gens von Interesse enthält, wird empfohlen, eine zweite Chromosom-Docking-Stelle [VK37 (BDSC-Bestand #24872] zu verwenden, wenn sich der Fliegenortholog auf dem X befindet. , dritte oder vierte Chromosomen, und verwenden Sie eine dritte Chromosom-Docking-Stelle [VK33 (BDSC-Bestand #24871], wenn sich der Fliegenortholog auf dem zweiten Chromosom befindet.
    6. Injizieren Sie UAS-Human-cDNA-Konstrukte in Fliegen, die in ihrer Keimbahn C31-Integrase exdrücken (z. B. Vas-C31, nos-C31).
      HINWEIS: Mikroinjektionen können intern durchgeführt oder zur Transgenese an Kerneinrichtungen oder kommerzielle Einrichtungen gesendet werden. Detailliertes Protokoll zur Erzeugung transgener Fliegen finden Sie im zitierten Buch Kapitel51.
    7. Stellen Sie stabile transgene Stämme aus den injizierten Embryonen fest. Injizieren Sie 100-200 Embryonen pro Konstrukt94. In Abbildung 1Aist ein repräsentatives Kreuzungsschema für eine transgene Einfügung in eine zweite Chromosom-Dockingstelle (VK37) dargestellt. Siehe die zitierten Bücher54,55 für grundlegende Drosophila Genetik Informationen.
  2. Abrufen oder Generieren einer T2A-GAL4-Leitung, die rettungsbasierte Funktionstests ermöglicht (siehe Abbildung 2 und Abschnitt 3.1).
    HINWEIS: Diese Zeile dient zwei Zwecken. Erstens verhalten sich die meisten getesteten T2A-GAL4-Linien als starke LOF-Allele, indem sie wie ein Genfallen-Allel funktionieren. Zweitens fungieren T2A-GAL4-Linien als GAL4-Treiber, der die Expression von UAS-Konstrukten (z. B. UAS-GFP, UAS-Human cDNAs) unter den endogenen Regulationselementen des Gens von Interesse56,57 (Abbildung 2A-C) ermöglicht.
    1. Durchsuchen Sie öffentliche Bestandssammlungen nach verfügbaren T2A-GAL4-Linien, einschließlich des Drosophila Gene Disruption Project (GDP)58, in dem 1.000 T2A-GAL4-Leitungen generiert wurden59. Diese Stämme sind derzeit im Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) erhältlich und können sowohl über die BIP- als auch über die BDSC-Websites durchsucht werden.
    2. Wenn keine T2A-GAL4-Leitung für das fliegende Gen von Interesse verfügbar ist, prüfen Sie, ob eine geeignete codierte MiMIC-Leitung (Minos-vermittelte Integrationskassette) für die Umwandlung in eine T2A-GAL4-Leitung mittels rekombinantem Kassettenaustausch (RMCE) verfügbar ist. )60 (Abbildung 2A).
      ANMERKUNG: RMCE ermöglicht die Umwandlung von intronischen MiMIC-Elementen, die sich zwischen zwei Codierungsexons befinden, in eine T2A-GAL4-Leitung durch Mikroinjektion eines Spenderkonstrukts (ein Beispiel für ein Kreuzungsschema ist in Abbildung 1B)oder eine Reihe von Kreuze, wie im Detail beschrieben57,59.
    3. Wenn keine T2A-GAL4-Leitung verfügbar ist und keine entsprechende Codierung intronic MiMIC vorhanden ist, erkunden Sie die Möglichkeit, eine T2A-GAL4-Leitung über das CRIMIC-System (CRISPR-vermittelte Integrationskassette) zu erzeugen59.
      ANMERKUNG: Diese Methode verwendet CRISPR-vermittelte DNA-Spaltung und homologiegesteuerte Reparatur (HDR), um eine MiMIC-ähnliche Kassette in ein kodierendes Intron in einem Gen von Interesse zu integrieren.
    4. Wenn dem Gen von Interesse ein großes Intron (>150 bp) fehlt oder keine Introns enthalten sind, versuchen Sie, ein GAL4-Transgen mit dem CRISPR/Cas9-System mit HDR wiebeschrieben 20,61,62in das Fliegengen einzuschlagen.
      ANMERKUNG: Wenn die Erzeugung eines T2A-GAL4- oder GAL4-Knock-In-Alldasels schwierig ist, versuchen Sie, Rettungsexperimente mit diesen bereits vorhandenen Allelen oder RNAi-Linien und allgegenwärtigen oder gewebespezifischen GAL4-Treibern wiebeschrieben 92 (REF) durchzuführen.

3. Durchführung einer funktionellen Analyse der menschlichen Variante des Interesses in Vivo in Drosophila

ANMERKUNG: Führen Sie eine rettungsbasierte Analyse (Abschnitt 3.1) sowie Überexpressionsstudien (Abschnitt 3.2) mit den in Abschnitt 2 gesammelten oder generierten Werkzeugen durch, um die Folgen der Interessenvariante in vivo bei Drosophilazu bewerten. Erwägen Sie, beide Ansätze zu verwenden, da die beiden einander ergänzen.

  1. Durchführung funktionaler Analysen durch Rettungsexperimente
    notiz: Heterologe Rettungsexperimente inDrosophilaUnter Verwendung menschlicher Proteine bestimmen Sie, ob die molekulare Funktion der beiden orthologen Gene über 500 Millionen Jahre evolutionär konserviert wurde. Sie bewerten auch die Funktion der Variante im Kontext des menschlichen Proteins63. Obwohl eine systematische Analyse, die Hunderte von Genpaaren untersucht, nicht berichtet wurde, sind mehrere Dutzend menschliche und Säugetiergene (z. B. Mausgene in der Lage, die FunktionDrosophilaGene13.
    1. Bestimmen Sie im Rescue-basierten Ansatz zunächst, ob es offensichtliche, brennbare und reproduzierbare Phänotypen in LOF-Mutanten im Fliegenortholog gibt, bevor Sie die Funktionen der Varianten bewerten.
      HINWEIS: Frühere Literatur über das Fly-Gen ist ein guter Ort, um zuerst Daten mine, und es kann mit Datenbanken wie FlyBase und PubMed gefunden werden. Zusätzliche Datenbanken wie MARRVEL, Monarch Initiative und Gene2Funcion sind ebenfalls nützlich, um diese Informationen zu sammeln.
    2. Führen Sie eine globale Untersuchung von verschreibbaren Phänotypen bei homozygoten und hemizygoten (T2A-GAL4-Allel über einem molekular definierten Chromosomenmangeltiere durch, insbesondere wenn das T2A-GAL4-Allel die erste Mutation ist, die für ein bestimmtes Gen charakterisiert wird. Bewerten Sie Phänotypen wie Letalität, Sterilität, Langlebigkeit, morphologische (z. B. Größe und Morphologie des Auges) und Verhalten (z. B. Balz,Flug,Klettern und Bang-Empfindlichkeitsdefekte).
      ANMERKUNG: Wenn von diesem Primärbild keine hauptweisen Phänotypen identifiziert werden, können subtilere Phänotypen wie neurologische Defekte, die durch elektrophysiologische Aufzeichnungen gemessen werden, verwendet werden, wenn sie hoch reproduzierbar und spezifisch sind. Als Beispiel werden funktionelle Studien mit Elektroretinogramm (ERG) in Schritt 3.2.3 beschrieben. Wenn es nicht gelingt, einen versetzbaren Phänotyp zu erkennen, wechseln Sie zu Abschnitt 3.2, und führen Sie die überexpressionbasierte Funktionsstudie durch.
    3. Sobald ein versetzbarer Phänotyp in der LOF-Mutation identifiziert wurde, testen Sie, ob die Referenz-Human-cDNA die Funktion des Fliegenorthologs ersetzen kann, indem sie versucht, menschliche cDNA zur Rettung der mutierten Fliegenlinie zu verwenden. Der hier durchzuführende phäotypische Assay hängt von den Ergebnissen aus Schritt 3.1.2 ab und ist spezifisch für das untersuchte Gen.
      ANMERKUNG: Wenn die "Humanisierung" des Fliegengens erfolgreich ist, gibt es jetzt eine Plattform, um die Effizienz der Rettung für die Variante des Interesses im Vergleich zum Referenz-Gegenstück zu vergleichen. Die Rettung mit Referenz menschliche cDNA gesehen muss nicht perfekt sein. Die teilweise Rettung des fliegenmutierten Phänotyps mit einer menschlichen cDNA bietet immer noch einen Bezugspunkt für vergleichende Studien mit der Variante des humanen cDNA-Stamms.
    4. Vergleichen Sie mit dem in Schritt 3.1.2 ausgewählten Assay-System die beobachtete Rettung mit dem Referenz-Human-cDNA-Wert auf die mit der Variante Human cDNA beobachtete Rettung, um festzustellen, ob die Variante des Interesses Auswirkungen auf das Gen von Interesse hat.
      ANMERKUNG: Wenn die Variante human cDNA schlechter abschneidet als das Referenzallel, deutet dies darauf hin, dass die Variante von Interesse schädlich für die Proteinfunktion ist. Wenn die Variante und der Bezug nicht funktionell unterschieden werden können, dann kann das Allel ein Isomorph sein (eine Variante, die die Proteinfunktion nicht beeinflusst) oder 2) der Test ist nicht empfindlich genug, um subtile Unterschiede zu erkennen.
    5. Wenn sich herausstellt, dass es sich bei der Variante um ein schädliches Allel handelt, dann bewerten Sie die Expression und intrazelluläre Lokalisierung der Referenz- und Variantenproteine von Interesse in vivo über Western Blot, Immunfluoreszenzfärbung oder andere Methoden93.
      HINWEIS: Wenn die UAS-Human cDNA aus einem offenen Klon in einem pGW-HA.attB-Vektor erzeugt wird, verwenden Sie einen Anti-HA-Antikörper, um diese biochemischen und zellulären Assays durchzuführen. Wenn es sich bei dem ursprünglichen Klon um einen geschlossenen Klon handelt, prüfen Sie, ob kommerzielle Antikörper gegen die menschlichen Proteine für diese Assays verwendet werden können. Ein Unterschied in den Expressionsniveaus und der intrazellulären Lokalisierung kann zeigen, wie sich die Variante des Interesses auf die Proteinfunktion auswirkt.
  2. Durchführung funktionaler Analysen durch Überexpressionsstudien
    ANMERKUNG: Ubiquitous oder gewebespezifische Überexpression menschlicher cDNAs in ansonsten Wildtypfliegen können Informationen liefern, die die in Abschnitt 3.1 erörterten Rettungsexperimente ergänzen. Während rettungsbasierte Assays in erster Linie dazu bestimmt sind, LOF-Varianten (amorph, hypomoophisch) zu erkennen, können überexpressionbasierte Assays auch Gain-of-Function (GOF)-Varianten aufdecken, die schwieriger zu beurteilen sind (hypermorph, antimorph, neomorph).
    1. Wählen Sie einen Satz von GAL4-Treibern aus, um die menschlichen cDNAs von Interesse zu überprimiert. Eine Reihe von allgegenwärtigen und gewebe-/stufenspezifischen GAL4-Treibern sind in öffentlichen Lagerzentren (z. B. BDSC) erhältlich, von denen einige häufiger als andere verwendet werden. Konzentrieren Sie sich zunächst auf allgegenwärtige Treiber und leicht verserbare Phänotypen (Letalität, Sterilität, morphologische Phänotypen), dann gehen Sie zu gewebespezifischen Treibern und spezifischeren Phänotypen über.
      HINWEIS: Validieren Sie den Ausdruck von GAL4-Treibern mit einer Reporterzeile (z. B. UAS-GFP), um Expressionsmuster vor der Verwendung in den Experimenten zu bestätigen.
    2. Geben Sie die Referenz- und Variante der menschlichen cDNAs mit demselben Treiber unter der gleichen Bedingung (z. B. Temperatur) an, indem Sie 3-5 jungfräuliche Weibchen aus der GAL4-Linie (z. B. ey-GAL4 für die imaginale Scheibenexpression des Auges) mit 3-5 männlichen Fliegen aus den UAS-Linien [z. B. UAS-TBX2(+) oder UAS-TBX2(p.R305H) für das in Abschnitt 4.2 gezeigte Beispiel in einer einzigen Durchstechflasche.
      1. Übertragen Sie die Kreuze alle 2-3 Tage, um viele Tiere aus einem einzigen Kreuz zu schließen.
    3. Untersuchen Sie die Nachkommenschaft und entdecken Sie Unterschiede zwischen den Referenz- und Variantenstämmen (z. B. Augenmorphologie) unter einem Seziermikroskop. Bildnis die Fliegen mit einer Kamera, die an einem Seziermikroskop befestigt ist, um phänotyp zu dokumentieren.
      ANMERKUNG: Wenn ein Phänotyp nur in der Referenz, aber nicht in der Variantenlinie zu sehen ist, kann die Variante ein amorphes oder ein starkes hypomorphes Allel sein. Wenn der Phänotyp in beiden Genotypen gesehen wird, aber der Verweis einen stärkeren Defekt verursacht, dann kann die Variante ein leicht bis schwaches hypomorphes Allel sein. Wenn die Referenz keinen Phänotyp oder nur einen schwachen Phänotyp aufweist, aber die Variante einen starken Defekt aufweist, kann die Variante ein GOF-Allel sein.
    4. Wenn ein Phänotyp unter Standardkulturbedingungen (RT oder bei 25 °C) nicht gesehen wird, dann stellen Sie die Kreuze auf unterschiedliche Temperaturen von 18-29 °C, da das UAS/GAL4-System bekanntermaßen temperaturempfindlichist 64,65). Typischerweise ist die Expression von UAS-Transgenes bei höheren Temperaturen höher.
  3. Führen Sie zusätzliche funktionelle Studien im Zusammenhang mit den Genen und Proteinen von Interesse.
    notiz: Neben der Untersuchung allgemeiner Defekte kann ein Assay-System ausgewählt werden, um molekulare Funktionen des Gens und der Variante zu untersuchen. In einem Beispiel, das in den repräsentativen Ergebnissen (TBX2ERG-Aufnahmen verwendet wurden, um Die Wirkungen der Variante auf die Photorezeptorfunktion zu bestimmen, da das Fliegengen von Interesse (bifid) im Rahmen der Entwicklung visueller Systeme eingehend untersucht worden. Detaillierte Protokolle für ERG inDrosophilafinden Sie wie zuvor veröffentlicht66,67,68.
    1. Generieren Sie Fliegen, um auf Funktionsfehler im visuellen System zu testen. Kreuzvirgin Weibchen aus der Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 Linie zu Männchen mit Referenz oder Variante UAS-Human cDNA Transgenes, um die menschlichen Proteine von Interesse in den R1-R6 Photorezeptoren auszudrücken.
      ANMERKUNG: Kreuz3-5 jungfräuliche Weibchen zu 3-5 männlichen Fliegen in einer einzigen Durchstechflasche und übertragen Sie die Kreuze alle 2-3 Tage, um viele Tiere aus einem einzigen Kreuz zu schließen. Alle Kreuze müssen in einem Inkubator aufbewahrt werden, der auf der Versuchstemperatur eingestellt ist, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
    2. Sobald die Fliegen zu schließen beginnen (bei 25 °C, 10 Tage nach dem Setzen des ersten Kreuzes), sammeln Sie die Nachkommen (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) in frische Fläschchen und legen Sie sie wieder in den Inkubator, der bei der Experimentellen Temperatur für weitere 3 Tage eingestellt ist, damit das visuelle System reifen kann.
      HINWEIS: Obwohl ERG auf 1-2 Tage alten Fliegen durchgeführt werden kann, können neu geschlossene Fliegen große Schwankungen in ihrem ERG-Signal haben. Wenn es gewünscht wird, einen altersabhängigen Phänotyp zu untersuchen, können diese Fliegen mehrere Wochen lang gereift werden, solange sie regelmäßig (z. B. alle 5 Tage) in eine neue Durchstechflasche übertragen werden, um nicht in nassen Lebensmitteln zu ertrinken.
    3. Bereiten Sie die Fliegen für die ERG-Aufnahme vor, indem Sie die Fliegen zunächst mit CO2 bezähnen oder in eine Durchstechflasche auf Eis legen. Kleben Sie vorsichtig eine Seite der Fliege auf ein Glasmikroskop-Dia, um sie zu immobilisieren.
      HINWEIS: Mehrere Referenz- und Variantenfliegen können auf eine einzelne Folie geklebt werden. Platzieren Sie alle Fliegen in etwa der gleichen Ausrichtung, wobei ein Auge für die Aufnahmeelektrode zugänglich ist. Achten Sie darauf, nicht Kleber auf das Auge zu bekommen und die Proboscis frei zu lassen.
    4. Bereiten Sie die Aufnahme- und Referenzelektroden vor. Legen Sie eine 1,2 mm Glaskapillare in einen Nadelzieher und aktivieren Sie sie. Brechen Sie das Kapillarrohr, um zwei scharf verjüngte Elektroden zu erhalten. Die resultierenden Elektroden sollten hohl sein und einen Enddurchmesser von <0,5 mm aufweisen.
    5. Füllen Sie die Kapillaren mit einer Salinelösung (100 mM NaCl), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schieben Sie die Glaskapillaren über die Silberdrahtelektroden (sowohl die Aufnahmeelektrode als auch die Referenzelektrode, siehe Abbildung 4) und sichern Sie die Kapillaren an Ort und Stelle.
    6. Konfigurieren Sie den Stimulator und Verstärker. Eine detaillierte Aufstellung finden Sie in Lauwers, et al.67. Die Einrichtung von UDN Drosophila MOSC besteht aus Geräten, die im Materialbereich aufgeführt sind.
      1. Stellen Sie den Verstärker auf 0,1 Hz-Hochpassfilter, 300 Hz-Tiefpassfilter und 100 Gain ein.
      2. Stellen Sie den Stimulator auf 1 s Periode, 500 ms Pulsbreite, 500 ms Pulsverzögerung, Laufmodus und 7 Amp ein.
      3. Bereiten Sie die Lichtquelle für die Photostimulation vor. Verwenden Sie eine Halogenlichtquelle, um die Fliegenphotorezeptoren zu aktivieren.
      4. Bereiten Sie die Aufzeichnungssoftware auf einem Computer vor, der mit dem ERG-Setup verbunden ist. Erstellen Sie ein Stimulationsprotokoll mit Erfassungsmodell "Ereignisse fester Länge" und 20 s Dauer.
    7. Akklimatisieren Sie die Fliegen, um Dunkelheit zu vollenden, bevor Sie ERG-Aufnahmen einführen. Platzieren Sie die Fliegen mindestens 10 min in völliger Dunkelheit, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
      HINWEIS: Da Fliegen rotes Licht nicht erkennen können, verwenden Sie eine rote Lichtquelle während der Periode der dunklen Gewöhnung.
    8. Legen Sie die Folie mit den Fliegen auf das Aufnahmegerät und bewegen Sie die Mikromanipulatoren, die die Referenz- und Aufzeichnungselektroden tragen, an einen Punkt, der nahe an der Fliege des Interesses auf der Folie liegt. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode und legen Sie die Referenzelektrode vorsichtig in den Thorax der Fliege (durchdringen Sie die Nagelhaut). Sobald die Referenzelektrode stabil eingesetzt wurde, legen Sie die Aufnahmeelektrode auf die Oberfläche des Auges.
      ANMERKUNG: Die genaue Position dieser Referenzelektrode hat keinen großen Einfluss auf das ERG-Signal. Die Aufnahmeelektrode sollte an der Oberfläche des Auges platziert werden, da ERG eine Feldpotentialaufzeichnung und keine intrazelluläre Aufzeichnung ist. Die richtige Druckmenge, die auf die Aufnahmeelektrode ausgeübt wird, verursacht ein kleines Grübchen, ohne in das Auge einzudringen.
    9. Schalten Sie alle Lichter für weitere 3 min aus, um die Fliegen in die dunkle Umgebung zu akklimatisieren.
    10. Richten Sie die Aufnahmesoftware ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Signals. Wenn Sie eine Halogen-Lichtquelle mit manuellem Verschluss verwenden, schalten Sie die Lichtquelle mit geschlossenem Verschluss ein. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Signals.
    11. Setzen Sie die Fliegenaugen dem Licht aus, indem Sie den Verschluss für die Dauer von 20 s eines einzelnen Laufs alle 1 s öffnen und schließen.
      HINWEIS: Das Ein-/Ausschalten der Halogenlichtquelle kann manuell gesteuert oder so programmiert werden, dass es mit einer weißen LED-Lichtquelle automatisiert wird. Robustere und zuverlässigere ERG kann durch die Verwendung einer Halogenlichtquelle im Vergleich zu einer weißen Licht-LED erreicht werden, wahrscheinlich aufgrund des breiteren Lichtspektrums, das von der Halogenlichtquelle emittiert wird.
    12. Zeichnen Sie ERGs von allen Fliegen auf, die auf der Glasrutsche montiert sind. Führen Sie ERGs von 15 Fliegen pro Genotyp pro Zustand durch.
      HINWEIS: Einige Parameter, die geändert werden können, um eine Bedingung zu finden, die robuste Unterschiede zwischen Referenz- und Varianten-cDNAs zeigt, können Temperatur-, Alters- oder Umgebungsbedingungen (z. B. im Hell-Dunkel-Zyklus oder bei konstantem Licht/Dunkelheit) aufweisen.
    13. Datenanalyse durchführen: Vergleichen Sie die ERGs aus referenzieren, variante und steuert, um festzustellen, ob Unterschiede bestehen. Bewerten Sie die ERG-Daten für Veränderungen bei Transienten, Depolorisierung, Off-Transienten und Repolarisation69 (Abbildung 4B).
      ANMERKUNG: Depolarisation und Repolarisation spiegeln die Aktivierung und Inaktivierung der Phototransduktionskaskade innerhalb von Photorezeptoren wider, während On- und Off-Transienten Messungen der Aktivitäten postsynaptischer Zellen sind, die Signale von photorezeptoren. Verminderte Amplitude und veränderte Kinetik der Repolarisation sind häufig bei Defekten mit Photorezeptorfunktion und Gesundheit verbunden, während Defekte an On- und Off-Transienten bei Mutanten mit defekter Synapsenentwicklung, Funktion oder Wartung gefunden werden. 70.
    14. Bei der Identifizierung von Unterschieden in ERG-Phänotypen mit Überexpression von Referenz- vs. Varianten menschlicher cDNAs bestimmen Sie, ob dieser elektrophysiologische Phänotyp mit strukturellen und ultrastrukturellen Defekten in Photorezeptoren und deren durch histologische Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie.
      ANMERKUNG: Weitere Diskussionen über die Interpretation von ERG-Defekten und struktur-/ultrastrukturelle Analysen wurden bereits beschrieben69.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funktionelle Studie von de novo Missense Variant in EBF3 Verbunden mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen
Bei einem 7-jährigen Mann mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen wie Hypotonie, Ataxie, globaler Entwicklungsverzögerung und ausdrucksstarker Sprachstörung, Ärzte und Humangenetiker am National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identifizierte eine de novo missense Variante (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, ei...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentelle Studien mit Drosophila melanogaster bieten ein robustes Assay-System, um die Folgen von krankheitsassoziierten menschlichen Varianten zu bewerten. Dies ist aufgrund der großen Menge an Wissen und vielfältigen genetischen Werkzeugen, die von vielen Forschern im Fliegenfeld im letzten Jahrhundert89erzeugt wurden. Wie jedes andere experimentelle System ist es jedoch wichtig, die Vorbehalte und Grenzen anzuerkennen, die es gibt.

Vorbehalte im...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Jose Salazar, Julia Wang und Dr. Karen Schulze für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir würdigen Drs. Ning Liu und Xi Luo für die funktionale Charakterisierung der hier diskutierten TBX2-Varianten. Das Screening Center für nicht diagnostizierte Krankheiten wurde vom Common Fund (U54 NS093793) des National Institutes of Health (NIH) unterstützt. H. T. C. wurde weiter unterstützt durch die NIH[CNCDP-K12 und NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) und den NIH Director es Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. wurde von der Simons Foundation (SFARI Award: 368479) unterstützt. S. Y. wurde weiter unterstützt durch das NIH (R01 DC014932), die Simons Foundation (SFARI Award: 368479), die Alzheimer es Association (New Investigator Research Grant: 15-364099), Den Naman Family Fund for Basic Research und Caroline Wiess Law Fund for Research in Molekulare Medizin. Die konfokale Mikroskopie am BCM wird teilweise durch den NIH-Zuschuss U54HD083092 an das Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Drosophila Stämme für die Transgenese von UAS-humanen cDNAs
Injektionsstämme für die Transgenese (D. melanogaster)BDSC#24871Spezifisches Reagenz: VK33 (3. Chromosom) Injektionsleitung
Injektionsstämme für die Transgenese (D. melanogaster)BDSC#24872Spezifisches Reagenz: VK37 (2. Chromosom) Injektionslinie
Plasmid DNA
KlonierungsvektorThermo Fisher#12536-017Spezifisches Reagenz: pDONR221
Drosophila Transgenese-VektorGeschenk von Drs. Johannes Bischof und Dr. Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)Spezifisches Reagenz: pGW-HA.attB
Molekularbiologische Kits und Reagenzien
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Spezifisches Reagenz: Agarose (molekularbiologische Qualität)
Chemisch kompetente Zellen (E. coli)Thermo Fisher#18265017Spezifisches Reagenz: DH5α
DNA-Gel-ExtraktionskitThermo Fisher#K210012Spezifisches Reagenz: PureLink Gel-Extraktionskit
DNA-Isolations- und AufreinigungskitQiagen#27104Spezifisches Reagenz: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity PolymeraseNEB#M0491Spezifisches Reagenz: Q5 Polymerase-Kit
Rekombinase-vermitteltes KlonierungssystemThermo Fisher#11789020Spezifisches Reagenz: Gateway BP Clonase Kit
Rekombinase vermitteltes KlonierungssystemThermo Fisher#11791100Spezifisches Reagenz: Gateway LR Clonase II Enzym Kit
Site Directed MutageneseKit Agilent#200523Spezifisches Reagenz: Quick Change II Mutagenese Kit
Elektroretinogramm Rig zugehörige Ausrüstung
ERG AnalyseMolecular DevicesN/ASpezifisches Reagenz: Axon pCLAMP 10 Datensoftwarepaket
ERG DatenerfassungLabX#R150358Spezifisches Reagenz: ISO-DAM Isolierter biologischer Verstärker
ERG-StimulatorAstro-Med#S48Spezifisches Reagenz: Rechteckpulsstimulator

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870(2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880(2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225(2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688(2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041(2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905(2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327(2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135(2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189(2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62(2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21(2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097(2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743(2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143(2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Funktioneller Drosophila AssayAnalyse humaner VariantenRescue berexpressions ExperimenteElektroretinogramm AufzeichnungGenerierung genetischer WerkzeugeMARRVEL WebressourceIn vivo BewertungForschung zu seltenen ErkrankungenScreening von Modellorganismenph notypische Analyse

Verwandte Artikel